检测小麦线条花叶病毒的TaqMan MGB探针技术

为给小麦线条花叶病毒(Wheat streak mosaic virus,WSMV)的灵敏、稳定、快速检测提供依据,根据该病毒不同分离株外壳蛋白(Coat protein,CP)基因的保守序列,设计了特异性引物与TaqMan MGB荧光探针,建立了WSMV的实时荧光RT-PCR检测方法.结果表明,本研究设计的TaqMan MGB荧光探针对WSMV的检测具有很好的特异性,解决了因病毒不同分离物之间基因组变异较大、难以找到长片段保守序列来设计探针的困难.该方法无需任何PCR后处理.基因污染风险小.它与双抗体夹心酶联免疫检测方法相比,灵敏度提高1 000倍,具有快速、灵敏和高特异性的优点,适合于WSMV的快速检测.     

食品过敏原大豆P34蛋白基因的实时荧光PCR检测

以大豆主要过敏蛋白P34基因为靶标,采用TaqMan探针实时荧光PCR方法建立食品过敏原大豆成分的检测方法。实验表明建立的检测方法具有特异性,灵敏度高,检测限为10mg/kg。通过对市售样品的检测,该方法适用于对常见食品种类的检测,但不适用于精加工油脂等精细加工产品的检测。     

食品过敏原大豆P34蛋白的实时荧光PCR检测（简报）

本文以大豆主要过敏蛋白P34基因为靶标,采用TaqMan探针实时荧光PCR方法建立食品过敏原大豆成分的检测方法。实验表明建立的检测方法具有特异性,灵敏度高,检测限为10mg/kg。通过对市售样品的检测,该方法适用于对常见食品种类的检测,但不适用于精加工油脂等精细加工产品的检测。     

一种基因编辑位点特异性PCR方法的开发和应用

为了对基因组编辑产品进行精准定性和定量检测，以水稻SP1 基因的编辑植株为材料，在编辑位点上下 游设计通用引物，在编辑位点处设计基因编辑位点特异性TaqMan探针，建立了编辑位点特异性PCR方法。利用该 方法可准确鉴定特异基因组编辑产品，检测灵敏度达到5~10拷贝，可在实时荧光PCR（qPCR）和微滴数字PCR （ddPCR）平台上对基因组编辑产品进行定量检测。由于数字PCR的微反应单元可消除野生型DNA对通用引物的 竞争性消耗，与qPCR的定量结果相比，ddPCR定量结果具有更高的定量准确性。     

TaqMan-MGB荧光定量IC/TC-RT-PCR检测菜豆荚斑驳病毒

菜豆荚斑驳病毒(Bean pod mottle virus,BPMV)是我国重要的检疫性有害生物,BPMV传入的风险随大豆进境数量增多而加大。本文针对菜豆荚斑驳病毒,以大豆种子提取液为材料,分别建立了TaqMan-MGB荧光定量IC-RTPCR和TaqMan-MGB荧光定量TC-RT-PCR快速检测方法。根据GenBank公布的BPMV外壳蛋白基因序列,选择其保守区域,设计1对特异性引物和1条TaqMan-MGB探针,测定了TaqMan-MGB荧光定量IC-RT-PCR和TaqMan-MGB荧光定量TC-RT-PCR方法的特异性和灵敏度,并将TaqMan-MGB荧光定量IC-RT-PCR、TaqMan-MGB荧光定量TC-RTPCR、IC-RT-PCR和TC-RT-PCR 4种检测方法的灵敏度进行比较。结果表明:所建立的两种检测方法特异性良好;TCRT-PCR的灵敏度为10-1倍病毒提取液原液;IC-RT-PCR和TaqMan-MGB荧光定量TC-RT-PCR灵敏度相当,为10-3倍病毒提取液原液;TaqMan-MGB荧光定量IC-RT-PCR灵敏度最高,为10-5倍病毒提取液原液,是IC-RT-PCR和TaqMan-MGB荧光定量TC-RT-PCR检测方法的102倍,是TC-RT-PCR检测方法的104倍;两种检测方法均能较好应用于实际大豆样品的检测。本文所建立的TaqMan-MGB荧光定量IC/TC-RT-PCR检测方法利用抗原特异性或试管非特异性捕捉病毒粒子,无需提取RNA,为进境大豆种子上BPMV的检测提供了稳定、快速、简便的技术依据,其较高的灵敏度和特异性具有较好的应用价值。     

齿兰环斑病毒外壳蛋白基因的表达及其表达产物抗血清的制备

用pET－21d构建齿兰环斑病毒（ORSV）外壳蛋白基因大肠杆菌表达载体pEO。经SDS－PAGE和Westernblotting分析，含pEO的大肠杆菌正确表达了ORSV外壳蛋白基因。此表达产物为融合蛋白。用表达产物制备抗血清，并应用于间接酶联法检测ORSV，具有较高的灵敏度（10ng／mLORSV）和特异性。     

水稻抗白背飞虱基因Wbph2的初步定位

 鉴定了ARC10239/明恢63 F2群体对白背飞虱的抗性，混合F2感虫稻株的DNA，构建感虫池。应用129个RFLP探针，结合4种限制性内切酶，检测抗虫亲本ARC10239、感虫亲本明恢63和感虫DNA池的多态性。检测到6个阳性探针，分布在5个染色体上(染色体3、6、8、11和12)。应用阳性探针分析了F2群体的142个个体，发现抗虫基因Wbph2与第6染色体上的标记RZ667、RG64和RG264连锁,其中， Wbph2与RZ667的遗传距离为25.6 cM (LOD=4.50)。     

利用小麦的一套14种cDNA探针检测大麦中的RFLP

用从小麦cDNA克隆中得到的一套14种探针,研究了6个大麦品种中的限制性酶切片段长度多态性(RFLP)。这些品种的多态性程度在2种探针及不同限制性内切酶间的变化很大。有2种探针揭示了在所有探针的或酶的结合物中的高度多态性,但14种探针中的7种未能揭示RFLP现象。据全部的840个配对结合物的比较研究表明,其多态性的平均程度为14%,这比在小麦中的高些,但比玉米、水稻、马铃薯和莴苣中的低些。检测RFLP的大多数探针都相应地位于小麦染色体长臂位点上。     

GICA-RT-PCR检测菜豆荚斑驳病毒的新方法

菜豆荚斑驳病毒(Bean pod mottle virus,BPMV)是我国进境植物检疫性有害生物.为解决普通RT-PCR不能直接检测大豆病种子中该病毒的问题,将简便快速的胶体金免疫层析技术(GICA)和高灵敏度的普通RT-PCR检测技术有机地结合起来,建立了GICA-RT-PCR检测新方法.即先用GICA捕获病毒,将捕获的病毒直接进行RT-PER扩增,简化了检测的步骤,提高了检测的灵敏度.结果表明:用该方法检测提纯病毒灵敏度达到0.01μg·mL-1、检测大豆病叶和病大豆种皮,灵敏度达到10-4,分别比GICA检测提高了20倍、10倍和100倍.GICA-RT-PCR可进一步确认GICA的结果.     

抗虫耐除草剂玉米瑞丰125 RPA快速检测方法的建立

瑞丰125为农业农村部首批获得生产应用农业转基因生物安全证书的抗虫耐除草剂转基因玉米之一。为给监管转基因生物安全提供支撑，利用重组酶聚合酶扩增（recombinase polymerase amplification, RPA）技术，针对瑞丰125的转化体插入位点序列设计了引物并进行筛选，对反应的温度、时间和引物浓度进行了优化。结果显示，RPA体系在30～45℃范围内，20 min即可有效扩增，比PCR检测时间大大缩短。引物浓度会影响RPA的扩增效率，引物终浓度为0.35μmol/L时扩增效果最好。同时对RPA检测方法的特异性、灵敏度等进行考察，结果表明该检测方法的特异性良好，检测灵敏度可达到36拷贝。该恒温快速的检测方法为瑞丰125的快速检测提供依据，为商业化转基因作物的监管提供支撑，有望用于转基因成分的现场快速检测。     

油菜品种和资源材料 对芜菁花叶病毒的抗性鉴定

在人工接种高病害压条件下,对当前生产上应用的13个油菜双低和杂交品种及14份资源材料进行了 对芜菁花叶病毒( TuMV)的抗性鉴定。结果表明,参试的13个油菜品种均不抗TuMV,但感病性低于对照品种中油 821。14份油菜资源材料间抗性差异显著,有3份材料表现高抗和中抗。大部分油菜推广品种表现的高发病率和 病情指数表明在病害流行地区和年份,这些品种不足以抵挡病毒病造成的损失。     

油菜芜菁花叶病毒株系鉴定

芜菁花叶病毒是引起我国油莱病毒病的主要毒原。在我国南方冬油菜产区采集了数百个芜菁花叶病毒(TuMV)病株样品,经寄主鉴定和毒原纯化后,选择具有代表性的分离物30个,通过Provvidenti的一套鉴定品种进行株系鉴定,并用酶联免疫吸附测定(ELISA)双抗体夹心法检测以及寄主范围试验,鉴定出三个不同株系即TuMV—CRL、TuMV—CR2和TuMV—CR3。除TuMV—CR3与Provvyidenti,R.在纽约和Green,S.K.在台湾对十字花科蔬菜上TuMV鉴定的五个株系中的TuMV—C1株系相同外,余均不同;与我国以往各地对十宇花科作物上TuMV株系鉴定的结果比较,由于国内鉴定工作未用此同样的鉴定方法进行鉴定,因此尚不能肯定油菜上的三个株系与国内已经鉴定的十字花科蔬菜上的株系的异同。     

PVX病毒载体介导2种马铃薯Y病毒科病毒VPg蛋白表达诱导烟草叶片系统坏死的研究

芜菁花叶病毒（Turnip mosaic virus, TuMV）和槟榔坏死环斑病毒（Areca plam necrotic ringspot virus, ANRSV）是马铃薯Y病毒科（Potyviridae）中分别可诱导十字花科作物和槟榔产生坏死病症的2种不同属病毒。VPg（Viral protein genome linked）作为与马铃薯Y病毒科病毒基因组5′端的结合蛋白,在病毒复制、翻译和运动等侵染过程中发挥重要作用。本研究利用In-Fusion克隆策略分别构建了可表达3′端融合Strep蛋白标签序列的ANRSV和TuMV VPg全长编码基因的马铃薯X病毒（Potato virus X, PVX）载体pPVX-VPg-AR和pPVX-VPg-Tu。通过农杆菌渗透注射接种本生烟（Nicotiana benthamiana）,利用RT-PCR、Strep蛋白标签亲和层析和Western blot等方法证明了PVX病毒载体能够介导VPg-AR和VPg-Tu蛋白在本生烟中系统表达,且发现这2种VPg蛋白的过量表达诱导本生烟叶片产生了不同程度的系统性坏死病症。进一步采用DAB和NBT染色,在产生坏死症状叶片中检测到大量活性氧（reactive oxygen species, ROS）的积累。因此,推测VPg可能是TuMV和ANRSV诱发植物病症产生的一个决定因子,为后续研究这2种病毒诱导症状形成机制奠定了基础。     

芜菁花叶病毒的分离鉴定

从海南儋州地区的白菜病株上获得一个病毒分离物,经症状观察,电镜观察,理化性质分析及血清学检测,被鉴定为芜菁花叶病毒。     

芝麻病毒病类型及发生分布调查

依据病害症状不同，将我国芝麻病毒病划分为三种类型：黄花叶型、普通花叶型和混合型（皱缩花叶、黄化）。黄花叶和普通花叶病毒病广泛发生在湖北、河南芝麻产区和北京密云芝麻零星种植区。混合型病害仅１９９０年在本所农场局部地块发现。采用酶联免疫血清试验方法，检测１５２个黄花叶样品，与花生条纹病毒抗血清阳性反应率８３．６％，４４个普通花叶样品，与芜菁花叶病毒抗血清阳性反应率６１．４％。     

水稻抗稻瘟病基因Pi-ta共显性分子标记的建立

 根据抗病基因Pi-ta和感病等位基因pi-ta在DNA序列上的单核苷酸长度多态性（single nucleotide length polymorphisms，简称SNLP）设计了3个特异性引物YL155、YL183和YL200，并分别用蓝色和绿色染料将YL155和YL183进行标记，而YL200不标记。在一个PCR反应中同时加入这3对引物，并应用ABI自动分析仪对PCR产物进行分析，结果发现，抗病基因Pi-ta纯合的样品获得一个峰值为181 bp的图谱，感病等位基因pi-ta纯合的样品获得一个峰值为183 bp的图谱，而抗病基因Pi-ta处于杂合状态的样品出现两个峰。由此建立了水稻抗稻瘟病基因Pi-ta的共显性分子标记。以杂交组合Katy/RU9101001的12个F2单株和15个水稻品种为材料，利用已建立的显性分子标记和稻瘟病菌人工接种试验对共显性标记的正确性进行了验证，结果发现三者的实验结果完全吻合，因此该共显性标记可应用于水稻抗病基因Pi-ta的分子标记辅助选择。     

芜菁花叶病毒外壳蛋白基因的克隆与序列分析

根据芜菁花叶病毒（Ｔｕｒｎｉｐ Ｍｏｓａｉｃ Ｖｉｒｕｓ ＴｕＭＶ）外壳蛋白（ＣＰ）基因序列人工合成引物，用ＲＴ法合成ｃＤＮＡ后，通过ＰＣＲ法扩增并克隆ＴｕＭＶ海南分离物外壳蛋白基因。结果表明，外壳蛋白基因全长８６４个碱基，编码２８８个氨基酸。与Ｔｒｅｍｂｌｙ，Ｍ．Ｆ等报道的该苷酸同源率为９５．８％，氨基酸同源率为８４．８％。与徐平报道的核苷酸同源率为９６．３％，氨基酸同源率为９５．１％。与孔令洁     

芸薹属油菜种质资源抗(耐)菌核病、病毒病的鉴定

芸薹属油菜种质资源抗(耐)菌核病、病毒病的鉴定结果表明:1.抗菌核病的基因主要存在于B和C染色体组,抗芜菁花叶病毒(TuMV)的基因主要存在于C染色体组。2,农艺性状与抗菌核病性存在相关;B.campestris有效分枝点高度、B.carinata的株高、有效分枝点高度与抗性指标RRA分别呈显著和极显著正相关,B.juncea二次有效分枝数与RRA呈显著负相关,B.napus的上述性状与RRA相关不显著。3.油菜单株产籽量和产油量随病情加重而下降,达显著或极显著程度。     

Physiological changes during seed development of cuphea

Cuphea (Cuphea viscosissima Jacq. x C. lanceolata W.T. Aiton, PSR23) is a new oilseed being developed in the north-central USA. Cuphea oil is high in medium-chain fatty acids suitable for detergent/cleaner applications and has potential for use in cosmetics. The objectives of this study were to determine the effect of seed development on seed moisture, weight, oil content, fatty acid composition, germination, and vigor. Two thousand cuphea flowers were tagged at anthesis in the field each year at Prosper, ND, in 2004, 2005, and 2006. Each flower that developed into a seed capsule was tagged and labeled with the date of anthesis. Two hundred developed capsules from the labeled flowers were harvested at 3 to 4-day intervals from 5- to 35 days post anthesis corresponding with 37 to 295 growing degree days (GDD). The GDD were calculated using a base temperature of 10 °C. Seed development required approximately 253 GDD or 30 days post anthesis to reach physiological maturity. Maximum seed germination was reached at 33 days post anthesis. Seed oil content increased and oil composition changed as seed matured. Seed oil was high in linoleic and palmitic acids from 0 to 10 days post anthesis and declined thereafter while capric acid began to accumulate at 10 days post anthesis and reached above 70% at physiological maturity.     

两株银杏内生拮抗细菌菌株的鉴定及生防功能基因研究

从表面消毒的银杏叶片中获得两株具有广谱拮抗活性的内生细菌菌株Zy25和Hy7；应用绿色荧光蛋白GFP基因标记该拮抗菌株,培养的菌液摩擦接种银杏叶片,分离结果表明两个菌株可在银杏叶片内稳定定殖；通过形态观察、生理生化指标测定及16S rDNA和DNA gyrase B subunit(gyrB)基因序列同源性分析,鉴定两个菌株为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)；利用特异引物对菌株的生防功能基因进行扩增,结果表明:bmyB、fenD、ituC、srfAA、srfAB、bioA、yngG和yndJ基因簇的片段在两个菌株中均存在,表明生防菌株Zy25和Hy7可能具有合成脂肽类物质的能力.