甲拌磷人工抗原的合成及多克隆抗体制备

以五硫化二磷与无水乙醇为原料,首先制得硫化物中间体,再添加甲醛和2-巯基乙醇进行反应,得到甲拌磷半抗原.在DMAP作为催化剂的条件下,甲拌磷半抗原与丁二酸酐反应,得到甲拌磷半抗原的衍生物.通过碳二亚胺法将甲拌磷半抗原衍生物分别与牛血清白蛋白(BSA)和鸡卵清白蛋白(OVA)共价偶联,得到免疫抗原和包被抗原.用免疫抗原免疫兔子获得了高效价的多克隆抗体,抗血清效价达到了1∶50 000.通过试验确立甲拌磷标准曲线,检测限为6.383μg/L,检测线性范围为6.383～10 000μg/L.     

斑蝥素人工抗原的制备与初步鉴定

【目的】合成并鉴定斑蝥素人工抗原,为建立斑蝥素的酶联免疫分析方法提供依据。【方法】对斑蝥素进行化学修饰,引入羟基合成N-羟乙基斑蝥酰亚胺(BY),并经MS、NMR、IR法对其结构进行鉴定。进一步经琥珀酸酐法合成琥珀酸酯(BYS)并纯化,在此基础上,分别采用混合酸酐法和碳二亚胺法将半抗原与载体蛋白偶联,合成斑蝥素的人工抗原(BYS-HS-BSA、BYS-TY-BSA、BYS-HS-OVA、BYS-TY-OVA),并经MS、IR法对人工抗原进行定性鉴定。免疫原免疫兔子获得抗斑蝥素多克隆抗体并测定其效价。【结果】成功合成了一种斑蝥素半抗原,与载体蛋白BSA、OVA偶联后得到免疫原(BYS-HS-BSA、BYS-TY-BSA)和包被原(BYS-HS-OVA、BYS-TY-OVA),免疫新西兰大白兔获得多克隆抗体,效价分别为8 000和16 000。【结论】初步合成并鉴定了斑蝥素人工抗原,在设计合成斑蝥素的半抗原时不能破坏其关键的环结构。     

氯霉素多克隆抗体的制备及免疫活性研究

建立氯霉素的免疫分析方法,由氯霉素原药与丁二酸酐反应合成了氯霉素两种半抗原(CAP-HS1、CAP-HS2),分别纯化后经质谱法(MS)分析鉴定结构.纯化的半抗原与牛血清蛋白(BSA)以碳二亚胺法偶联得到人工抗原.将免疫抗原分别免疫兔子获得了相应抗体.当包被抗原的浓度为10μg·mL-1时,抗CAP-HS1和CAP-HS2的冻干粉效价分别为8.39×106和6.55×104(OD490nm=1.0).研究了抗原抗体反应的亲和力和竞争抑制能力,其中抗CAP-HS1抗体适合免疫分析,检测线性范围为0.2～100 ng·mL-1,最低检测限IC20为0.239 ng·mL-1,抗CAP-HS1抗体对各类似物如甲砜霉素、氟甲砜霉素的交叉反应率分别为0.025%和0.166%,对其他类抗生素的交叉反应率＜2×10-5.     

荧光假单胞菌灭活疫苗对草鱼的免疫保护效应

从患病草鱼分离出荧光假单胞菌,制备甲醛灭活全菌苗、高温灭活全菌苗、可溶性蛋白及外膜蛋白疫苗。经腹腔注射草鱼后,研究这些疫苗的免疫保护作用。免疫后于不同时间采集血液,用试管凝集法测定血清抗体滴度。实验结果表明,上述疫苗均诱导较强的免疫应答。抗体峰值出现的先后顺序依次为可溶性蛋白组、外膜蛋白组、甲醛灭活全菌苗组及高温灭活全菌苗组;而抗体峰值从高到低依次为甲醛灭活全菌苗组、高温灭活全菌苗组、可溶性蛋白组及外膜蛋白组。细菌攻毒实验显示,4种疫苗免疫后均产生明显的保护效应。其中,高温灭活全菌苗相对保护率最高,达到75%,甲醛灭活全菌苗、外膜蛋白以及可溶性蛋白的相对保护率分别为70%,70%和65%,说明这些疫苗均可用于预防草鱼赤皮病。此外,实验亦显示血清抗体水平与疫苗保护效应并不完全一致。     

荧光假单胞菌灭活疫苗对草鱼的免疫保护效应

从患病草鱼分离出荧光假单胞菌,制备甲醛灭活全菌苗、高温灭活全菌苗、可溶性蛋白及外膜蛋白疫苗.经腹腔注射草鱼后,研究这些疫苗的免疫保护作用.免疫后于不同时间采集血液,用试管凝集法测定血清抗体滴度.实验结果表明,上述疫苗均诱导较强的免疫应答.抗体峰值出现的先后顺序依次为可溶性蛋白组、外膜蛋白组、甲醛灭活全菌苗组及高温灭活全菌苗组;而抗体峰值从高到低依次为甲醛灭活全菌苗组、高温灭活全菌苗组、可溶性蛋白组及外膜蛋白组.细菌攻毒实验显示,4种疫苗免疫后均产生明显的保护效应.其中,高温灭活全菌苗相对保护率最高,达到75%,甲醛灭活全菌苗、外膜蛋白以及可溶性蛋白的相对保护率分别为70%,70%和65%,说明这些疫苗均可用于预防草鱼赤皮病.此外,实验亦显示血清抗体水平与疫苗保护效应并不完全一致.     

杠柳新苷T人工抗原合成及多克隆抗体制备

【目的】合成并鉴定杠柳新苷T人工抗原,制备多克隆抗体,为进一步开展杠柳新苷类化合物作用机理的研究奠定基础。【方法】以杠柳新苷T为起始反应物,与丁二酸酐反应生成杠柳新苷T的衍生物(半抗原),采用HPLC-ELSD、MS和NMR对衍生物的结构进行鉴定;将半抗原与载体蛋白(BSA和OVA)进行偶联,采用紫外图谱对人工抗原进行鉴定,并采用2,4,6-三硝基苯磺酸(TNBS)法测定结合比;以乳化的人工抗原免疫8周龄雌性Balb/c小鼠获得杠柳新苷T的多克隆抗体,并测定其效价。【结果】成功合成杠柳新苷T的半抗原和人工抗原,半抗原和载体蛋白(BSA和OVA)的结合比分别为5∶1和7∶1。免疫小鼠后产生针对杠柳新苷T的特异性抗体,其效价为1∶1 600,对杠柳新苷T的半数抑制浓度(IC50)为12.429 4μg/mL。【结论】制备了杠柳新苷T的多克隆抗体,可以用于杠柳新苷T作用靶标的定位研究。     

呋喃它酮代谢物人工抗原的合成及抗体的制备

【目的】建立高灵敏度的呋喃它酮酶联免疫检测方法.【方法】以戊二醛法将呋喃它酮代谢物5-甲基吗啉-3-氨基-2-唑烷基酮(AMOZ)与牛血清白蛋白(BSA)和卵清白蛋白(OVA)偶联,再由NaBH4还原西佛碱得到结构稳定的免疫原AMOZ-BSA和AMOZ-OVA;用对醛基苯甲酸(CPA)对AMOZ进行衍生化,得到衍生物CPAMOZ,由质谱鉴定,经N-羟基琥珀酰亚胺活化酯法将CPAMOZ与BSA和OVA偶联得到免疫原CPAMOZ-BSA和包被原CPAMOZ-OVA.经紫外扫描鉴定表明人工抗原合成成功.免疫Balb/c小鼠,ic-ELISA方法测定鼠血清多克隆抗体对AMOZ和NPAMOZ的特异性.【结果和结论】结果显示CPAMOZ-BSA免疫制备的抗体对NPAMOZ有良好的特异性.抗体效价为1∶32×104,对NPAMOZ的半抑制质量浓度为4.53 ng·mL-1;抗血清与CPAMOZ、AMOZ及呋喃它酮的交叉反应率为78.6%、1.5%及4.6%;与其他3种硝基呋喃类原药及其代谢物对硝基苯甲醛、对醛基苯甲酸等结构相似物的交叉反应均小于0.01%.     

Cd2+人工抗原的制备及其抗体特性

用异硫氰酸苄基乙二胺四乙酸(ITCBE)鳌合Cd2+合成Cd-ITCBE半抗原,异硫氰酯法制备免疫抗原Cd-ITCBE-BSA,紫外分光光度法(UV)、SDS-PAGE和电感耦合等离子体质谱法(ICP-MS)进行鉴定;用Cd-ITCBE-BSA免疫Balb/C小鼠,间接ELISA测定多抗血清(pAb)效价,阻断ELISA鉴定其敏感性,交叉反应试验鉴定其特异性。结果表明,Cd-ITCBE-BSA偶联成功,Cd-ITCBE-BSA中BSA和Cd2+的含量分别为7.1g/L和191.7 mg/L;间接ELISA效价达到1∶(5.12×104),阻断ELISA检测Cd-EDTA的IC50为26.9μg/L,除与Hg-EDTA具有较强交叉反应外,与EDTA及其他金属离子鳌和物无交叉反应,获得高效价、敏感、特异的Cd2+pAb,为Cd2+残留免疫学检测方法的建立奠定基础。     

莫能菌素人工抗原合成及其多克隆抗体的制备

通过莫能菌素羟基与琥珀酸酐反应,合成半抗原莫能菌素-琥珀酰半酯,采用混合酸酐法将其与载体蛋白BSA偶联制备人工抗原,以此人工抗原免疫新西兰大白兔获得多克隆抗体.试验结果表明,莫能菌素结合抗原免疫家兔制备的抗体对莫能菌素具有很高的特异性、亲合性和选择性.用此抗体建立的莫能菌素间接竞争酶联免疫吸附检测方法的标准工作曲线I50值为37.9 ng/ml,最低检测限(I10)为2.09 ng/ml.     

基于3 种载体蛋白的莱克多巴胺抗原的合成与检测

为制备高效莱克多巴胺(Ractopamine,RAC)抗体,将人工合成的RAC-琥珀酸酯半抗原与3种载体蛋白(BSA、OVA和KLH)偶联合成人工抗原,采用紫外光谱扫描、测定偶联比和ESI-MS进行鉴定;通过免疫小鼠获得抗血清,采用ELISA比较其效价,对3种人工抗原的免疫原性进行评定,结果显示3种抗血清效价为4000~32000,表明合成的3种人工抗原都具有免疫原性,其中以KLH为载体蛋白的抗原的免疫效果较好,可用于制备高效RAC抗体。     

玉米赤霉醇完全抗原的制备及质量鉴定

旨在合成玉米赤霉醇(ZER)人工抗原,并用其免疫小鼠以获得含高滴度ZER多克隆抗体的小鼠血清,为ZER单克隆抗体的制备奠定基础。改造ZER第16位上的羟基,合成半抗原ZER-16-羧丙基丁醚,然后分别采用混合酸酐法和碳二亚胺(EDC)法将改造后的半抗原与载体蛋白BSA或OVA偶联,制备免疫原ZER-BSA和包被原ZER-OVA,并采用凝胶电泳、动物免疫对人工抗原进行质量鉴定,间接ELISA测定抗血清效价,间接竞争(阻断)ELISA测定抗血清的敏感性和特异性。结果表明,用制备的免疫原免疫小鼠血清效价均已达到1∶104以上。6号鼠的血清敏感性最高,对ZER的半数抑制质量浓度(IC50)达15.77ng/mL,获得的血清除与α-玉米赤霉醇特异性反应外,与其结构类似物β-玉米赤霉醇、α-玉米赤霉烯醇、β-玉米赤霉烯醇、玉米赤霉酮、玉米赤霉烯酮分别有12.5%、100%、12.5%、25%、100%的交叉反应,与其他霉菌毒素交叉反应性均小于0.5%。表明试验成功获得ZER人工抗原,通过动物免疫制备敏感性好、特异性强的ZER多克隆抗体,为ZER单克隆抗体的制备及其免疫学检测方法的建立奠定基础。     

氯羟吡啶人工抗原的合成及抗体特性

研究氯羟吡啶(CLOP)人工抗原合成及其多克隆抗体(pAb)制备。将CLOP进行化学修饰引入活性基团羧基,合成氯羟吡啶半抗原(CLOP-2C);分别采用活泼酯法和混合酸酐法将CLOP-2C与牛血清白蛋白(BSA)、卵清蛋白(OVA)偶联,合成人工免疫原CLOP-2C-BSA和包被抗原CLOP-2C-OVA,用紫外(UV)和凝胶电泳(SDS-PAGE)进行鉴定;用CLOP-2C-BSA免疫Balb/c小鼠,间接ELISA测定CLOP pAb效价,阻断ELISA鉴定其敏感性,交叉反应试验鉴定其特异性。结果表明:CLOP-2C-BSA偶联成功,CLOP-2C与BSA的分子结合比为34.0∶1;CLOP pAb效价达到1∶(2.56×104),对CLOP的IC50为7.76μg/L,与其他抗球虫药的交叉反应率低,获得高价、敏感、特异的CLOP pAb,为CLOP残留免疫学检测方法的建立奠定基础。     

猪免疫旋毛虫抗原和感染后的抗体应答

为了明确猪在免疫旋毛虫抗原和感染旋毛虫肌幼虫后的抗体应答反应,应用 ELISA 法,肌幼虫凝胶层析纯化抗原、新生幼虫和成虫可溶性抗原,对用肌幼虫可溶性抗原、肌幼虫 ES 抗原、成虫可溶性抗原、成虫 ES 抗原、灭活新生幼虫抗原制备的免疫原免疫后猪血清抗体以及攻击感染后的猪血清抗体进行了检测。用肌幼虫纯化抗原检测时,感染猪在感染后7d 抗体即出现变化,第14～21d 时上升较快,第28d 达最高值,抗体可持续6个月以上;各免疫组在第1次免疫后抗体滴度有不同程度升高,第2次免疫后上升较快,其中肌幼虫可溶性抗原及其 ES 抗原免疫组抗体应答较其它几种抗原免疫组强。用成虫可溶性抗原检     

雄烯二酮抗原对甘肃高山细毛羊繁殖力的影响

雄烯二酮-7α-羧乙基硫醚·人血清白蛋白免疫甘肃高山细毛羊后产生了相应的抗体,提高了繁殖力。排卵率比对照组提高59.4%,主要是提高双卵率;产羔率比对照组提高27%,比全场羊群提高25%。增加的全是双羔。产羔结束后一个半月羔羊的繁殖成活率注射组比对照组增加16%。     

检测盐酸克伦特罗含量的免疫传感器的载体膜部件的研制及效果评价

为研制检测农产品中盐酸克伦特罗残留的免疫传感器的分子识别元件附着载体膜，用醋酸纤维素作为膜载体支架结构，戊二醛作为交联剂，己二胺作为制孔剂，设立10种方案制备载体膜。通过采用双盲评分法鉴定载体膜的性能。结果确定了最佳制膜方案为：二醋酸纤维素0．5g，己二胺1．5g，8．33％戊二醛0．48mL，从而为免疫传感器的后续研究工作奠定了的基础。     

T-2毒素完全抗原制备及免疫学检测方法的建立

为建立小分子霉菌毒素中T-2毒素残留的检测方法,合成并鉴定T-2毒素完全抗原,通过制备敏感性强的抗T-2毒素多抗血清,建立T-2毒素免疫学检测方法。采用N,N'-羰基二咪唑(CDI)法合成完全抗原T-2-BSA和包被原T-2-OVA,采用聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDSPAGE)和动物免疫试验对合成的完全抗原进行鉴定,优化ELISA反应条件,建立T-2毒素间接竞争ELISA检测方法。SDS-PAGE结果显示,完全抗原T-2-BSA合成成功;动物试验结果显示,制备的完全抗原能够刺激小鼠产生针对T-2毒素的特异性抗体;基于该抗体所建立的T-2毒素间接竞争ELISA检测方法的灵敏度(IC50)为8.34 ng/m L,检测限(LOD)为0.048 ng/m L。综上,成功合成了完全抗原T-2-BSA,获得了效价高、敏感性强的抗T-2毒素的鼠源多克隆抗体,并初步建立了T-2毒素免疫学检测方法。     

牛分技杆菌胞浆特异蛋白质抗原的制备和检测

将牛分枝杆菌Mycobacterium boyis S_(10)株培养于苏通培养基,经低温高速离心,超声波裂解,Sephadex G200柱层析,获得3个峰,制备到3种胞浆蛋白质抗原,经同奶牛结核病分枝杆菌阳性血清。阴性血清及各种分枝杆菌高免牛血清的ELISA检测,并与牛PPD,聚合OT等抗原做了比较,以第二峰的胞浆蛋白质抗原的特异性为最好。     

莱克多巴胺免疫抗原与多克隆抗体的制备

采用碳化二亚胺-N-羟基琥珀酰亚胺(EDC-NHS)法将莱克多巴胺(RAC)与活化的牛血清白蛋白(BSA)偶联,合成了免疫抗原(RAC-BSA),经聚丙烯酰胺凝胶电泳法和紫外吸收法鉴定偶联成功.用合成的免疫抗原免疫家兔获得了高效价的多克隆抗体,采用所得抗体和辣根过氧化酶标抗原建立莱克多巴胺直接竞争酶联免疫吸附分析法(ELISA),标准曲线呈典型S型,具有良好的线性关系.     

小鼠CD40胞外段的原核表达及多克隆抗体的制备

为了探讨CD40抗体与CD40结合对B细胞应答小分子半抗原的增强作用,利用TRIzol法提取BALB/c小鼠脾脏总RNA,并反转录成cDNA;根据CD40的胞外段CDS设计引物,通过PCR扩增目的基因,构建pGEX4T-1-CD40表达载体,进行原核表达及多克隆抗体制备。结果表明,成功扩增了522 bp的目的基因,表达并纯化获得了45 ku的CD40重组蛋白,多克隆抗体抗体不但可与重组蛋白结合,与小鼠脾脏天然CD40蛋白也可以特异性结合。说明CD40重组蛋白表达成功,且制备的抗体有望模拟CD40L为B细胞活化提供第二信号。     

仔猪血清大豆抗原蛋白抗体间接ELISA检测方法的建立

【目的】研究并建立大豆抗原蛋白血清抗体间接ELISA检测方法。【方法】首先用大豆抗原蛋白对仔猪进行致敏,然后采用棋盘滴定法确定最佳抗原包被质量浓度及血清稀释倍数,并对其他条件进行优化,最终建立检测血清大豆抗原蛋白11S、7S抗体的间接ELISA方法,确立待测血清判定标准,并对建立的ELISA方法进行重复性、准确性和敏感性检测。【结果】建立的ELISA方法的最佳反应条件为:11S抗原蛋白最适包被质量浓度为2.0μg/mL,包被作用时间37℃下2h;将10g/L BSA作为封闭液,37℃封闭1h;待测血清37℃作用1h;酶标二抗最适稀释度为1∶1 500,37℃作用1h;显色剂最佳显色时间15min。7S抗原蛋白的最适包被质量浓度为2.5μg/mL,包被作用时间37℃下2h;将10g/L BSA作为封闭液,37℃封闭1h;待测血清37℃作用1h;酶标二抗最适稀释度为1∶1 500,37℃作用1h;显色剂最佳显色时间25min。11S和7S抗原蛋白间接ELISA检测方法的批内、批间变异系数均小于10%,重复性较好,灵敏度较高。【结论】建立了仔猪血清大豆抗原蛋白抗体间接ELISA检测方法,该法具有很强的特异性和敏感性,可用于大豆抗原蛋白11S、7S过敏反应的临床诊断。