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中国野生华东葡萄抗霜霉病抑制消减文库构建及初步分析 总被引:3,自引:0,他引:3
【目的】分离和获得中国野生华东葡萄抗霜霉病相关基因片段的EST序列。【方法】以高抗霜霉病的中国野生华东葡萄(V.pseudoreticulata)白河-35-1 株系为材料,以田间接种葡萄霜霉菌的幼嫩叶片为处理,以田间自然生长的未接种幼嫩叶片为对照,分别提取RNA,采用抑制消减杂交技术构建抗霜霉病基因的消减正交和反交两个文库,在文库中,选择3个EST序列,用半定量PT-PCR检验构建文库中EST片段的表达情况。【结果】构建的文库中EST片段的大小在150~900 bp,经筛选文库,得到正交库有效的ESTs 85条,反交库ESTs 29条,所获序列经过BLASTn和BLASTx网上序列比对,其中有78条ESTs与GenBank中其它植物相关基因序列有较高的同源性,31条为未知功能序列,已登录GenBank 114条ESTs,登录号:FG106789-FG106902。进一步利用半定量RT-PCR 对文库中3个基因的表达情况进行了分析,证明这些EST序列是可以表达的。【结论】经初步分析这些序列的功能,涉及抗病信号传导、能量代谢、蛋白质代谢、核酸代谢、光合作用及膜运输和代谢等方面,其中获得与抗病直接相关的ESTs 23条,下一步是通过对获得的EST序列进行末端快速分析(RACE)技术,获得抗霜霉病基因全长序列,并进行原核和真核表达研究验证基因全长序列功能,为研究葡萄抗霜霉病的基因提供依据。 相似文献
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【目的】从中国野生华东葡萄白河35-1经白粉菌接种诱导后叶片所构建的cDNA文库中,筛选抗病相关基因。【方法】根据植物抗病基因保守序列NBS位点设计特异引物,对葡萄白粉病接种诱导后的环化cDNA文库进行菌落PCR筛选,从随机挑选的大量菌落中筛选出82个PCR阳性菌落,提取阳性菌落的质粒进一步进行PCR检测确认,对确认的36个阳性质粒插入片段进行了测序。【结果】测序结果和序列生物信息学分析结果均表明,有3个基因序列与Genbank中的已知序列有较高的同源性,其中1个基因序列与葡萄抗白粉病基因(DT661587.1)序列同源性达99%,另外2个基因序列与水分胁迫下葡萄特异表达基因(DT031657.1)和葡萄抗皮尔斯病基因(CF202948.1)的同源性分别为89%和96%。【结论】初步推测获得的3个基因均为抗性相关基因。 相似文献
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【目的】克隆中国野生毛葡萄"商-24"天冬氨酸蛋白酶(AP)基因的cDNA序列,明确其在葡萄抗病防御机制中的作用。【方法】在前期获得的中国野生毛葡萄株系"商-24"AP基因(VqAP)EST序列的基础上,采用RT-PCR克隆AP基因的cDNA序列,对其序列及编码产物进行生物信息学分析,并通过实时定量PCR和半定量PCR,分析VqAP基因在白粉菌诱导不同时间(0,6,12,24,48,72,96和120h),不同激素(100μmol/L水杨酸,50μmol/L乙烯和0.5g/L茉莉酸甲酯)刺激及不同组织(嫩叶、嫩茎、花、果皮、卷须)中的表达情况。【结果】序列分析表明,VqAP基因序列长度为1 377bp,具有开放阅读框,编码458个氨基酸残基,相对分子质量为50.48ku,等电点为8.73。保守结构域分析表明,VqAP编码产物含有2个保守的具有催化活性的天冬氨酸残基,位于Asp-Thr/Ser-Gly(DT/SG)结构域,该基因编码的氨基酸序列属于植物天冬氨酸蛋白酶A1家族,为非典型的天冬氨酸蛋白酶。荧光定量PCR结果表明,接种白粉菌后6h,VqAP基因表达量为0h的6倍多,之后迅速下调;不同激素处理后,该基因也均诱导表达,这可能是由于VqAP基因参与了植物早期的抗病反应,以及由不同激素诱导的发病相关基因的调节作用。半定量PCR结果表明,在葡萄嫩叶、嫩茎、花、果皮、卷须等不同组织中VqAP基因的表达量不同,这可能与它参与了植物不同组织中功能蛋白的合成与降解有关。【结论】VqAP的表达响应病原菌侵染并受生物胁迫相关激素的调控,可能在葡萄防御病原菌侵染的机制中发挥重要作用。 相似文献
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【目的】为葡萄抗白粉病育种的辅助选择提供理论依据。【方法】以抗病的中国野生葡萄白河-35-1与感病的欧洲葡萄佳利酿杂交亲本及其F1、F2代为试材,通过对520个随机引物的筛选,从佳利酿中获得了葡萄感白粉病基因的RAPD标记OPV06-1100,并在欧洲葡萄、中国野生华东葡萄和美洲野生葡萄中进行了分析验证。【结果】经克隆、测序,RAPD标记OPV06-1100实际长度为1 016 bp。该标记与欧洲葡萄黄酮醇合成酶基因有92%的同源性,与13条欧洲葡萄叶片非生物胁迫数据库的EST序列有89%~97%的同源性;与3条来自欧洲葡萄感染葡萄皮尔斯病原菌后转录反应获得的EST序列有93%~95%的同源性;与拟南芥感白粉病基因PMR6序列有27.1%的同源性。【结论】OPV06-1100为葡萄属植物感白粉病基因的RAPD标记。该标记为认识葡萄感病基因和基因组以及标记辅助育种奠定基础。 相似文献
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【目的】从环化的中国华东葡萄白河35-1经白粉菌接种诱导后的叶片所构建的cDNA文库中,筛选抗病相关基因序列。【方法】根据植物抗病基因在氨基酸水平上的保守结构域NBS的P-loop区和LRR设计特异引物,采用三维文库筛选法,对环化的葡萄白粉菌接种诱导后的叶片cDNA文库进行PCR筛选。【结果】共建组池24个,每个组池中含有单菌落768个,包含18432个克隆。从中筛选出具有抗病基因保守序列的阳性克隆585个,其中具有NBS保守序列引物筛选出330个,LRR保守序列引物筛选出255个。对获得的阳性克隆中的插入片段进行了测序,经生物信息学分析去除重复序列后,获得422条具有抗病基因保守结构域的基因序列,其中具有NBS保守序列的250条,具有LRR保守序列的172条,共有NBS和LRR保守序列的25条。【结论】经翻译分析,其中8条编码产物包含NBS的P-loop结构域(GW787739—787742、GW787746、GW787747、GW787749、GW787758),5条编码产物包含LRR结构(GW787743、GW787744、GW787750、GW787751、GW787753),1条华东葡萄特有基因(GW787754)。从中选出具有不同抗病结构域的10条基因进行病源侵染过程中的基因实时定量表达分析,发现其中5条抗病相关基因的表达可被白粉菌接种所诱导,可能与白粉病侵染过程有关。 相似文献
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【目的】葡萄是世界性重要果树,欧洲葡萄品种因其优质高产被广泛栽培,但其突出缺点是抗病性弱,尤其易受白粉病危害。葡萄中芪合成酶(stilbene synthase,STS)的代谢产物白藜芦醇是植物体内具有抗病功能的植保素,果实中的白藜芦醇对人具有保健作用。中国野生毛葡萄‘丹凤-2’抗病性强且白藜芦醇含量高。论文旨在研究中国野生毛葡萄‘丹凤-2’芪合成酶基因(STS)及其功能,应用于抗病育种来提高欧洲葡萄抗病性及果实中芪类物质含量。【方法】同源克隆中国野生毛葡萄‘丹凤-2’芪合成酶基因VqSTS26和VqSTS32,构建pCAMBIA35S::VqSTSs::GFP过表达载体;以器官发生途径诱导的无核白分生愈伤组织作为受体材料,采用农杆菌介导法进行遗传转化,获得转基因葡萄植株;分别从转录水平和代谢产物水平比较转基因与野生型无核白在自然生长条件与人工接种葡萄白粉病菌(Uncinula necator)诱导下STS表达及芪类物质产生与积累的差异;通过显微观察白粉病菌在转基因与野生型无核白叶片上的生长发育进程,统计孢子萌发、菌丝生长与分生孢子梗形成数目,对转基因植株进行抗病性分析。【结果】通过PCR检测和Western blot鉴定,获得了稳定转化VqSTS26植株8株和稳定转化VqSTS32植株5株。在自然生长条件下实时荧光定量PCR分析表明VqSTS26、VqSTS32转基因无核白STS的表达量显著提高,芪合成酶上游基因PAL与下游基因RSGT的表达量上调,而与芪合成酶存在底物竞争关系的CHS表达下调;液相色谱分析表明芪类物质主要以糖苷的反式云杉新苷形式存在,VqSTS26、VqSTS32转基因无核白芪类物质的含量极显著高于野生型无核白。STS的表达及其产物合成受白粉病菌诱导,随白粉病菌诱导,STS表达量在1—2 dpi时显著升高,至7 dpi时表达量达最高;诱导表达产生的芪类物质由原来的反式云杉新苷新增加了反式白藜芦醇和葡萄素,且含量增加;转基因植株在STS表达量、芪类物质的积累方面均极显著高于野生型无核白。显微观察白粉病菌在葡萄叶片上的生长发育状态,对比野生型无核白,转基因植株白粉病菌生长受到抑制,菌丝发育更迟,7 dpi时转基因葡萄叶片上的分生孢子梗数量低于野生型无核白。【结论】过表达中国野生毛葡萄‘丹凤-2’VqSTS26和VqSTS32可以提高无核白中STS的表达量,促进芪类物质的形成与积累,抑制转基因无核白叶片上白粉病菌的生长。因此,中国野生毛葡萄‘丹凤-2’与其携带的STS及其产物,是定向改良欧洲葡萄品种白粉病抗性与芪类物质含量的重要种质资源与基因资源。 相似文献
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【目的】从华东葡萄抗白粉病株系‘白河-35-1’中克隆VpMYBR1基因,并进行基因表达与功能分析,为揭示抗白粉病机制提供理论依据。【方法】采用RT-PCR 和RACE技术克隆VpMYBR1 基因cDNA全长序列,并利用半定量和定量RT-PCR技术进行不同器官和不同处理后的表达分析;通过花序浸染法转化拟南芥,对转基因及未转化对照植株抗白粉病鉴定、台盼蓝染色和抗病标记基因表达分析研究基因功能。【结果】VpMYBR1基因cDNA序列全长539 bp,有228 bp的完整开放阅读框,编码75个氨基酸,包含1个Sant/myb结构域,GenBank 登录号为HQ284197;VpMYBR1基因在‘白河-35-1’不同器官中均有表达,且叶中的表达量最强,花序和果实中表达量最弱;VpMYBR1基因的表达在抗白粉病的华东葡萄‘白河-35-1’与感病的‘湖南-1’、抗病的毛葡萄‘商-24’叶片接种白粉菌6 h后达到最大值,而且在‘白河-35-1’中最高,达接种前的28倍。同样,VpMYBR1基因在SA、MeJA处理后的‘白河-35-1’中的表达量明显高于‘商-24’和‘湖南-1’;将VpMYBR1基因导入野生型拟南芥,提高了转基因株系的抗病性;台盼蓝染色和抗病标记基因表达分析表明,该基因可能通过过敏反应(hypersensitive reaction, HR)提高了转基因株系的抗病性。【结论】从华东葡萄克隆了VpMYBR1基因,基因表达及功能分析表明,该基因具有提高转基因植株白粉病抗性的功能。 相似文献
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白粉菌诱导的小麦类萌发素蛋白的克隆、定位及表达分析 总被引:1,自引:0,他引:1
【目的】克隆受白粉菌诱导的小麦类萌发素蛋白基因,分析其在感、抗病单株中的表达模式,探讨其在小麦抗白粉病过程中的作用机制。【方法】根据基因芯片结果,结合电子克隆与RT-PCR方法,克隆到一个受白粉菌诱导的小麦类萌发素蛋白基因。通过中国春缺体-四体系对获得的基因片段进行定位。运用荧光定量PCR方法分析了该基因片段在抗病植株、感病植株白粉菌诱导的时空表达模式。【结果】获得了一个具有完整开放阅读框的小麦类萌发素蛋白基因片段,命名为TaGLP5(GenBank 登录号为FJ594470)。系统进化分析表明该基因片段与已知的来自禾本科的萌发素蛋白分属不同的进化分支,很可能是新的小麦萌发素蛋白成员。通过中国春缺体-四体系将该基因片段定位在小麦的5A染色体上。定量PCR分析结果表明,该基因的表达受白粉菌诱导,且在接菌后的24 h以前抗病中的表达量高于同期感病株。【结论】本实验获得的类萌发素蛋白是一个新的成员。该类萌发素蛋白在感、抗植物受白粉菌诱导上调表达,但是表达量、表达时间上存在差异。推测该基因参与了小麦对白粉菌的防御反应。 相似文献
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白粉菌在不同抗病性葡萄叶片上的侵染过程比较 总被引:1,自引:0,他引:1
【目的】探明葡萄白粉病侵染过程中病原与植物互作的关键时期。【方法】以抗白粉病的中国野生葡萄白河-35-1、感病欧洲葡萄品种佳丽酿及其F1代抗病株系6-12-4和感病株系6-12-2为材料,通过考马斯亮蓝G-250染色和解剖观察统计叶片的自然带菌率。采集田间白粉病发病葡萄叶片,人工接种试验叶片,于接种后0,1,3,5和7d分别采集接种叶片,制片后显微观察,研究白粉菌在葡萄叶片表面的生长和侵染过程。【结果】田间自然条件下和田间人工套袋隔离2周后,葡萄抗、感白粉病植株的新稍叶片均存在自然带菌现象,但抗病植株带菌率较低。人工压片接种后,菌丝和分生孢子成功附着在感病和抗病植株的叶片表面。随着接种后时间的延长,不同抗病性葡萄叶片表面白粉菌的数量均增加,接种3 d后感病植株叶片表面的菌丝数量快速增加,并表现出白粉症状;抗病葡萄植株叶片表面的菌丝数量增加较慢,不表现白粉症状。感病材料上葡萄白粉病的侵染过程为:分生孢子萌发形成芽管,然后在芽管顶端萌发形成附着胞,附着胞下方长出侵染丝并侵入叶片,完成侵染过程。【结论】葡萄白粉病菌与寄主识别反应的关键时期在接种后3 d内。白粉病人工接种前,葡萄叶片保持至少2周的隔离是必要的。 相似文献
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【目的】在受白粉病菌侵染的中国野葡萄叶片中克隆锌指蛋白基因全长,研究葡萄抗白粉病的分子机制。【方法】在前期采用mRNA差异显示技术获得的中国野葡萄华东葡萄株系白河35-1抗白粉病基因表达差异cDNA片段T11GG/B0324-292的基础上,利用cDNA末端快速扩增(RACE)技术克隆了该cDNA全长序列,并结合生物信息学方法对所获取的序列进行分析。【结果】该cDNA全长2663bp(GenBank登录号HM008621),具有完整的开放阅读框,基因全长2223bp,编码1个由740个氨基酸组成的锌指蛋白(Zinc finger protein),5′和3′非翻译区长度分别为395和44bp。多重比较分析表明,该基因推导的氨基酸序列与拟南芥、蒺藜苜蓿、水稻的C3H亚型CCCH型锌指蛋白的同源性分别为61%,70%和60%。【结论】利用RACE技术获得了锌指蛋白基因全长,为进一步研究锌指蛋白基因与葡萄抗白粉病的关系奠定了基础。 相似文献
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4种蝴蝶雄性生殖系统形态学研究 总被引:1,自引:0,他引:1
【目的】明确4种蝴蝶雄性生殖系统的形态学结构。【方法】将新鲜标本剪下腹部,在Motic SMZ168-BL型显微镜下观察解剖,用Q Imaging Retiga 2000R(CCD)显微成像系统照相,采用Montage图像叠加软件进行图像处理。【结果】描述了4种蝴蝶的雄性生殖系统,其中外生殖器的差异主要表现在囊形突、钩突、背兜、阳基轭片等上,而内生殖器的主要差异表现在精巢、复射精管、单射精管及附腺上。【结论】4种蝴蝶雄性生殖系统的各部分结构特征存在较大差异。 相似文献
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为探究HvnANT1基因在青稞粒色形成过程中的基因表达模式,以紫粒青稞‘涅如姆扎’和白粒青稞‘昆仑10号’为试材,利用简化基因组GBS(Genotyping-by-Sequencing)对青稞紫粒进行基因定位,克隆到HvnANT1基因,对其进行生物信息学分析。结果表明:1)在7H染色体的84.30—86.00cM获得1个MYB类转录因子,命名为HvnANT1。2)该基因长1 033bp,其完整开放阅读框为762bp,编码253个氨基酸。HvnANT1蛋白分子量为27.14kU,是亲水性的不稳定碱性蛋白且不存在跨膜结构,无信号肽。该蛋白的二级结构主要是由无规卷曲、α-螺旋、延伸链和β-转角组成,具有2个SANT结构域(分别位于第13—第63个;第66—第114个氨基酸)。3)同源比对与系统进化分析表明:青稞HvnANT1蛋白与大麦、乌拉尔图小麦、高梁、玉米、二型花、小米、水稻、土瓶草、车轴草和杨梅10种植物的ANT1蛋白序列相似性分别为100.00%、88.85%、54.64%、60.95%、60.82%、58.46%、57.61%、37.76%、36.05%和36.33%;这些序列都具... 相似文献
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利用荧光定量PCR技术,检测了眼柄粗提物对凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)性腺发育相关基因(DMC1、VASA和VTG)表达的影响,探讨性腺抑制激素(GIH)在性腺发育过程中的调控机制,结果表明:DMC1和VASA只在凡纳滨对虾精巢和卵巢中表达;摘除眼柄后,精巢和卵巢中DMC1表达量均显著性降低(P0.05),而注射眼柄粗提物后精巢和卵巢中DMC1表达显著增高(P0.05);相反,摘除眼柄后,精巢和卵巢中VASA以及卵巢中VTG基因表达量显著增高,但注射眼柄粗提物后性腺中的VASA和卵巢中的VTG表达量显著降低。结果表明眼柄粗提物通过影响生殖相关基因的表达影响凡纳滨对虾的性腺发育。 相似文献
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两种药用植物残渣堆肥浸提液对黄瓜3种病害防治效果 总被引:1,自引:0,他引:1
通过室内孢子萌发试验和盆栽试验测定了药用植物砂地柏和马齿苋残渣堆肥浸提液对黄瓜灰霉病、霜霉病和炭疽病的活性.孢子萌发试验结果表明,马齿苋残渣堆肥浸提液对黄瓜灰霉病菌和炭疽病菌孢子萌发具有显著的抑制作用,抑制率分别达到78.69%和60.28%,对黄瓜霜霉病菌孢子萌发的抑制效果较差;砂地柏残渣堆肥浸提液对黄瓜炭疽病菌孢子萌发具有显著抑制作用,抑制率达到59.75%,对其他两种病原菌孢子萌发的抑制效果较差.盆栽试验结果表明,两种药用植物残渣堆肥浸提液对黄瓜3种病害的防治效果随浸提液含量的增加而增大,当使用浸提液原液时,砂地柏残渣堆肥浸提液和马齿苋残渣堆肥浸提液对黄瓜灰霉病的防治效果最好,保护和治疗效果分别为66.30%、61.02%和78.72%、76.75%,其次为黄瓜霜霉病,对黄瓜炭疽病的防治效果较差. 相似文献
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旨在初步了解丝氨酸蛋白酶抑制剂基因在扩展莫尼茨绦虫生长发育中的作用。采用分子克隆获得扩展莫尼茨绦虫丝氨酸蛋白酶抑制剂serpin基因部分片段,应用MEGA软件对其进行进化分析。同时以beta-Tubulin基因作为内参基因,采用SYBR Green real-time RT-PCR技术检测该基因在扩展莫尼茨绦虫4个不同发育阶段即头节、幼节、成节、孕节中的表达差异,最终克隆获得749bp的serpin基因片段。进化分析表明,扩展莫尼茨绦虫serpin基因与多方棘球蚴serpin基因有较近的亲缘关系。标准曲线分析显示,serpin和beta-Tubulin基因的Ct值与阳性质粒的浓度均呈良好的线性关系,相关系数均大于0.99,熔解曲线分析表明,产物为特异的单峰,具有较高的特异性。同时试验结果显示,serpin基因在虫体各发育阶段中的表达丰度存在差异,从高到低依次为孕节、头节、成节、幼节。由此初步推测,此基因可能在扩展莫尼茨绦虫虫卵发育为六钩蚴的过程中发挥一定作用。 相似文献
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岚皋魔芋软腐病病原细菌生物多样性研究 总被引:2,自引:0,他引:2
【目的】研究岚皋魔芋软腐病病原细菌生物多样性。【方法】采用组织分离法分离纯化魔芋软腐病球茎及叶柄中的致病菌,通过魔芋球茎、胡萝卜及马铃薯块的侵染试验初步确定其致病性,再利用魔芋球茎侵染致病及盆栽致病性试验确认其致病性;经菌落与细胞形态、生理生化特性及16SrRNA序列测定确定病原菌的类型。【结果】从魔芋软腐病球茎及叶柄中共分离获得16株细菌,侵染试验表明,其中CDS1-B1、CDS1-B2、CDS2-B1、CDS2-B2、CZS-B4和CZS-B6共6株细菌可使魔芋球茎表现软腐症状,并导致盆栽魔芋发病;6株细菌的菌落与细胞形态均存在差异;在魔芋、胡萝卜及马铃薯块上的侵染能力不同;16SrRNA序列分析表明,菌株CDS1-B1、CDS1-B2、CDS2-B1及CDS2-B2均与菊欧氏杆菌(Erwinia chrysanthemi)亲缘关系最近,菌株CZS-B4与菊欧文氏菌(Dickeya dadantii)亲缘关系最近,相似度为98.8%,菌株CZS-B6与菊果胶杆菌(Pectobacterium chrysanthemi)的相似度达99.9%。【结论】导致岚皋县魔芋软腐病的致病细菌存在生物多样性,其致病性也存在差异,其中新发现的魔芋软腐病原菌菊果胶杆菌(Pecto-bacterium chrysanthemi)致病性最强,菊欧氏杆菌(Erwinia chrysanthemi)和菊欧文氏菌(Dickeya dadantii)致病性较弱。 相似文献
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稳定性是一个评价群落结构与功能的指标,一直是生态学研究的热点。本文依据林分地上部分指标建立稳定体系,对苏州近郊4种人工林分,应用数学生态学方法,分析冬青针阔混交林、栎树针阔叶混交林、湿地松林和木荷林的林分稳定性。结果表明,多样性并不完全能够代表稳定性;4种林分群落稳定性主要因林分密度不同而异;稳定性依次为湿地松林>冬青湿地松林>栎树湿地松林>木荷林。其中湿地松林可能会发展成为针阔混交林;木荷林中在生长过程中会因竞争产生限制,可能演替形成栎树—木荷混交林;2种针阔混交林在未来演替也可能向落叶阔叶、常绿阔叶混交林发展;该地区木荷林密度过大,稳定性较弱,应采取适当的抚育措施,提高其林分稳定性。 相似文献