PRRSV广西分离株GXYL-1403全基因克隆与序列分析

对本实验室所分离的1株猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)毒株GXYL-1403进行全基因组克隆和序列分析。参考已发表的扩增全长PRRSV序列的13对特异性引物,用RT-PCR方法对病毒基因组进行分段扩增。将扩增得到的PCR片段克隆到pMD18-T载体上,获得的重组质粒经PCR鉴定后进行序列测定。通过软件对所扩增序列进行拼接,获得GXYL-1403的全长序列,并对GXYL-1403进行比较和遗传进化分析。结果表明GXYL1403株基因序列全长为15 018bp,与国内外多株PRRSV毒株进行同源性比较发现,与VR-2332的相似性为89.1%,与TJ、JXA1、HEB1、HUB1、HUB2、TP株同源性达到了97.9%~98.1%。另外,GXYL-1403分离株nsp2蛋白含有高致病性PRRSV特异的1+29个氨基酸的缺失。特别重要的是,在缺失29个氨基酸区域的上游,含有连续20个氨基酸缺失,在下游出现了连续74个氨基酸的缺失。遗传进化分析发现美洲型PRRSV主要分为3个亚群,GXYL-1403跟高致病性PRRSV毒株属于同一分支,证实了GXYL-1403株为美洲型PRRSV毒株。     

PRRSV天津分离株Nsp2基因的克隆和遗传进化分析

从天津市病猪中分离得到3株猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV),分别命名为TJ-S1、TJ-S2和TJ-S3。根据GenBank中PRRSV BJ-4株的基因序列设计并合成针对Nsp2基因高变区的引物,RT-PCR扩增目的基因并将其克隆到pGEM-T载体进行测序,并与国内外已发表的毒株序列进行比较。结果表明,3个毒株都是美洲型PRRSV,而且TJ-S1、TJ-S2株的Nsp2基因发生30个氨基酸的不连续缺失;基因系统发育树分析表明,TJ-S1株、TJ-S2株与HuN株、SD-14株的亲缘关系很近,TJ-S3株与CH-1a株的亲缘关系较近。     

河北省PRRSV流行毒株的分离鉴定

为了全面调查猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)在河北省的流行情况,本研究共收集河北省833份病死猪临床样品,利用RT-PCR方法对其进行PRRSV检测,共检出419份阳性病料,阳性率高达50.3%。其中NADC30-like PRRSV阳性率为49.1%;HP-PRRSV阳性率为3.1%;经典株PRRSV没有检出;HP-PRRSV和NADC30-like PRRSV共感染样品为16份,共感染率为1.9%。此外,本研究成功地分离到3株NADC30-like毒株,并测通其全基因组序列,与国内外流行毒株进行序列比对和基因重组分析发现,这3个毒株中的QHD1株为重组毒株,亲本可能为PRRSV NADC30毒株和疫苗株RespPRRS MLV,2处重组分别位于7 913～8 015nt和12 780～13 158nt处。本研究为河北省PRRSV的深入研究和防控奠定了基础。     

一株类NADC30猪繁殖与呼吸综合征病毒的全基因组序列分析

为监测猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)流行毒株的基因变异情况,采用RT-PCR方法对某猪场疑似患有猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)的猪组织样品进行鉴定,测序获得全基因,并对该毒株的NSP2基因缺失特征同源性和遗传进化及重组情况进行分析。结果显示:该猪场感染猪体的病原体为PRRSV,该毒株被命名为180404-2fei;180404-2fei毒株的NSP2区存在131(111+1+19)个氨基酸的不连续缺失,与报道的类NADC30毒株缺失特征一致;180404-2fei的NSP2基因与NADC30毒株核苷酸和氨基酸同源性分别为92.2%和90.1%,180404-2fei毒株的ORF5基因与NADC30的核苷酸及氨基酸序列同源性分别为93.5%和92.0%;遗传进化和重组分析结果表明,180404-2fei毒株属于NADC30-Like亚群,可能是由NADC30与HP-PRRSV重组而来。本研究通过对一株类NADC30 PRRSV的全基因组序列进行分析,为研究PRRSV的遗传变异和PRRS的防控提供了参考依据。     

2016-2017年我国华北地区猪繁殖与呼吸综合征病毒类NADC30毒株分子遗传演化分析

为了解我国华北地区类NADC30流行猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)及遗传变异情况,本研究自2016~2017年采集华北四省市(北京、天津、山东及河北)部分猪场疑似PRRSV样品239份进行RT-PCR检测,对所有阳性样品的ORF5基因测序分析及部分阳性样品病毒分离,并选择1株基因缺失病毒TJjh1602株进行全基因的序列扩增及分析.结果显示:PRRSV检测总阳性率44.35%(106/239),遗传进化显示52.83%(56/106)的流行毒株与类NADC30相近且位于系谱1(lineage 1),其中32.14%(18/56)的类NADC30流行毒株具有相同特征性的氨基酸位点缺失;TJjh1602株全基因长度为15018 nt,与NADC30同源性为95.2%,除具有上述特征性氨基酸位点缺失外,无其他插入或缺失.研究结果推测PRRSV类NADC30毒株在我国华北地区广泛流行,同时已遗传演化成一类具有ORF5缺失分子标签的新型类NADC30毒株,提示需进一步加强对PRRSV新型缺失毒株的流行病学调查及相关致病力研究.     

PRRSV浙江分离株Nsp2基因序列分析

猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)临床上主要表现为流产、早产、死胎、仔猪成活率下降和育成猪呼吸系统病变等.本研究用RT-PCR对2008年-2009年采集于浙江省部分发病猪场的41株疑似猪繁殖与呼吸综合征病猪的脾、肺、淋巴结混合组织样本进行PRRSV病毒检测和Nsp2基因序列分析.结果显示,41株PRRSV流行毒株中20份...     

猪繁殖与呼吸综合征病毒国内分离经典株与变异株的全基因组序列分析

通过分段设计引物,对猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)LX、JX株基因组进行RT-PCR扩增,对各片段cDNA进行克隆和序列测定,拼接后获得全基因组序列。结果,PRRSV LX株全基因组序列长度为15 412 bp(不包括PolyA尾),PRRSV JX株全基因组序列长度为15 320 bp(不包括PolyA尾)。序列分析表明,JX株全基因组核苷酸序列与LX株、JXA1、VR2332、CH-1a、BJ-4、LV同源性分别为91.1%、98.6%、91.0%、94.6%、90.9%、61.7%;LX株全基因组核苷酸序列与JX株、JXA1、VR2332、CH-1a、BJ-4、LV同源性分别为91.1%、89.7%、99.7%、91.5%、99.7%、62.2%。对不同分离株的5′-UTR、Nsp2进行了序列比较,并根据5′-UTR、Nsp2、ORF5的基因序列和氨基酸序列,对国内外分离株进行了系统进化分析。根据5′-UTR核苷酸序列,可将PRRSV美洲型毒株分为4个亚群,LX株和JX株分别属于经典美洲型和"高热病"变异型。根据Nsp2氨基酸序列分析了不同分离株的分子进化关系,表明依据Nsp2序列美洲型分离株可初步划分为5个亚群,JX株独立于其他毒株,独自处于一个分支。依据ORF5序列也可将美洲型分离株划分为5个亚群。本研究为探讨PRRSV的分子进化奠定了基础。     

PRRSV河北地方分离株ORF5基因序列分析

为了分析河北秦皇岛和唐山部分地区流行的猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)ORF5基因变异情况,对采集自秦唐部分地区在2009年的临床发病猪肺组织,提取其RNA,通过RT-PCR扩增样本中PRRSV的ORF5全序列,并对其进行生物信息学分析.应用DNA Star软件分析序列,系统进化分析表明,它们与国内2006年-20...     

江苏地区部分猪场猪繁殖与呼吸综合征病毒遗传变异分析

为准确了解当前猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)毒株流行趋势和变异,为疫苗研发和使用提供借鉴依据,本研究针对江苏地区部分猪场开展了PRRSV毒株调查。本次调查结果显示,NADC30毒株为优势流行毒株类型。同时,对各毒株主要结构蛋白编码区域ORF5序列进行进化分析,各毒株与经典株VR-2332同源性为83.3%～85.2%,与NADC30毒株同源性为92.4%～92.9%。Nsp2氨基酸序列分析结果显示,Ⅱ/JS2026/2021、Ⅱ/JS2030/2021、Ⅱ/JS2042/2021毒株,与PRRSV经典株VR-2332比对,均存在131个(111+1+19)非连续性氨基酸缺失;Ⅱ/JS1994/2021、Ⅱ/JS2026/2021毒株出现136个(111+5+1+19)氨基酸缺失的新特征。Ⅱ/JS1994/2021和Ⅱ/JS2040/2021毒株全长序列重组分析显示,它们均存在重组现象。其中,Ⅱ/JS2040/2021毒株在40～1 190核苷酸位置存在重组,Ⅱ/JS1994/2021毒株在1～1 482核苷酸位置和11 240～12 154核苷酸位置存在重组。     

2株猪繁殖与呼吸综合征病毒的分离、鉴定及遗传进化分析

Two strains of porcine reproductive and respiratory syndrome viruses (PRRSV) were isolated from serum of some pig farms in Guangdong province and showed PRRSV positive in RT-PCR testing. The two viruses could passage stably and cause typical cenotaphic effect, they were named as LZ-GD and LB-GD. The analysis of variable region sequences of ORF5 and Nsp2 of the two viruses showed that LZ-GD and LB-GD strains were far to Europe strain Lelystad, the homology of nuclear nucleotide sequence were 63.5% and 63.8%, respectively, with classic American strain VR-2332 were 88.7% and 89.1%, respectively, and that with highly pathogenic JXA-1 strain were 99.2% and 99.3%, respectively. There were 30 amino acids deletion in Nsp2. It shared the deletion with JXA-1, HUN4 and other pathogenic variant. Thus, the two strains of PRRSV belonged to highly pathogenic American type.     

一株重组类NADC30猪繁殖与呼吸综合征病毒的分离鉴定及基因组分析

为分离上海地区猪繁殖与呼吸综征病毒（PRRSV）并分析其分子遗传进化关系,对来自该地区某猪场疑似PRRSV感染病猪的2份肺样进行RT-PCR检测,阳性样品接种猪肺泡巨噬细胞(PAMs),将盲传3代后出现细胞病变的PAMs经间接免疫荧光鉴定,通过RT-PCR扩增分离株全基因组序列,测序后与GenBank登录的参考株全基因组序列进行同源性及遗传进化分析,分析了分离株Nsp2、GP5氨基酸序列的遗传进化关系,并对分离株做了重组分析和细胞嗜性试验。结果显示,成功分离出1株PRRSV,命名为SH2019,其全基因组开放阅读框大小为14677 bp,分离株与NADC30的核苷酸同源性最高,属于目前流行于中国的类NADC30 PRRSV,其Nsp2存在131个氨基酸缺失的分子特征;分离株是以谱系1毒株为主要亲本,以谱系3、谱系5或谱系8毒株为次要亲本,在12601~12901 nt(ORF2~ORF4)发生了基因重组的重组毒株,分离株不能感染Marc-145细胞。本研究分离鉴定一株重组类NADC30 PRRSV,可为该地区猪繁殖与呼吸综合征的防控提供参考。     

广西猪繁殖与呼吸综合征病毒流行株的分子流行病学调查及防控策略

为了解广西地区猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)流行毒株的遗传变异情况和发展趋势,通过RT-PCR方法,对2015年1-8月份采自广西省各规模猪场的疑似样品进行PRRSV检测,并对阳性病料进行基因测序分析。结果显示:84份疑似样品中有40份检测为阳性,阳性率为47.6%,通过完整的ORF5基因序列遗传进化分析表明,广西地区流行毒株主要为美洲型PRRSV,且均与高致病性PRRSV高度同源。广西省各规模猪场毒株与2015年7月份采自广东肇庆某规模猪场的PRRSV分离毒株间的同源性均较低,经序列对比发现,广东肇庆分离毒株与美洲流行毒株NADC 30高度同源。结果表明,广西地区主要流行毒株为美洲型高致病性PRRSV毒株,且与美洲流行毒株NADC30同源性较低,但广东地区已出现美洲流行毒株NADC30,提示广西地区需加强对PRRSV流行及变异的监测,以及采取有效防控策略的必要性。     

2022年浙江省PRRSV流行毒株ORF5基因序列遗传进化分析

为了解2022年浙江省猪繁殖与呼吸综合征病毒（porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV）流行毒株的基因型及变异情况,采用RT-PCR方法,对浙江省不同地区收集的37份PRRSV阳性病料组织进行ORF5基因扩增,应用DNAstar和Mega 7软件进行同源性和遗传变异分析。结果显示：37份阳性样品的ORF5基因核苷酸和编码氨基酸之间的同源性分别为82.1%～100%和81.1%～100%;阳性样品的ORF5基因与高致病性PRRSV毒株JXA1、经典PRRSV毒株VR2332、国内早期PRRSV毒株CH1-a、NADC30类毒株、NADC34类毒株和新型PRRSV毒株QYYZ的核苷酸同源性分别为84.1%～98.7%、83.9%～99.7%、85.2%～95.0%、85.3%～94.0%、86.4%～96.2%和82.8%～85.1%,编码氨基酸同源性分别为83.6%～99.5%、82.6%～99.0%、84.1%～93.5%、83.1%～94.5%、85.6%～95.5%和81.1%～86.6%。37份阳性样品的感...     

猪繁殖与呼吸综合征病毒湖南分离株ORF5基因的遗传进化分析

为了解猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）在湖南省地方猪保种场的感染情况,本研究在2019－2020年间从湖南省2个地方猪保种场采集287份全血样品。首先将血样混合成41份,采用RT-PCR或PCR法进行PRRSV病原检测,进一步通过高保真PCR扩增从PRRSV阳性样品中扩增PRRSV ORF5基因;测序后利用DNAStar软件分析获得的ORF5基因及其编码的GP5氨基酸与国内外不同PRRSV毒株的遗传进化关系;最后用PRRSV阳性血清接种Marc-145细胞,经盲传分离毒株,并用Reed-Muench法测定病毒滴度。结果显示,检测的41份混样中有3份PRRSV病原核酸呈阳性;从PRRSV阳性混样中单独扩增获得6条PRRSV ORF5基因序列,均属于PRRSV-2型的lineage 8分支,相似性为99.2%~99.8%;6条ORF5基因编码的GP5蛋白氨基酸序列在信号肽区域（第23位）、潜在的N-糖基化位点（第33位）和表位C （第59位）存在差异;PRRSV阳性血清接种Marc-145细胞盲传5代后出现明显的细胞病变,获得1株PRRSV毒株,命名为NX-1,病毒TCID₅₀为4×10⁵/mL。本研究表明,湖南省地方猪保种场存在PRRSV感染,感染的PRRSV属于PRRSV-2型的lineage 8,其GP5氨基酸序列存在的多处变异可能是造成疫苗免疫失败的原因之一,以上结果可为湖南省地方猪保种场的免疫防控提供一定参考。     

猪PRRSV云南分离株主要蛋白基因克隆及序列分析

采用RT-PCR技术,分别对PRRSV云南分离株-YN株编码GP3、GP5、M蛋白的基因进行扩增,获得764、602、524 bp特异性目的片段,经纯化后,克隆至pMD18-T载体中,分别进行序列测定与分析。结果表明,云南PRRSV与已知代表毒株核苷酸序列同源性分别为89.72%～98.80%;遗传进化分析表明,云南分离株与HB-2(sh)/2002、CH-1a等毒株关系最近,与VR-2332、respPRRS mlv等同属一个大分支,而与JXA1、GD、NM1等毒株处于不同的分支。     

PRRSV不同毒株RT-PCR检测方法的建立与应用

根据GenBank中猪繁殖与呼吸综合征病毒经典毒株、高致病性毒株与流行株NADC30-like Nsp2的特点设计特异性引物,建立能够快速区分这三类毒株的RT-PCR检测方法。该方法能够对猪繁殖与呼吸综合征病毒的经典毒株、高致病性毒株与NADC30-like流行株扩增出特异性片段,其大小分别为1 000 bp、900 bp和700 bp。具有快速、特异、通用等特点,可用于实验室快速诊断,为该病的诊断及免疫防控提供参考依据。用本试验所建立的方法对福建省疑似猪繁殖与呼吸综合征病毒感染的58份样品进行检测,结果显示34份为猪繁殖与呼吸综合征病毒阳性,其中高致病性毒株占41.18%,NADC30-like占14.71%,多毒株共感染占35.29%,提示高致病性毒株仍占主导,但多毒株共感染成为流行趋势。     

我国类NADC30猪蓝耳病的流行现状

自2012年以来,我国猪群中出现PRRSV的一种新亚型毒株,因其与美国PRRSV NADC30株具有较高的同源性,因此被称为类NADC30 PRRSV.目前类NADC30 PRRSV已在我国16个省份相继分离到,并且在近年来我国PRRSV中占据相当大的比例.类NADC30 PRRSV的出现,不仅增加了我国PRRSV流行毒株的复杂性,而且增加了猪蓝耳病防控的难度.     

狂犬病毒GSQY-Dog-China-2013株全基因组序列测定和遗传进化分析

为了全面分析我国狂犬病病毒遗传进化情况,本试验使用反转录PCR(RT-PCR)方法将狂犬病病毒GSQY-Dog-China-2013分为10个片段进行扩增,回收目的片段并与pMD20-T simple载体连接,转化JM109感受态细胞,挑取阳性克隆进行测序;使用DNASTAR软件中的Edit Seq通过拼接相邻片段之间的重叠序列获得GSQY-Dog-China-2013全基因组序列,构建系统进化树进行遗传进化分析。结果显示,GSQY-Dog-China-2013全长11 924核苷酸(nt),包含5个开放阅读框,分别编码核蛋白(N)、磷蛋白(P)、基质蛋白(M)、糖蛋白(G)和转录大蛋白(L);基于全基因组序列的进化树分析显示,GSQY-Dog-China-2013株和国内分离株形成一个分支,在国内分离株中与SXYL15株和SXBJ15株形成一个分支,亲缘关系最接近,提示GSQY-Dog-China-2013可能源自我国陕西省。本试验系甘肃省首次报道狂犬病病毒全基因组序列,进一步丰富了我国狂犬病病毒遗传进化数据,为狂犬病全面防治以及疫苗研发提供了数据支持。