山西省马铃薯Y病毒cp基因的克隆

[目的]对山西省马铃薯Y病毒cp基因进行克隆与序列特征分析。[方法]依据马铃薯Y病毒基因组序列,设计合成了一对引物PVYP1和PVYP2,以从山西省获得的带毒马铃薯叶片总RNA为模板,对RT-PCR扩增得到的基因片段进行序列测定。[结果]该DNA片段1～798bp为马铃薯Y病毒印基因,799～1064bp为3’非编码区序列,可编码265个氨基酸。将RT—PCR产物与载体连接后转入大肠杆菌提取阳性克隆的质粒DNA,酶切后琼脂糖凝胶电泳检测结果表明,重组质粒已转入大肠杆菌。BLAST软件分析表明,山西省马铃薯Y病毒分离物CP氨基酸序列与已公布的PVY CP氨基酸序列相似性最高可达100％,说明所得DNA片段确为PVY cp基因片段。[结论]该研究为对山西省马铃薯Y病毒的防治提供理论依据。     

青海省部分地区马铃薯Y病毒cp基因序列分析

马铃薯Y病毒(PVY)是危害我国马铃薯的主要病毒之一,其在自然条件下极易发生基因变异而产生株系分化现象。为揭示青海马铃薯Y病毒分离物cp基因的分子变异,利用RT-PCR方法扩增获得了16个马铃薯Y病毒分离物的cp基因序列,采用SDT、DANMAN、RDP和MEGA软件对其进行分子变异分析。序列一致率结果表明,16个分离物的核苷酸序列均为801个碱基,一致率为98.0%~100%,编码267个氨基酸,一致率为94.8%~100%。重组分析表明,16个分离物未发生基因重组。系统发育分析发现,11个分离物与PVY^N-Wi株系相聚成簇,表明其在系统发育关系上与PVY^N-Wi株系的亲缘关系最近,占被检出病毒分离物的68.7%;另外5个分离物与PVY^O株系相聚成簇,表明其在系统发育关系上与PVY^O株系亲缘关系最近;未发现PVY^C株系、PVY^N株系、PVY^E株系和PVY^NTN株系存在。     

马铃薯Y病毒广东分离物HC-Pro基因的克隆和序列分析

利用RT-PCR法对广东烟草样品的马铃薯Y病毒(Potato virus Y,PVY)辅助成分蛋白质(Helpercomponent proteinase,HC-Pro)基因进行了克隆,并对其进行了序列分析。测序结果表明广东PVY HC-Pro(命名为PVY-HC-GD)基因(用PVY-HC-GD表示)全长1 395 bp,编码465个氨基酸。与已报道的PVY HC-Pro基因核苷酸序列相比发现,PVY-HC-GD与PVY NTN株系(PVYNTN)(AB331517)的PVYHC-Pro基因核苷酸序列相似性最高,达99.6%。而氨基酸序列比较表明,PVY-HC-GD与PVY N株系(PVYN)(AM268435)的PVY HC-Pro氨基酸序列相似性最高,为99.1%。进一步将PVY-HC-GD的核苷酸和其编码的氨基酸序列与其他报道的同源基因比对构建了系统关系树,结果显示广东烟草样品中PVY-HC-GD与PVYNTN PVY HC-Pro亲缘关系最近。     

山西省马铃薯Y病毒pl基因的克隆与序列分析

依据马铃薯Y病毒基因组序列,设计合成了1对引物,以从山西省获得的带毒马铃薯叶片总RNA为模板,通过RT-PCR扩增得到852 bp的基因片段并进行了序列测定。BLAST分析表明,该DNA序列与PVY N:O株系pl基因序列相似性最高可达99%。     

广东地区犬瘟热病毒血凝素基因的克隆与序列分析

【目的】对广州和东莞市宠物犬感染犬瘟热病毒(CDV)的情况进行病原鉴定和分析,为监测CDV的遗传变异情况和防治犬瘟热(CD)提供数据基础。【方法】从表现CD症状的犬只中鉴定了17份CDV阳性样本,采用RT-PCR的方法克隆得到这些野毒株的血凝素(H)基因序列,采用生物信息学方法进行序列比对分析。【结果】17株CDV的H基因核苷酸与氨基酸序列的相似性分别为97.4%～100.0%和97.5%～100.0%,与Onderstepoort、Lederle和Convac等疫苗株相比,其核苷酸与氨基酸序列相似性分别为90.3%～91.5%和89.4%～90.8%。进化树分析结果显示,17株CDV野毒株均属于AsiaⅠ型,与疫苗株的分支较远;本研究鉴定的野毒株已进化形成9个潜在的N-糖基化位点。【结论】AsiaⅠ型CDV仍为该地区的流行基因型,基因型较稳定,但与疫苗株相比形成了一定的进化距离和出现了大量的变异。因此,继续监控CDV在犬群中的进化,掌握其遗传变异状况具有重要意义。     

贵州烟田马铃薯Y病毒优势株系全序列克隆及系统进化分析

为了解马铃薯Y病毒在贵州烟田的发生和流行规律,对2013—2015年采集到的贵州省多个烟区呈现典型茎脉坏死症状的疑似受马铃薯Y病毒(Potato virus Y,PVY)侵染的烟草样品进行单斑分离和病毒鉴定,并以现有PVY序列信息为参考,设计了4对PVY特异引物,经过RT-PCR扩增、T载体连接、序列测定以及序列拼接,并利用MEGA软件进行系统进化分析。结果发现PVY福泉分离物(PVY Fuquan isolate,PVY-FQ)和PVY大方分离物(PVY Dafang isolate,PVY-DF)为优势株系并获得了PVY-FQ和PVY-DF的全基因组序列。PVY FQ整条基因组由9 699个碱基组成,编码多聚蛋白的开放阅读框位于第188~9 373nt;PVY DF整条基因组由9 706个碱基组成,编码多聚蛋白的开放阅读框位于第190~9 375nt。2条序列的基本特征与已报道PVY基因组一致。对PVY-FQ和PVY-DF全序列与已报道PVY序列进行系统进化分析发现,PVY-FQ与PVY NTN株系具有较高的亲缘关系,而PVY-DF与PVYN具有较高亲缘关系。     

一株新城疫病毒F基因的克隆及序列分析

以PCR扩增新域疫病毒JZ05株的F基因,并进行克隆和测序.采用DNAssist序列分析软件将JZ05毒株,基因与另外18个NDV毒株F基因序列及其氨基酸序列进行比对分析.测序结果表明.NDV JZ05株F基因产物F0蛋白酶裂解位点(111~117位)的氨基酸序列为GRRQKRF.与18个NDV毒株F蛋白的氨基酸序7,1对比,半胱氨酸残基数目和位置完全一致;仅NDV JZ05株发生单个氨基酸残基变更的有5处;而其F蛋白细胞融合活性位点中的一些保守氨基酸残基都没有发生变更.10个毒株(Ch98、Ch2000、YN、JZ05、JS01、GD05、SCL03、SSX03、Lye01、TW)之间全长氨基酸序列的同源性均在96%以上,这10个毒株与3个疫苗毒株(LaSota、B1、Clone30)的同源性在88.07%～89.51%.     

陕北地区马铃薯Y病毒的RT-PCR检测及其序列分析

以陕北地区8个县(区)种植2~3代疑似带毒的马铃薯叶片为材料,Trizol法提取马铃薯叶片总RNA,以已公布的马铃薯Y病毒外壳蛋白(coat protein,CP)基因序列设计1对特异引物,反转录合成cDNA,RT-PCR扩增目的 DNA片段,1.5%的琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物。回收纯化CP基因片段并进行克隆和测序,采用DNAstar软件分析序列一致性。结果显示,所有马铃薯叶片中均扩增到与预期大小一致的、长度为400 bp的目的片段,表明这些马铃薯均感染了Y病毒;陕北8个县(区)马铃薯Y病毒CP基因与国内外其他地区12个样品之间的序列一致性为88.4%~99.8%,表明马铃薯Y病毒的CP基因序列比较保守,不易发生变异。RT-PCR方法可快速、准确地检测马铃薯Y病毒,从而为马铃薯茎尖剥离脱毒生产脱毒种苗(薯)提供依据。     

一株新城疫病毒HN基因的克隆及序列分析

以RT-PCR扩增新城疫病毒JZ05株的HN基因,并进行克隆和测序.采用DNAssist序列分析软件将JZ05毒株HN基因与另外18个NDV毒株HN基因序列及其氨基酸序列进行比对分析.测序结果表明,JZ05毒株的HN基因全长1716 bp,HN蛋白由571个氨基酸残基构成,具有5个潜在糖基化位点及13个半胱氨酸残基,第6个潜在糖基化位点(538-540 aa)发生缺失.与另外18个NDV毒株比对,仅NDV JZ05株发生单个氨基酸残基变更的有6处.与11个毒株(ZJ1、TJ03、Jlan-1-00、SBZ02、SCL03、JS02、GD05、SQD04、SQZ04、YG、Taiwan95)比对,HN基因序列及其氨基酸序列的同源性均在94%以上;但与3个疫苗毒株(Clone30、LaSota、B1)比对,基因序列的同源性约82%,氨基酸序列的同源性约87%.     

狐貉源犬瘟热病毒核蛋白基因的克隆及序列比较分析

参照已发表的犬瘟热病毒(CDV)核蛋白基因(N)序列设计合成了1对引物,用RT-PCR方法对从发病狐、貉中分离的MS01、SC01、ZD01三株CDV的N基因进行扩增,并分别将其PCR产物进行克隆和测序。测序结果表明:3病毒分离株N基因阅读框架全长均为1572bp,编码523个氨基酸。利用DNAstar的MegAlign生物软件,将3病毒分离株与Genbank数据库中现有的CDV毒株的N基因序列及推导出的氨基酸序列进行了同源性比较和系统进化树分析,结果发现:3病毒分离株与强毒参考株A75/17等野毒株高度同源,核苷酸同源为96.2%～99.1%,氨基酸同源为96.0%～99.8%,而与疫苗株Onderstepoor相对较远,核苷酸同源为93.6%～94.0%。N基因的系统进化关系分析显示:3病毒分离株均归为强毒株,并且与中国新疆的TN株、中国台湾的Kaohsiung株基因型最近,表现出一定的地理位置相关性。     

马铃薯Y病毒黑龙江分离株外壳蛋白基因克隆及序列分析

为研究马铃薯Y病毒的检测方法,参考GenBank中马铃薯Y病毒的全基因序列,应用Primer 6.0引物软件设计并合成了一对特异性引物PVYF、PVYR,利用RT-PCR方法对PVY病毒黑龙江分离株CP基因进行特异性扩增,对扩增片段进行序列测定并进行序列比对。结果表明:引物PVYF、PVYR可以扩增出包含PVY病毒CP基因全长的cDNA特异性片段,序列分析结果表明PVY病毒黑龙江分离株CP基因与GenBank上的40个不同PVY病毒分离株的CP基因氨基酸序列同源性为92.1%~97.4%,说明PVY病毒CP基因保守性较高,可以用作制备PVY病毒血清型检测方法的抗体基因。     

中国马铃薯Y病毒的检测鉴定及CP基因的分子变异

【目的】查明马铃薯Y病毒（Potato virus Y,PVY）病在中国的发生情况,及时、准确地鉴定出PVY并对其分子变异进行分析。【方法】采用ELISA 方法对采自中国14个省（直辖市）马铃薯种植区疑似受PVY感染的样品进行了检测,并对其中的部分材料镜检验证,然后根据CP基因序列设计1对简并引物针对随机选择感染PVY的14个省（直辖市）代表样品进行CP基因扩增克隆,将测序得到的序列进行分子变异分析,并使用贝叶斯法（Bayesian inference,BI）重建系统发育关系。【结果】ELISA检测结果表明,691份样品中220个样品与PVY抗体呈阳性反应,其余呈阴性反应;ELISA检测的阳性材料在透射电镜下均可观察到明显的风轮状内含体,14个PVY分离物均成功扩增出预期大小（约800 bp）的特异性片段,CP基因的核苷酸序列与已报道PVY不同株系的核苷酸序列一致性均在88%以上;在14个PVY分离物CP基因中共发现有29个多态性位点,其中6个简约信息位点,23个单一变异位点。系统发育分析结果显示,14个PVY分离物与PVYN:O株系相聚成簇,表明其在系统发育关系上,与PVYN:O株系的亲缘关系最近。【结论】PVY CP基因高度保守,但不同地区分离物也存在一定的分子变异,本研究可为今后了解PVY病毒病流行、变异趋势及其防治提供依据。     

鸡传染性支气管炎病毒N基因的克隆及序列分析

根据GenBank上已公布的鸡传染性支气管炎病毒(IBV)N基因序列经多重比较设计一对特异性引物扩增大庆分离株DQ1株的N基因,RT-PCR产物经纯化回收后,克隆到pMD18-T载体上,转化大肠杆菌TG1感受态细胞,筛选出阳性质粒进行序列测定,经与已发表的IBV N基因序列进行序列比较与分析,表明DQ1株的N基因与现有疫苗株存在一定差异.     

猪巨细胞病毒福建株gB基因的克隆和序列分析

为明确猪巨细胞病毒福建株(PCMV-FJ01)的gB基因特征,根据其序列特征,设计特异性引物对其进行分段扩增,并对目的片段进行克隆测序。结果发现,PCMV-FJ01株gB基因全长为2 580bp,编码859个氨基酸;其和GenBank数据库中的PCMV分离株的gB基因的核苷酸和氨基酸同源性分别均在98.3%和97.9%以上。此外,本研究还发现部分(约50%)PCMV代表株的gB基因存在ACA三核苷酸缺失(436位氨基酸存在谷氨酰胺Q的缺失)。除ZZ株外,PCMV不同分离株的gB基因是否存在基因缺失和其遗传进化正相关。     

山羊痘病毒TK基因的克隆与序列分析

设计特异性引物并应用PCR方法扩增山羊痘病毒QL、LD、Y、B株TK基因序列片段,将其克隆至pMD 18-T载体,构建重组质粒pMD18-T-TK.再将该重组质粒转化DH5α感受态细胞进行培养,对通过PCR、酶切鉴定为阳性的重组质粒进行序列测定.TK基因核苷酸和氨基酸同源性分析表明,4株测序毒株TK基因与参考毒株的同源性均为96.6%～100%,说明羊痘病毒TK基因具有高度的保守性.     

柑橘碎叶病毒外壳蛋白基因的克隆和序列分析

 【目的】了解中国CTLV分离物外壳蛋白（CP）基因的变异情况。【方法】对来源于中国不同地区、不同寄主品种的18个柑橘碎叶病毒（CTLV）分离物进行RT-PCR、克隆、测序,应用DNAMAN软件进行序列分析。【结果】18个分离物的CP基因全长714 nt, 推导的CP含237个氨基酸。CP核苷酸序列及推导的氨基酸序列最大相似性分别为88.5％～99.9％和91.1％～99.6％。与核苷酸序列G289→A或C、A409→C和G414→T的单碱基突变相对应,CTLV外壳蛋白第97、137、138位氨基酸在强、弱毒分离物之间存在差异,多数弱毒分离物为Q97或K97、Q137、H138,而多数强毒分离物为E97、R137或K137、Q138。在根据CP氨基酸序列构建的系统进化树上,本研究获得的18个CTLV分离物至少可以划分为2个组群,其中,在指示植物上表现较弱症状的多数(4/6)CTLV分离物划分在第Ⅰ组群,多数(10/12)CTLV强毒分离物划分在第Ⅱ组群。【结论】CTLV外壳蛋白基因相对保守,其第289、409、414位碱基在强、弱毒分离物之间存在差异,可能与病毒致病性相关。     

山羊神经肽Y基因外显子克隆及序列分析

采用PCR-SSCP 技术检测神经肽Y(neuropeptide Y,NPY)基因全部3个外显子在高繁殖力山羊品种(济宁青山羊)、中等繁殖力山羊品种(波尔山羊)和低繁殖力山羊品种(内蒙古绒山羊和安哥拉山羊)中的单核苷酸多态性,分析该基因对济宁青山羊高繁殖力的影响;并对济宁青山羊NPY基因3个外显子进行克隆测序,推导出编码的氨基酸序列,同时将济宁青山羊核苷酸和氨基酸序列与绵羊、牛、人、大鼠、小鼠和鸡6个物种的序列进行比较.结果表明,在4个山羊品种中未检测到NPY基因3个外显子的多态性;这7个物种的核苷酸和氨基酸序列的同源性分别为71.6%～99.7%和81.4%～100%;与牛、人等6物种相比,济宁青山羊NPY基因氨基酸序列38位存在特有突变(E38D).可见,物种间NPY基因保守性强,NPY基因可能不是影响山羊高繁殖力的主效基因.     

山羊痘病毒疫苗株TK基因的克隆与序列分析

用绵羊睾丸细胞培养山羊痘病毒疫苗株G14-STV44-55,提取其基因组为模板,设计TK基因的特异性引物并进行PCR扩增,获得了2405bp的DNA片段,并将PCR产物克隆至pGEM-TEasy载体。酶切鉴定、PCR鉴定和测序结果表明,成功获得了TK基因,获得的TK基因内存在唯一的ACC65I酶切位点和3′末端早期转录终止信号TTTTTN(T)T。核苷酸和氨基酸同源性分析表明,弱毒疫苗株G14-STV44-55TK基因与基因Bank中发表的13个参考毒株的同源性在96%和95%以上,说明羊痘病毒TK基因具有高度的保守性。     

水稻条纹病毒安徽分离物CP基因的克隆及序列分析

采集安徽庐江水稻条纹叶枯病感病稻株,提取病叶总RNA.设计特异性引物进行RT-PCR扩增,获得水稻条纹病毒安徽分离物(RSV-AH)的RNA3部分片段,克隆并测序.序列分析表明,该片段全长1051个核苷酸,其中包含的CP基因全长969个核苷酸,编码322个氨基酸.将RSV安徽分离物CP基因(AH-CP)与其它来源的RSV CP基因进行核甘酸序列相似性比较,结果表明,安徽庐江的RSV CP基因与江苏洪泽的RSV CP基因序列相似性最高,达99.3%.进一步构建RSV CP基因系统关系树,发现安徽庐江的RSV CP基因同样与江苏洪泽的RSV CP基因亲缘关系最近.     

水稻条纹病毒外壳蛋白基因和病害特异性蛋白基因的克隆和序列分析

水稻条纹病毒编码的外壳蛋白 (CP)和病害特异性蛋白 (SP)是两种与症状密切相关的蛋白 .本文对我国云南 YL分离物的 CP基因和 SP基因进行了克隆和测序 .结果表明 ,CP基因和 SP基因分别由 96 6和 534个核苷酸组成 .与已发表的一些分离物相比 ,YL分离物 CP基因与我国山东 C分离物和日本 T、M分离物的核苷酸序列一致性在 96 .0 %左右 ,氨基酸序列一致性为 97.0 % ,但从序列一致性和碱基变异方式来看 ,C分离物与 T、M分离物的亲缘关系稍近 .YL 分离物 SP基因和云南 CX分离物之间有 99.0 %的核苷酸序列一致性 ,但与 T、M分离物的核苷酸一致性只有 94 .0 %左右 .可见 ,不同分离物间 SP基因的变异与其地理分布有密切的关系 .