甘蔗中性/碱性转化酶基因(SoNIN1)的克隆和表达分析

中性/碱性转化酶(Alkaline/Neutral Invertase)能不可逆地催化蔗糖分解为葡萄糖和果糖, 在植物生长发育中起重要作用。本研究采用RT-PCR和RACE技术从甘蔗品种GT28心叶中克隆到甘蔗中性/碱性转化酶基因全长cDNA序列, 基因命名为SoNIN1。该基因全长2289 bp (GenBank登录号为JX109944), 开放阅读框为1812 bp, 编码603个氨基酸, 相对分子量为67.79 kD, 等电点为6.41。具有中性/碱性转化酶保守结构域, N-端不含跨膜结构和信号肽。其编码氨基酸序列与玉米、水稻和黑麦草的亲缘关系较近, 属于同一进化分支。利用染色体步移技术克隆到SoNIN1基因5¢侧翼启动子序列, 长度为1174 bp (GenBank登录号为KC854419)。启动子序列含有多个CAAT-box和TATA-box等基本作用元件, 参与分生组织特异性激活, 参与干旱诱导的MYB结合位点, 脱落酸、茉莉酸甲酯和赤霉素响应等作用元件。利用实时荧光定量PCR技术, 在生理成熟期甘蔗茎、叶、花序和芽中均能检测到SoNIN1的表达, 其表达量在叶中最高, 芽中次之, 而在+1节间最低。苗期根和叶中SoNIN1基因都受PEG和NaCl诱导表达。     

茶树中性/碱性转化酶基因CsINV10的克隆与表达分析

基于课题组前期对茶树冷驯化系统的转录组测序分析结果,从中挑选出6条与中性/碱性转化酶基因高度相似的EST序列,电子拼接和RT-PCR验证后获得一条全长为2101 bp的核酸序列。该基因包含1923 bp的ORF,编码640个氨基酸,蛋白分子量为71. 8 kD,理论等电点（pI）为5.69。根据BlastX同源性比对显示该基因与荔枝LcNI相似性最高（80%）,为G100家族成员,属于中性/碱性转化酶基因,将其命名为CsINV10（GenBank登录号为KT359348）。对CsINV10氨基酸序列的系统进化树分析显示,其与木薯MeNINV8亲缘关系最近。进一步分析显示,CsINV10的氨基酸序列无N端信号肽,无跨膜结构域,属于亲水性蛋白,并定位在叶绿体上。荧光定量PCR分析表明,CsINV10具有组织表达特异性,在茶树叶和花中的表达量最高,根系中最低。分析发现,低温（4℃）、干旱和盐胁迫分别处理茶树1 d后,成熟叶片中CsINV10的表达呈逐渐上升趋势;而在ABA条件处理下,该基因呈先升高后降低趋势,在处理5 d后基本不表达,表明该基因可能参与茶树对多种逆境胁迫的响应,这为后续进一步研究转化酶基因在茶树抗寒等逆境胁迫中的作用奠定基础。     

甘蔗细胞壁蔗糖转化酶基因SoCIN2的克隆和表达分析

细胞壁蔗糖转化酶(CIN)主要参与韧皮部质外体的蔗糖卸载,在调控果实发育中起作用。为探究CIN在调控甘蔗糖分积累过程中的作用,本试验从低糖甘蔗品种B8中克隆到一个1个CIN基因,命名为SoCIN2基因。结果显示,SoCIN2基因全长为2 269 bp,其中开放阅读框为1 857 bp,编码618个氨基酸。So CIN2蛋白分子量为67.59 kD,理论等电点为5.25;定位于细胞壁上,不含信号肽序列;具有保守的NDPNG、FRDP和MWECP结构域,属于糖基转移酶GH32家族。系统进化分析表明,甘蔗SoCIN2蛋白与高粱SbCIN2遗传距离最近。荧光定量PCR结果表明,在甘蔗根、茎、叶和芽中SoCIN2基因均表达,其中在叶中基因表达量最高,茎中最低。甘蔗+1叶中SoCIN2基因表达量显著高于茎中。在伸长期和成熟期,茎中SoCIN2基因的表达模式相同,成熟茎中基因表达量显著高于未成熟茎中基因表达量,表明SoCIN2基因可能在调控甘蔗成熟茎中蔗糖积累中起作用。     

铁皮石斛DoSAMDC-like基因的克隆及原核表达

本研究从药用植物铁皮石斛中克隆得到S-腺苷甲硫氨酸脱羧酶(S-adenosyl-L-methionine decarboxylase)基因(DoSAMDC-like)并进行序列分析和原核表达。SAMDC基因家族具有多个成员,本研究采用同源克隆的方法对铁皮石斛中尚未报道的新成员DoSAMDC-like基因进行克隆,并与拟南芥SAMDC基因家族成员和铁皮石斛基因组注释序列进行比对分析、蛋白质特征及原核表达等分析。基因序列分析表明,DoSAMDC-like基因编码区全长1104 bp,推测编码368个氨基酸,氨基酸序列具有SAM_decarbox超家族共同的保守结构域。多序列比对及进化树结果表明,克隆获得的DoSAMDC-like基因序列对应于基因组测序注释的XM_020825443.2序列,一致性为99.55%,与铁皮石斛SAMDC1基因一致性为80.16%。异源表达结果表明,DoSAMDC-like基因受IPTG诱导,蛋白分子量约为47 kD。DoSAMDC-like基因的克隆和原核表达,可为参与铁皮石斛多胺代谢、生物碱合成相关基因的蛋白质生化活性等研究提供了帮助。     

利用CRISPR/cas9技术研究铁皮石斛Csl4基因的功能

为了研究铁皮石斛类纤维素合成酶基因的功能和利用类纤维素合成基因培育低纤维素新品种提供基础,本研究通过从铁皮石斛转录组中选取茎中表达量较高的类纤维素合成酶DeCsl4基因,利用CRISPR/Cas9技术构建敲除载体,获得了Csl4基因突变株.测序结果表明,目的基因靶位点序列发现有7个碱基的缺失,其中2个碱基因缺失发生在外...     

甘薯细胞壁蔗糖转化酶基因IbCWIN家族成员鉴定及表达分析

甘薯是重要的粮食、饲料、工业原料作物和新型的生物能源作物,细胞壁蔗糖转化酶是植物源、库组织蔗糖代谢的关键酶,但关于甘薯细胞壁蔗糖转化酶基因IbCWIN家族成员的研究尚未见报道。本研究测定供试品种不同组织部位的蔗糖淀粉含量,利用生物信息学方法对IbCWIN基因家族的理化性质、保守结构域、系统进化关系、启动子作用元件、组织特异性表达模式进行分析。结果表明,甘薯茎中蔗糖含量最高,须根和叶次之,块根最低;块根淀粉含量最高,极显著高于其他部位。甘薯中含有10个IbCWIN基因,编码氨基酸442～1115个,蛋白质分子量范围49.56～124.44kD,等电点为5.0～9.1。分布在8条染色体上,都含有Glyco₃2保守结构域及相同或相似的保守基序motif,属于糖基水解酶基因家族GH32。IbCWIN与木薯MeCWINV同源性高, IbCWIN基因家族启动子区域含有多种类型的顺式作用元件。qRT-PCR结果表明,IbCWIN基因家族在甘薯不同组织中均有表达且有多种表达模式,其中IbCWIN2和IbCWIN9在块根中表达量显著高于其他组织部位。本研究为下一步探索甘薯IbCWI...     

铁皮石斛的“江湖”轶事

名动江湖。笑傲江湖,江湖险恶,相忘江湖……从粉墨登场到风光不再,铁皮石斛可算占尽风流。让它风流的是人,让人推波助澜的是利益。随着它的大起大落,人性的善恶也被抖落无余。俱往矣,数风流“植物”,还看今朝。     

铁皮石斛的药理作用及其保健食品研发进展

铁皮石斛为我国传统名贵中药材,综述了铁皮石斛的药理作用,并分析了以铁皮石斛为原料的保健食品的开发现状,以期为铁皮石斛相关产品的研发提供科学依据.     

橡胶树中碱性转化酶HbNIN9表达及酶学特性分析

转化酶作为蔗糖分解代谢的关键酶,在植物生长发育、生物与非生物胁迫响应等生理过程中发挥重要作用。基于对橡胶树不同组织转录组数据库的分析,本研究克隆了一个在橡胶树种子中有较高丰度表达的中碱性转化酶基因HbNIN9;系统进化分析和在线软件预测均显示其亚细胞定位为线粒体,属于中碱性转化酶α亚族成员;利用原核表达体系成功获得Hb NIN9优化表达的重组蛋白,优化表达的诱导条件为0.5 mmol/L IPTG,25℃培养6 h;酶学特性分析表明,HbNIN9蛋白酶活反应的最适温度为45℃,最适pH值为7.5,米氏常数Km值为18.09 mmol/L。本研究从蛋白水平证实了Hb NIN9为典型的中碱性转化酶,有助于深入揭示线粒体型转化酶在橡胶树种子糖代谢中生理功能,丰富橡胶树中碱性转化酶家族成员的生理生化研究。     

铁皮石斛CIPK24与CBL1的互作及盐胁迫下的表达分析

为研究铁皮石斛(Dendrobium catenatum Lindl.)应对盐胁迫的抗性机制,利用PCR技术从铁皮石斛cDNA中克隆丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶基因CIPK24和类钙调素B亚基蛋白基因CBL1,用生物信息学技术对其编码蛋白的进化关系进行了分析;采用实时荧光定量PCR技术分析它们的表达模式;并构建酵母表达载体,利用酵母双杂交技术研究这两个蛋白的互作关系。结果表明,铁皮石斛CIPK24和CBL1分别与拟南芥CIPK24以及CBL1蛋白的亲缘关系最近;空间表达模式分析发现CIPK24和CBL1基因在花萼、合蕊柱等生殖器官中表达量较高,而在营养器官中表达量较低;盐处理铁皮石斛组培苗后,CIPK24在根中受盐胁迫诱导上调表达,在茎和叶中表达量变化不明显;而CBL1基因在根和叶中受盐胁迫诱导均呈现上调表达,且根中CIPK24和CBL1基因的表达模式相似。酵母双杂交结果表明铁皮石斛CIPK24和CBL1蛋白能够互作。本研究表明,根中CIPK24和CBL1通过互作可能在铁皮石斛响应盐胁迫中起到重要作用,为进一步研究铁皮石斛耐盐性提供理论参考。     

江西龙虎山10种铁皮石斛的品质测定及分析

为了分析龙虎山铁皮石斛资源的品质,对DNA条形码技术鉴定的10种铁皮石斛茎叶的4种营养成分(多糖、甘露糖、生物碱和蛋白质)和2种重金属元素(砷和镉)的含量进行测定,并采用主成分分析对铁皮石斛品质进行综合评价,运用聚类分析对铁皮石斛进行分类.结果 显示:成熟的铁皮石斛中,茎和叶的多糖含量范围分别为35.09％～49.59％和6.88％～14.05％,甘露糖含量范围分别为16.19％～25.12％和11.10％～16.88％,生物碱含量范围分别为0.158‰～0.251％‰和0.022‰～0.053‰,蛋白质含量范围分别为2.72％～4.38％和12.73％～18.38％;铁皮石斛(包括茎和叶)砷和镉含量最高值分别为1.892 mg/kg和0.234 mg/kg;人工种植铁皮石斛的营养成分总体高于野生铁皮石斛,铁皮石斛的叶具有一定的利用价值;野生与人工种植铁皮石斛砷、镉均未超标;铁皮石斛的6种测定成分可以用2种主成分(累积方差贡献率为98.443％)来表示,主成分分析综合得分最高的为米斛.本研究为龙虎山铁皮石斛的利用与开发提供了理论依据.     

不同品系铁皮石斛组培苗农艺性状比较分析

对浙江大金、贵州德卧、贵州龙广、云南文山等4个不同品系铁皮石斛的株高、茎长、茎粗、叶片数、根数、重量等农艺性状进行调查分析,并对相同时间的各指标增长量进行比对分析,旨在为铁皮石斛的优质品种选育提供理论依据.结果表明,各个品系铁皮石斛农艺性状间存在一定差异,茎的性状与茎粗、根长极显著相关;不同品系之间的营养需求量存在较大...     

铁皮石斛复合饮料的研制

以铁皮石斛鲜条为主料,枳椇、葛根、枸杞等为辅料,通过单因素和正交试验筛选铁皮石斛复合饮料的配方,并对复合饮料的多糖、氨基酸及矿质元素含量进行测定。结果表明,铁皮石斛复合饮料的最佳配方为:每400 m L铁皮石斛提取液,添加枳椇提取液20 m L、葛根提取液20 m L、枸杞提取液30 m L、白砂糖70 g·L-1、柠檬酸0.3 g·L-1、黄原胶0.02 g·L-1,在25 MPa压力条件下先后均质2次,8 min/次,蒸汽杀菌20 min。制得的复合饮料多糖含量达3 770 mg·L-1,氨基酸总含量达384.39 mg·L-1,矿质元素总含量达184.93 mg·L-1,色泽呈青绿色,具有铁皮石斛和枳椇的清香,口感顺滑细腻,是一款风味独特、成分丰富的新型复合饮料。     

铁皮石斛原球茎的富硒培养条件优化

采用响应面分析方法优化铁皮石斛原球茎富硒条件,首选利用Plackett-Burman试验进行因素的显著性分析,筛选出具有显著效应的3个因素:硒浓度>培养时间>光照强度;再通过最陡爬坡试验逼近其最大响应区域,最后通过BoxBehnken试验对其进行优化,得到最佳条件为硒浓度、培养时间、光照强度分别为0.31mg/L、58.87d、1 834.09lx,原球茎硒含量预测值为4.72mg/kg。     

不同有机物对铁皮石斛试管苗生长发育的影响

研究不同有机物浸提液对铁皮石斛试管苗生长的影响。在相同的培养条件下,以8种含有不同有机物的培养基培养试管苗,60d后对试管苗的各种性状进行记录统计,并与对照(没加有机物提取液)进行比较分析。结果不同的有机物浸提液对试管苗的影响效果不一样。壮苗以加入白萝卜提取液、CH和CM为佳,生根以加入香蕉提取液为佳,要提高繁殖系数以不加有机物为佳。     

木薯碱性/中性转化酶MeNINV1基因启动子的克隆及激素应答表达分析

为了解木薯碱性/中性转化酶基因MeNINV1对激素的应答模式及调控机制本研究采用PCR技术,从木薯基因组中分离出MeNINV1基因启动子序列。分析结果显示该启动子长度1 714 bp,含有TATA box和CAAT box保守元件,以及四个激素响应元件:ERE(乙烯应答)、ABRE(ABA应答)、TAC-element(SA应答)和P-box(GA应答)。根据启动子上存在的参与激素应答相关的顺式作用元件信息,选用30μmol/L GA3、30μmol/L ABA、100μmol/L SA和1%乙烯利四种外源激素胁迫处理木薯SC8组培苗,利用实时荧光定量PCR技术,研究MeNINV1基因在不同激素处理下的表达模式。结果表明,MeNINV1基因的表达受激素的调控,因此推断碱性/中性转化酶基因MeNINV1启动子上的激素应答元件响应激素诱导,调控基因的表达。研究结果为进一步研究激素信号如何调控木薯块根蔗糖的分解代谢提供理论基础。