茶树亚硝酸还原酶基因CsNiR的克隆及表达分析

以‘龙井43’茶树叶片的cDNA为模板,利用RT?PCR技术克隆了茶树亚硝酸还原酶基因（CsNiR）,得到完整的ORF全长为1 764 bp,编码587个氨基酸;所推导的氨基酸序列与垂枝桦（Betula pendula）、拟南芥（Arabidopsis thaliana）、菠菜（Spinacia oleracea）和水稻（Oryza sativa）的同源性均大于76%。生物信息学分析表明,CsNiR分子量为68.648 kD,等电点为6.12,为亲水性的非分泌蛋白;二级结构的预测显示,CsNiR具有完整的NiR 蛋白结构,含血红素蛋白β–化合物区域和4Fe-4S区域。实时荧光定量结果表明,该基因在成熟叶片中表达量高于一芽二叶和根。采用营养液水培3个茶树品种,在氮饥饿两周后分别供应正常氮素和低氮素（1和0.1 mmol · L^-1 NH₄NO₃）,qRT-PCR测定发现,正常氮素处理的2 h和6 h,诱导根CsNiR表达量显著增加,叶片中的表达量变化延迟到24 h之后,且变化幅度存在基因型之间的差异;低氮处理对CsNiR表达量的影响相对较小。因此,研究CsNiR基因的表达特性及其在茶树氮素利用中所发挥的作用,需结合茶树基因型、组织部位、供氮水平等进行综合评价。     

白菜NRT2基因的克隆及表达模式分析

 以白菜（Brassica campestris ssp. chinensis Makino）品种‘苏州青’为试材,采用RT-PCR技术,获得1个高亲和硝酸盐转运蛋白基因（NRT2）的cDNA序列,全长1 593 bp,推断其编码530个氨基酸,命名为BcNRT2。序列分析表明：BcNRT2基因与甘蓝型油菜BnNRT2基因和拟南芥AtNRT2.1基因核苷酸序列的相似性分别为98%和90%,氨基酸序列的相似性分别为99%和95%,表明植物中NRT2基因保守度较高。实时定量PCR表达分析表明,BcNRT2在白菜根部的表达量最高,为诱导型表达。低浓度NO^₃-（0.2 mmol · L^-1 KNO₃）处理0.5 h后其表达量迅速上升,BcNRT2可能为NO₃^-感受器。高浓度NO₃^-（20 mmol · L^-1 KNO₃）处理后其表达量更高,持续时间较长,可能是受到低亲和硝酸盐转运蛋白NRT1.1的调控而产生的高水平响应。原生质体的瞬时表达显示,BcNRT2蛋白位于细胞膜上。     

白菜S位点糖蛋白基因的克隆与表达分析

 以白菜自交不亲和系为材料,采用RT-PCR技术,用特异引物对SLG基因进行克隆,获得SLG基因cDNA序列长度为1 324 bp,命名为BcSLG。序列分析表明：所获得的白菜BcSLG基因cDNA序列包含一完整的编码框,编码432个氨基酸,含有12个保守的半胱氨酸残基和7个N-糖基化位点。序列比对和系统进化分析表明：BcSLG与其它植物的SLG基因氨基酸序列具有较高的同源性,与大白菜和甘蓝亲缘关系最近。荧光定量PCR分析表明：BcSLG基因在自交不亲和系的柱头中表达量最高,其次是花蕾,叶片中表达最低, 在自交亲和系的柱头、花蕾和叶片中相对表达较低。     

白菜春化相关基因BcFLC的克隆及表达研究

运用同源基因克隆法从‘上海青’白菜（Brassica campestris ssp. chinensis var. ommunis ‘Shanghai Qing’）和‘四九’菜薹（var. parachinensis‘Sijiu’）叶片中分离到FLC的同源基因BcFLC的编码序列、启动子以及内含子1序列;序列比对发现,二者编码的核苷酸序列几乎完全一致,而且启动子及内含子1序列也无实质性差异;对‘上海青’进行人工低温春化处理,BcFLC1基因在‘上海青’茎尖的表达随着低温处理时间的延长逐渐减弱,低温处理20 d时BcFLC1基因的表达已经非常弱,低温处理30 d时,表达已检测不到,花芽分化石蜡切片也表明,低温处理20 d,茎尖已开始向生殖状态过渡。BcFLC2基因在‘四九’菜薹未现蕾之前的叶片中有强表达,而现蕾之后叶片中则检测不到。     

藤稔’葡萄VvGAI基因的克隆、亚细胞定位及时空表达分析

 以‘藤稔’葡萄（Vitis vinifera × V. labrusca‘Fujiminori’）的茎、叶、花和果为试材,采用RT-PCR结合RACE技术,克隆获得1个推测为葡萄赤霉素响应因子VvGAI基因的cDNA序列,全长2 295 bp,其编码590个氨基酸。该基因在GenBank基因数据库的登录号为HQ834311。序列分析表明：VvGAI与杨树、拟南芥、水稻的同源基因的氨基酸序列相似性分别为68.56%、62.79%和54.16%。半定量与定量PCR结果都表明,VvGAI在葡萄茎尖、叶、花和果等营养与生殖器官中均有表达,但在茎尖中的表达最高,是一个与快速生长和分裂关系密切的基因。50 mg · L^-1赤霉素处理后,各阶段果实中VvGAI表达量趋势与对照基本一致,但水平低于对照,其中幼果中表达量最高。洋葱表皮细胞的瞬时表达显示,VvGAI蛋白定位于细胞核。     

钼锰对不结球白菜硝酸还原酶活性及主要营养品质的影响

采用叶面喷施、根部施用、叶面喷施与根部施用相结合的3种处理方式,研究了钼、锰对不结球 白菜硝酸还原酶活性、硝酸盐含量及营养品质的影响。结果表明,钼能够显著提高不结球白菜的硝酸还 原酶活性,使其硝酸盐含量显著降低;锰对不结球白菜硝酸还原酶活性的影响不明显,但可以显著降低其 硝酸盐含量。钼和锰均可提高不结球白菜可溶性糖和VC含量。与单施钼、锰相比,钼锰配施对降低不结 球白菜硝酸盐含量、提高其可溶性糖和VC含量效果更明显。     

白菜多聚半乳糖醛酸酶基因B cM F6的克隆、序列分析及其表达

 从白菜(Brassica campestris L. ssp. chinensis Makino) 核隐性不育两用系‘Bajh97201A /B’可育株中分离得到的一个cDNA-AFLP差异片段入手, 利用RACE技术成功克隆了一个花粉特异的多聚半乳糖醛酸酶( PG) 基因BcMF6的DNA和cDNA全长序列, 并对其序列进行了分析。结果表明, 该基因包含4个外显子和3个内含子, 最大开放阅读框为1 194 bp, 编码397个氨基酸序列, 对推导的氨基酸序列进行分析, 1到22个氨基酸是1信号肽序列, 其后有4个平行β螺旋重复( PbH1) 结构, 该序列包含3个N -糖基化位点, 4个蛋白激酶c磷酸化位点, 5个酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点, 10个N - 豆蔻酰化位点, 1个PG活性位点(²²⁷RVTCGPGHGIS1 IGS²⁴⁰ ) 等。将B cM F6基因氨基酸序列与数据库中的其他PGs基因进行同源序列比对, 构建系统进化树, 发现该基因具有所有PGs基因特有的4个保守结构域, 并且与花粉中特异表达的PG基因聚为一类, 表明该基因是与花粉发育相关的多聚半乳糖醛酸酶基因。RT-PCR对其表达的研究表明, 该基因在可育株(野生型) 的中大蕾、开放花和短角果中特异表达, 进一步表明该多聚半乳糖醛酸酶基因与白菜的花粉发育相关。     

白菜黄烷酮-3-羟化酶基因的电子克隆与序列分析

现根据同源基因相对保守性,利用已知的油菜F3H基因序列,采用电子克隆的方法获得了白菜F3H基因的cDNA序列;并采用生物信息工具对白菜F3H的性质包括氨基酸序列组成,物理和化学性质,疏水性或亲水性,二级和三级结构的特点进行了研究。结果表明:白菜F3H基因cDNA全长为1 228bp,包含1个完整的开放读码框(1 077bp),编码358个氨基酸。其分子量为40 104.6Da,等电点为5.45;其三维结构显示其是具有7个螺旋和12个折叠和一些不规则卷曲组成的球状结构。     

百子莲开花相关基因ApFT的克隆及表达分析

采用cDNA末端快速扩增（rapid amplification of cDNA ends,RACE）方法得到了百子莲（Agapanthus praecox ssp. orientalis）FT基因cDNA全长序列,命名为ApFT,GenBank登录号为KC951108。序列分析表明,百子莲ApFT基因cDNA全长815 bp,其中开放阅读框534 bp,编码177个氨基酸,5′非编码区（5′UTR）和3′非编码区（3′UTR）分别为89 bp和192 bp。ApFT编码的蛋白有一个单一而非常保守的PEBP（Phosphatidylethanolamine-binding protein,PEBP磷酸乙醇胺结合蛋白）结构域,与玉米（MFT2）、拟南芥（AtFT）和温州蜜柑（CuMFT1）等植物的FT蛋白有较高的相似性,同源性均在50%以上。系统进化树分析表明,百子莲ApFT与玉米（MFT2）聚类关系最近。实时荧光定量qRT-PCR结果显示,整个花芽分化过程中ApFT在叶片中表达量高,茎尖中表达量低。随着花芽分化的进程,在叶片中ApFT表达量逐渐降低,而茎尖中ApFT的表达量在诱导期均高于营养期和花芽分化期,推测该基因可能在调节百子莲花芽分化过程中发挥重要作用。     

叶用莴苣LsHsp70基因的克隆及表达分析

 以叶用莴苣（Lactuca sativa L.）叶片为试材,采用RT-PCR结合RACE技术,克隆LsHsp70基因序列,并利用实时荧光定量PCR技术检测耐热品种‘Z36’和热敏品种‘S106’在不同高温胁迫下LsHsp70基因的表达情况。结果表明,LsHsp70基因的开放阅读框为2 094 bp,编码697个氨基酸,推测蛋白质分子量为74.1 kD,具有HSP70家族3个标签序列IDLGTTNS、VFDLGGGTFDVSVL和VILVGGSTRIPAV,与拟南芥Hsp70同源性高达92%。高温胁迫能够诱导LsHsp70表达;LsHsp70对37℃高温胁迫的响应比对42℃高温胁迫的响应更为显著和迅速;在相同胁迫温度下,耐热品种‘Z36’比热敏品种‘S106’对高温的应激反应迟缓,持续时间更长,说明该基因的表达与叶用莴苣耐热性有一定的关联。     

不结球白菜OguCMS下胚轴原生质体培养再生植株

取不结球白菜OguCMS 5d苗龄的下胚轴 ,在 2 0mg/mL纤维素酶 (OnozukaR 10 ) ,10mg/mL果胶酶 (MecerozymeR 10 )及CaCl2 ·2H2 O 10mmol/L、KH2 PO4 0 .7mmol/L、甘露醇 0 .5mol/L的酶液中游离 36h ,50 0r/min下离心收集下胚轴原生质体。原生质体在KM8P1附加 2 ,4 D 0 .5mg/L、 6 BA 0 .2 5mg/L、NAA 1.0mg/L的培养基上培养 2 1d形成小愈伤组织 ,经MS附加 2 ,4 D 1.0mg/L增殖愈伤组织 ,在MS附加 6 BA 10 .0mg/L和NAA 0 .3mg/L培养基上进行芽分化培养 ,并在无任何激素的MS培养基上生根 ,14d后即可获得完整的再生植株。     

白菜β-1,3 - 葡聚糖酶基因cDNA的克隆及序列分析

 以白菜抗霜霉病品种‘雪克青’cDNA 为模板, 采用RT2PCR 技术, 获得了1032 bp 的β- 1,3- 葡聚糖酶基因的cDNA 序列。序列分析表明, 克隆的β- 1,3 - 葡聚糖酶基因cDNA 序列编码343 个氨基酸, 与芜菁bg1 基因具有98 %的同源性, 与拟南芥bg2 基因具有84%的同源性。在GenBank 中登录号为AY395720 。     

茎芥菜胞质四倍体白菜雄性不育系花药发育的研究

 以茎芥菜胞质雄性不育系与四倍体白菜杂交获得的同源四倍体白菜异源胞质雄性不育系及其保持系为材料,采用形态学和石蜡切片方法研究其花药解剖结构及发育。结果表明：该雄性不育为结构性雄性不育,其退化或畸形雄蕊分为5种类型：盾状雄蕊、条状雄蕊、片状雄蕊、羽状雄蕊和瓣状雄蕊。该雄性不育系花药发育败育有两个时期,盾状雄蕊花药败育于孢原细胞分化期,雄蕊整个发育时期均处在孢原细胞分化期,无绒毡层与花粉母细胞的分化,不形成药室,属孢子体败育型;其它类型雄蕊,花药败育发生在雄蕊原基分化时期,由于雄蕊原基偏离正常的分化轨道,形成瓣状化雄蕊。     

大白菜核雄性不育相关基因BrLTP1的克隆及特征分析

 利用cDNA-AFLP技术分析大白菜核雄性不育两用系‘AB02’可育株（msms）和不育株（Msms）花蕾的基因表达谱,在可育株混合花蕾cDNA中扩增出1条特异条带TDF-25,通过RACE和RT-PCR技术克隆了该基因的全长cDNA序列。序列分析表明,该基因编码脂质转移蛋白,命名为BrLTP1。BrLTP1全长cDNA序列为750 bp,推测编码1个包含183个氨基酸残基的前体蛋白。BrLTP1蛋白含有典型的脂质转移蛋白N端信号肽,保守的AAI结构域和半胱氨酸位点。预测BrLTP1蛋白含有多种修饰性位点,包括1个PKC磷酸化位点,2个N–糖基化位点和10个N–端豆蔻酰基化位点。基因表达模式表明,BrLTP1在两用系不育株花蕾中受到强烈抑制,在可育株的大花蕾、成熟花药以及花瓣中高水平表达。     

白菜GLDH 基因cDNA的克隆及序列分析

 以白菜品种‘苏州青’ cDNA 为模板, 采用RT-PCR、巢式PCR、3’RACE和5’RACE技术, 获得了L - 半乳糖酸- 1, 4 - 内酯脱氢酶(EC 1.3.2.3, GLDH) 基因cDNA 2 034 bp全长序列。序列分析表明, GLDH基因cDNA序列编码601个氨基酸。其氨基酸序列与花椰菜GLDH基因具有98%的同源性, 与拟南芥GLDH基因具有90%的同源性。该基因在GenBank中登录号为AY899298。     

白菜2n配子诱导及有性多倍化创制四倍体的研究

以165份白菜(2n=2x=20)品系中筛选出的11份含2n配子较高的株系为材料,用不同浓度秋水仙素处理花蕾,诱导2n配子;以其为父本,以四倍体雄性不育系为母本进行有性多倍化杂交,从F1中筛选鉴定四倍体。结果表明:用0.20%秋水仙素5~10μL微量注射3mm的二倍体白菜花蕾,处理1次,诱导2n配子效果最好,2n配子频率达20.20%,是未经秋水仙素处理对照的3.63倍。80株杂交F1中,染色体计数显示14株为四倍体(2n=4x=40),占17.5%。与二倍体相比,有性多倍化获得的四倍体在植株形态、气孔、花器官等方面均表现巨大性,气孔密度和结实率降低。     

利用DAD1反义片段转化创建菜薹可调控雄性不育材料

 菜薹因为没有好的雄性不育材料或自交不亲和系,至今尚无一代杂种用于生产,根据拟南芥及白菜型油菜的花药不开裂基因DAD1的保守序列设计引物,扩增菜薹的DAD1基因片段（DAD1F）,构建反义DAD1F植物表达载体,用农杆菌介导法转化菜薹,对转基因植株进行分子检测,鉴定其雄性不育性并进行育性恢复试验.克隆得到的菜薹的DAD1基因片段大小为678 bp,命名为BrcpDAD1F,其序列与拟南芥和白菜型油菜的DAD1高度同源,同源率分别为88％和99％;共得到了12株转基因植株,有6株在转录水平上得到表达,表现为雄性不育,花器官畸形,花粉活力低,萌发率不到10％,且开花后不能结角果或结空角果,或者得到极少种子但种子不萌发;用对照的花粉给转基因植株授粉可使其正常结实.以500 μmol·L^-1茉莉酸甲酯处理可使其雄性不育得到恢复,花粉可以在柱头和培养基上萌发,具有受精能力。T₁代可育株与不育株的比例都呈1:3分离, T₂代不同株系的育性分离比例不同,有些株系继续呈1:3的分离,有些株系全是可育株或全是不育株,说明反义抑制呈单基因稳定遗传。     

o3对‘五月蔓’ 白菜生长和产量的影响

 利用农田开顶式气室进行不同0₃浓度处理对白菜影响的试验研究。结果表明：0₃浓度增加导致白菜黄叶率上升，总生物量增长速率下降，并可改变光合产物分配模式；延长高浓度0₃熏气时间，对白菜叶片数、叶面积、产量和外轮叶净光合速率影响较大，对心叶和中部叶片净光合速率影响较小；对处于不同生长期的白菜进行相同天数高浓度0₃处理，经济产量和总生物量的响应，前期处理大于后期，叶面积则相反，对叶片数无影响。