烟粉虱烟碱型乙酰胆碱受体α亚基Btα4基因的克隆和序列分析

利用RT-PCR和RACE技术,对烟粉虱烟碱型乙酰胆碱受体(nAChR)α亚基的1个基因进行了克隆和序列分析.获得的烟粉虱nAChR α亚基基因的全长cDNA序列含有2 090 bp,其开放阅读框编码564个氨基酸.根据该基因编码的氨基酸序列与其他昆虫乙酰胆碱受体α亚基氨基酸序列之间的相似性,将该基因命名为Btα4(GenBank注册号为EF590120).Btα4编码的α亚基含有2个结构域:N端的胞外结构域和C端的跨膜结构域,N端的胞外结构域含有2个相邻的半胱氨酸(α亚基特征序列)、15个氨基酸构成的半胱氨酸环和乙酰胆碱结合区.研究结果对于揭示烟粉虱潜在的对新烟碱类杀虫剂靶标抗性的分子机制具有重要意义.     

朱砂叶螨烟碱型乙酰胆碱受体α4亚基基因的克隆与序列特征分析

烟碱型乙酰胆碱受体(nAChR)是一种对神经递质乙酰胆碱起快速反应的激动剂门控离子通道,也是新烟碱类杀虫剂的作用靶标。此研究利用同源克隆结合RACE技术,从朱砂叶螨敏感品系中克隆了一条nAChR基因,全长为2 023bp,开放阅读框长1 635bp,编码544个氨基酸。预测分子量(Mr)为62.20kDa,等电点(pI)为5.00。根据同源性及系统发育分析,将其命名为Tcα4,提交至NCBI数据库,获得GenBank登陆号为KP694228。Tcα4具有nAChRα亚基典型结构特征:N端胞外结构域和C端跨膜结构域。Tcα4与二斑叶螨nAChRα4亚基基因序列同源性高达98.71%,与二斑叶螨其他nAChR亚基基因同源性仅在20.07%~43.16%之间,与其他昆虫nAChRα4亚基基因同源性在45.96%~56.07%之间。系统发育分析结果表明朱砂叶螨与二斑叶螨和肩突硬蜱nAChRα4亚基基因在同一分支,与其他昆虫nAChRα4亚基基因则较远。朱砂叶螨nAChRα4亚基基因的克隆为朱砂叶螨其他nAChR亚基基因的研究及以nAChR为作用靶标的新型杀螨剂的研究提供了一种新途径,奠定了基础。     

小菜蛾烟碱型乙酰胆碱受体α亚基cDNA片段的克隆和序列分析

利用简并引物，采用PCR等分子生物学技术，对小菜蛾烟碱型乙酰胆碱受体（nAChR)α亚基的cDNA片段进行克隆，并对序列进行分析。测序结果显示，扩增的目的基因片段包含了nAChRα亚基的3种亚型（分别命名为Pxαl，Pxα2，Pxα3）。都具有典型的α亚基的结构；2个相邻的半胱氨酸，由2个半胱氨酸之间二硫键形成包含15个氨基酸的胞外环，与烟碱和α银环蛇毒素结合有关的氨基酸残基，克隆的基因片段在氨基酸序列上和其他昆虫nAChRα亚基基因之间有高达65%-99%的同源性，表明克隆的cDNA片段是小菜蛾nAChRα亚基基因的部分序列。     

烟碱型乙酰胆碱受体β4亚基点突变体的构建

利用PCR介导的定点突变技术构建包含β4亚基的烟碱型乙酰胆碱受体点突变体模型,同时采用双电极电压钳技术,对激动剂ACh和拮抗剂α-CTx RegIIA对突变受体的活性进行检测。结果表明:β4亚基胞外N端序列第168位的异亮氨酸(Ile)成功突变成了丝氨酸(Ser),突变后的受体对激动剂ACh的活性降低,对拮抗剂α-CTx RegIIA的活性降低了1.4倍,半阻断剂量(IC_(50))为170 nmol·L~(-1)。     

α-芋螺毒素与烟碱型乙酰胆碱受体作用的药理学

芋螺毒素(CTX)来源于芋螺毒管分泌的毒液,是一类分子质量小、结构新颖、作用靶点广泛且特异性高的活性多肽,具有开发成为药物或药物先导化合物的价值。芋螺毒素按其作用靶点不同等特点可以分为多个家族,其中α-芋螺毒素家族(α-CTXs)的半胱氨酸模式为:CC-C-C。根据α-CTXs半胱氨酸残基间的氨基酸数目进一步分为不同的亚家族。α-CTXs是肌肉或神经型烟碱乙酰胆碱受体的选择性拮抗剂,具有重要临床意义的乙酰胆碱受体(nAChRs)与神经痛、帕金森病、痴呆、学习记忆障碍以及小细胞肺癌等多种疾病的发病、诊断和治疗密切相关。笔者详述了α-芋螺毒素与烟碱型乙酰胆碱受体的结构、分类及其相互间的作用关系,旨在为该类药物的开发利用提供参考依据。     

烟粉虱成虫对烟碱类杀虫剂抗性的生物测定方法

采用浸叶法和内吸法测得的烟粉虱成虫对吡虫啉、啶虫脒和噻虫嗪的抗性比值分别为1.22、3.28、2.49和1.37、4.27、3.26,2种方法测定的结果基本一致.浸叶法测定结果表明,吡虫啉对自然混合日龄与饲养的不同日龄成虫的LC50之间无显著差异.此外,分别以棉花叶和茄子叶作为试验材料测定烟粉虱对吡虫啉的抗性,测定结果也是基本一致的.因此,认为可以采用与田间实际用药情况相接近的成虫浸叶法进行烟粉虱对烟碱类杀虫剂的抗药性监测,而且可采用自然混合日龄成虫代替饲养的相同日龄成虫直接进行生物测定,棉花叶和茄子叶均可作为抗药性生物测定的试验材料.     

5种杀虫剂对B型烟粉虱的毒力测定

采用浸叶法分别测定了苦参碱、阿维菌素、氯氰菊酯、灭多威和吡虫啉对B型烟粉虱不同虫态的毒力.结果表明:苦参碱对烟粉虱卵的毒力最高,LC50为0.802 mg.L-1,其毒力是吡虫啉的323.8倍;阿维菌素、苦参碱和吡虫啉对1龄和3龄若虫的毒力均较高,但对1龄若虫的毒力高于3龄若虫;阿维菌素和苦参碱对成虫的毒力较高,分别是吡虫啉的111.6和77.4倍;而灭多威和氯氰菊酯对烟粉虱各虫态均表现出较低的毒力.     

α6/α3β4烟碱型乙酰胆碱受体β4亚基双点突变体的制备及其功能研究

在烟碱型乙酰胆碱受体家族中,含α6亚型的受体是比较特殊的一类。研究发现α6β4*亚型(*表示含其他亚基)在神经系统方面具有一定的调节作用,与神经性疼痛、成瘾等多种疾病的发病机制密切相关,可作为潜在的治疗靶点。比对大鼠与人类α6和β4亚基的序列,以野生型基因为模板,采用基因定点突变的方式,成功得到3种相邻位点突变的α6/α3β4受体突变型基因。通过体外转录、显微注射等手段,构建α6/α3β4受体野生型和突变型在非洲爪蟾卵母细胞上的表达模型,并使用双电极电压钳检测受体的表达情况。结果表明,与野生型受体相比,突变体α6/α3β4[S52N, I53V] 对ACh的敏感性有所提升,EC₅₀为59.58 μmol·L?1,是野生型的1/2,而其他两种突变体的敏感性与野生型相同。     

烟粉虱味觉受体基因BtabGR1和BtabGR2的克隆与表达模式分析

【目的】烟粉虱（Bemisia tabaci）为世界性分布的重要农林入侵害虫,寄主植物种类众多,但对不同寄主植物存在嗜性差异,而味觉受体（gustatory receptor,GR）基因在其取食选择等行为中发挥重要作用。本研究通过克隆烟粉虱味觉受体GR1和GR2基因,明确其在烟粉虱不同发育期和成虫不同组织中的表达特性,为基因功能的深入研究提供依据。【方法】从烟粉虱MED隐种成虫头部转录组中筛选获得味觉受体基因序列,利用巢式PCR技术克隆获得两个味觉受体基因的完整开放阅读框（open reading frame,ORF）序列,两个基因分别命名为BtabGR1和BtabGR2,运用生物信息学软件对其编码氨基酸序列特征、结构域等信息进行预测,基于邻接法构建BtabGR1、BtabGR2与其他半翅目昆虫味觉受体基因的系统进化树,并利用实时荧光定量PCR方法分析两个基因在烟粉虱不同发育期（卵、1—4龄若虫和雌、雄成虫）和雌、雄成虫不同组织（头、胸、腹、足）中的表达情况。【结果】克隆获得BtabGR1和BtabGR2基因序列（GenBank登录号：OL845904和OL845905）,完整开放阅读框为1 287和1 344 bp,分别编码428和447个氨基酸,预测蛋白分子量为 48.54和51.50 kD,理论等电点为8.85和8.74,具有4个和6个跨膜结构域。氨基酸序列比对和系统进化分析结果显示,BtabGR1 和BtabGR2与其他半翅目昆虫GR28b和GR43a-like基因亲缘关系较近。发育期表达谱分析表明,BtabGR1和BtabGR2在烟粉虱的不同发育历期均有表达,其中BtabGR1在成虫中表达量高于其他发育期,而BtabGR2在卵中的表达量最高;组织表达谱结果表明,BtabGR1和BtabGR2在烟粉虱雌、雄成虫不同组织中均有表达,且均在成虫头部高表达。【结论】BtabGR1和BtabGR2具有昆虫味觉受体基因的典型特征,二者均在烟粉虱成虫头部高表达,推测两基因在烟粉虱寄主植物适应过程中发挥重要作用,可作为烟粉虱新型防控措施的潜在靶标。     

Q型烟粉虱化学感受蛋白基因BtabCSP1的克隆与分析

【目的】克隆Q型烟粉虱（Bemisia tabaci）化学感受蛋白基因,分析其序列特征和表达特性,为深入研究该类基因功能奠定基础。【方法】根据桃蚜化学感受蛋白OS-D2a（ABM5558）的氨基酸序列,借助生物信息学搜索烟粉虱EST序列拼接了1个烟粉虱化学感受蛋白基因（BtabCSP1）,以烟粉虱mRNA为模板,采用RT-PCR扩增克隆烟粉虱化学感受蛋白cDNA。采用半定量RT-PCR对不同发育阶段的烟粉虱样品中BtabCSP1的表达模式进行研究。【结果】BtabCSP1完整阅读框全长为2 626 bp,包含2个外显子和1个内含子,编码131个氨基酸残基,其中含有1个CX6CX18CX2结构域,为化学感受蛋白的典型特征。BtabCSP1在供试样品中均有表达,并且在2龄、3龄和伪蛹阶段表达量更高。聚类分析结果表明,烟粉虱与果蝇、桃蚜等物种遗传关系较远,化学感受蛋白基因在物种进化过程中较为活跃。【结论】从Q型烟粉虱若虫中克隆了1个化学感受蛋白基因 BtabCSP1,该基因在烟粉虱不同发育阶段中均能表达,推测其对烟粉虱的生长发育具有重要的调控作用。     

新疆B型烟粉虱对不同类型杀虫剂的敏感性测定与分析

[目的]对近年来新疆B型烟粉虱对不同类型杀虫剂的敏感性特征及其发展变化进行了研究,为该害虫在新疆的化学防治及抗药性治理(IRM)策略提供科学依据.[方法]应用着卵叶片浸渍法和浸叶法比较测定了新疆部分地区B型烟粉虱对不同类型杀虫剂的敏感性.[结果]由于长期用药防治烟粉虱,在新疆不同区域和寄主上B型烟粉虱对杀虫剂的敏感性出现了分化.[结论]被测种群对毒死蜱、噻虫嗪及天然除虫菊酯的敏感度低,LC50值分别为71.662～330.855、223.028～242.420和107.117～164.639 mg/L,属于抗性治理的重点品种;对吡虫啉、溴氰菊酯和氟虫腈的LC50值分别为43.47～67.496、27.881～61.688和21.808～43.768 mg/L,具有较高的抗药性风险,应当重点监测其抗性发展程度;对吡虫清、苦参·烟碱乳油等药剂敏感性高,属于重点保护的农药品种,可以在新疆烟粉虱的化学防治使用.另外,除了大剂量、高频率使用杀虫剂的温室烟粉虱品系ZH-O对吡丙醚产生了超过3 000倍的抗性外,其余各品系对吡丙醚表现敏感,该药剂仍可作为烟粉虱治理的重要品种之一.     

10种杀虫剂对南京地区Q型烟粉虱的室内毒力测定

在室内测定了10种杀虫剂对南京地区Q型烟粉虱的毒力,为生产上科学选择杀虫剂品种提供依据。根据烟粉虱的虫态和虫龄分别设计毒力测定方法,结果表明:10种杀虫剂中阿维菌素、甲氨基阿维菌素苯甲酸盐、啶虫脒和印楝素对烟粉虱成虫、若虫毒力较高,测定的杀虫剂品种中仅印楝素和噻虫啉对烟粉虱卵表现出较好的杀伤作用;在南京地区防治烟粉虱时应选用敏感性高的抗生素类杀虫剂,交替使用新烟碱类农药,并配合使用对烟粉虱卵高效的杀虫剂品种。     

不同类型药剂对B型烟粉虱的毒力作用评价

采用浸叶法,在室内测定了9种药剂对B型烟粉虱不同虫态的毒力大小,结果表明,9种药剂对烟粉虱成虫的毒力大小依次为:阿维菌素＞啶虫脒＞印楝素＞苦内酯＞吡虫啉＞毒死蜱＞功夫＞鱼藤酮,噻嗪酮对成虫无毒杀作用;对烟粉虱低龄和高龄若虫的毒力大小依次为:阿维菌素＞啶虫脒＞苦内酯＞印楝素＞吡虫啉＞鱼藤酮＞噻嗪酮＞功夫＞毒死蜱和阿维菌素＞苦内酯＞啶虫脒＞印楝素＞吡虫啉＞鱼藤酮＞噻嗪酮＞毒死蜱＞功夫;9种药剂对烟粉虱卵都没有表现出明显的毒杀作用.此外,B型烟粉虱成虫接触经印楝素处理的甘蓝叶片后,在未经印楝素处理的叶片上产卵量显著下降,所产卵的孵化率显著降低.     

Q型烟粉虱在中国的风险性分析

通过对Q型烟粉虱进行定性与定量分析以及在中国的危害特点等方面的介绍,表明了Q型烟粉虱的严重危害性。提出加强对该生物型烟粉虱的检疫,防止其在中国的进一步扩散的方法。     

烟粉虱B型和Q型群体遗传结构的ISSR比较分析

【目的】对烟粉虱复合种中2种入侵性较强的生物型烟粉虱B型和Q型的群体遗传结构进行比较研究,揭示其入侵机制并对其管理提供依据。【方法】采用简单序列重复区间扩增（ISSR）标记,以温室白粉虱以及浙江非B/Q型为对照种群,对世界各地16个烟粉虱B型种群和4个烟粉虱Q型种群的遗传结构进行分析。【结果】遗传多样性分析结果表明,烟粉虱Q型种群的Nei氏基因多样性指数、Shannon信息指数及多态性位点百分比等各项遗传多样性指数均高于烟粉虱B型的相应指数。聚类分析结果提示,ISSR标记能够区分烟粉虱不同生物型,但可能不适用于生物型之间的系统发育分析。【结论】烟粉虱B型种群遗传多样性高于Q型种群。     

上海地区烟粉虱生物型的鉴定

烟粉虱是一种由许多生物型组成的复合种,是一种世界性的重要害虫.不同生物型的烟粉虱在寄主范围、传毒能力、抗药性等许多生物学特性方面存在差异.利用mtDNA COI基因作标记对上海地区的烟粉虱生物型进行了分析鉴定.结果表明,所测上海10个代表性地区中,闵行区只检测到B型烟粉虱,嘉定、青浦和徐汇区只检测到Q型烟粉虱,其余各地区B型和Q型两种生物型烟粉虱共存.所测上海地区共45个种群中,有31个种群为Q型,占所测种群的68.9％,14个种群为R型,占31.1％.而且,大棚采集种群多为Q型(Q型占87.0％).结果说明Q型烟粉虱已在上海地区广泛存在、大量发生,并有取代R型烟粉虱成为上海地区烟粉虱主要危害类型的可能.     

入侵B型与Q型烟粉虱的发生及防治对策

[目的]为控制B型和Q型烟粉虱的危害提供依据。[方法]以烟粉虱为研究对象,阐述了近年来入侵我国的B型和Q型烟粉虱的危害、生物型鉴定等方面的研究,并提出了防治对策。[结果]B型烟粉虱可为害寄主植物超过500种,包括多种蔬菜、花卉和大田作物,这些作物也是重要的病毒传播媒介。在云南、浙江、北京等地区已有Q型烟粉虱存在的报道,其在浙江省曾大量发生危害。不同生物型烟粉虱很难根据形态特征来区分,分子标记能有效地区分。烟粉虱成虫和若虫常群集在叶片背面,能分泌大量的蜜露,污染叶片和果实,诱发病害发生。烟粉虱要采取多种措施防治。[结论]应重视B型和Q型烟粉虱的传播与危害,采取综合防治措施。     

几种不同类型的新型杀虫剂防治B型烟粉虱的药效试验

烟粉虱[Bemisia tabaci（Gennadius）1，又称甘薯粉虱、棉粉虱，是热带和亚热带地区的重要害虫之一。该虫可为害棉花、蔬菜和园林花卉等植物，并且能传播双生病毒，平均每年在世界各地造成的经济损失超过3亿美元。近年来，我国粉虱种群发生动态出现了明显变化，广州、连云港、台州和温州等地先后报道了B型烟粉虱人侵、大发生为害情况。这与罗晨2002年报道的烟粉虱有逐年加重危害与蔓延的趋势相吻合。为了有效控制烟粉虱为害，笔者引进新型氯代烟碱类杀虫剂20％啶虫脒等不同类型的杀虫剂，进行防治烟粉虱的药效对比试验，现将试验结果小结如下。     

橄榄星室木虱乙酰胆碱酯酶基因的克隆与序列分析

利用RT-PCR法和PCR法克隆到橄榄星室木虱乙酰胆碱酯酶基因(Ace)的2个片段,其中cDNA片段长66bp,翻译获得的氨基酸1～11位与家蝇等13种昆虫相应的序列相同或仅相差1个氨基酸,该序列在GenBank数据库中的接受号为DQ417582;基因组DNA片段长499bp,2个外显子连在一起与意大利蜜蜂等13种昆虫相应基因的氨基酸同源性均高于88%,该序列在GenBank数据库中的接受号为DQ425028。此结果为进一步研究橄榄星室木虱对杀虫剂抗性的分子机理奠定了基础。     

4种寄主植物对B型烟粉虱生长发育的影响

在实验室条件下,观察和研究了B型烟粉虱(Bamisia tabaci)在4种寄主植物(黄瓜、茄子、2种烟草品种NC-89和K-326)上的体形差异、发育历期、存活率和生命参数.结果表明,B型烟粉虱在4种寄主植物上体型、发育历期、存活率、生命参数都存在显著差异.用生命表参数综合评价,黄瓜是最适合B型烟粉虱生长和繁殖的寄主植物,烟草K-326次之,茄子最不适宜.