枯草芽孢杆菌B03对植物病原真菌的抑制作用

通过室内离体测定和温室植株测定研究了枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)B03对植物病原真菌的抑制作用。平板对峙培养结果表明,菌株B03对供试的15种真菌病害的病原菌均具较强的抑菌活性,其发酵滤液对甘蓝枯萎病菌、西瓜枯萎病菌和黄瓜枯萎病菌的菌丝生长都有抑制作用,抑制强度与发酵滤液浓度呈显著正相关。发酵液的施用时期不同对甘蓝枯萎病的温室防效影响显著,以发酵液灌根后3 d再接种病原菌的效果最好,可明显降低植株发病率和病情指数,防治效果高达96.25%。     

枯草芽孢杆菌CCTCC M207209抗扩展青霉特性研究——活性物质的提取、稳定性与应用

【目的】考察枯草芽孢杆菌CCTCC M207209抗扩展青霉活性蛋白在不同条件下的稳定性,评价其对苹果扩展青霉污染的抑制作用,为该菌的实际应用提供理论依据。【方法】在确定出最佳硫酸铵饱和度的基础上,用50%的硫酸铵饱和度沉淀发酵液中的活性蛋白,将所得粗蛋白用pH7.0的磷酸盐缓冲液溶解,用截留分子质量为8.0～10.0 ku的透析袋透析后,分别在121℃下处理30 min、经不同pH及0.05 mol/L不同金属离子处理8 h和紫外线照射不同时间后,用杯碟法测定其对扩展青霉的抑菌活性;在接种有15μL扩展青霉孢子悬液的苹果上分别接种30μL蛋白提取物、混合液体发酵物、无菌体发酵液和121℃灭菌30 min的带菌体发酵液,28℃培养7 d后,观察各孔处的发病率,并测量接种处病斑直径。【结果】提取发酵液中抗扩展青霉活性蛋白的最适硫酸铵饱和度为50%;粗蛋白提取物的抑菌活性在121℃处理30 min后无减小;pH为7时蛋白稳定性最高,处理8 h后抑菌活性无降低;紫外线照射前3 h,蛋白活性迅速降低,此后变化较小;不同pH和紫外线照射8 h后,蛋白的活性保持率均大于50%;0.05mol/L的Na+和Mg2+对抑菌活性有促进作用,Ca2+、Zn2+和Fe3+则使其完全失活。含菌体(1×108/mL)发酵物能够完全抑制低含量扩展青霉(1.5×105/mL)对苹果的侵染,活性蛋白可将其在苹果上的侵染率降低至55.6%,并可有效抑制其在苹果中的生长。【结论】枯草芽孢杆菌CCTCC M207209所产抗扩展青霉活性蛋白在广泛的pH、紫外线、温度条件下,具有良好的稳定性,能够有效抑制扩展青霉对苹果的侵染,在防治大田及采后苹果贮藏过程中扩展青霉的污染方面,有很好的应用前景。     

河南蜂胶对枯草芽孢杆菌的抑制作用研究

为探讨河南蜂胶对枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)的抑菌活性,采用琼脂平板扩散法,以枯草芽孢杆菌为试验菌种,将试验分为7个不同pH组(蜂胶浓度31％),以及在pH 5.5环境下设置10个不同浓度组,记录蜂胶对枯草芽孢杆菌的抑菌效果.结果表明,河南蜂胶对枯草芽孢杆菌有明显的抑菌活性,随pH增高,河南蜂胶对枯草芽孢杆菌的抑菌活性减弱;随着蜂胶浓度的降低,河南蜂胶对枯草芽孢杆菌的抑菌活性减弱,河南蜂胶可观测到抑菌环的最小浓度为0.12％.     

枯草芽孢杆菌与钾联用对黑腐皮菌的抑制作用

为明确枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)与钾联用后对黑腐皮菌(Valsa mali)的抑制作用,采用比浊法分别测定了含不同浓度KH_2PO_4,KCl和K_2SO_4的枯草芽孢杆菌发酵液OD600,评估钾对菌株LF17生长的影响;通过固体平板扩散法-打孔法测定了枯草芽孢杆菌与钾联用后对黑腐皮菌的抑制作用。结果表明,发酵液中加入KH_2PO_4和KCl后,菌株LF17活菌数呈上升趋势,其增幅范围分别为2.2×108～1.5×109,9.0×107～1.4×108 cfu/m L;加入K_2SO_4后,活菌数呈现降低趋势,质量浓度为10 mg/m L时,活菌数量降低了1.72×109 cfu/m L。KH_2PO_4和KCl质量浓度分别为15,2 mg/m L时,培养10 d后,对黑腐皮菌的抑菌率达最高,分别为96.33%和95.56%。研究发现,与联用KCl和K2SO4相比,联用KH_2PO_4后发酵液的活菌数显著增加,其抑菌率和抑菌稳定性显著提高,表现为协同增效。     

枯草芽孢杆菌D-29对采后梨褐腐病的抑制效果研究

为探究枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)D-29对采后病害的抑制效果,本研究以梨为试验对象,以果生链核盘菌(Monilinia fructigena)为病原菌,通过在果实伤口上接种不同处理的D-29处理液测定其对采后梨褐腐病的抑制效果,监测D-29菌体在果实伤口上数量的动态变化。结果表明,D-29菌悬液可有效降低梨褐腐病的发病率,浓度越大,抑制效果越明显;先接种D-29菌悬液的处理组,果实的发病率明显低于先接种病原菌孢悬液的处理组,对病斑扩展的抑制率明显高于先接种病原菌孢悬液的处理组,且在先接种D-29菌悬液的处理组中,与接种病原菌孢悬液的时间间隔越长,抑菌效果越好;D-29+无菌水及D-29+病原菌孢悬液两种处理下,D-29菌体均能在短时间内在果实伤口上定殖。     

枯草芽孢杆菌BS-421发酵液对扩展青霉的抑菌特性

研究不同环境条件下枯草芽孢杆菌BS-421发酵液对扩展青霉抑制活性的稳定性,初步确定其抑菌活性成分;考察发酵液对圆弧青霉、皮落青霉、黄柄曲霉、矮棒曲霉、黑曲霉等霉菌和金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、沙门氏菌、肠球菌、化脓链球菌、表皮葡萄球菌等食源性病原菌的抑制作用.结果显示:热处理对发酵液的抑菌活性无显著影响;121℃下保温30 min或pH4～8下处理24 h后的发酵液仍能保持80%以上的抑菌活性;对紫外光的耐受时间为6 h;K+、Na+和Mg2+对抑菌活性有一定促进作用,Zn2+和Fe3+对抑菌活性有抑制作用.发酵液中的多糖无抑菌活性,蛋白质或肽类是其主要抑菌成分.BS-421发酵液对11种病原菌有抑制作用,其中对大肠杆菌和扩展青霉的抑菌作用最强.     

生防枯草芽孢杆菌发酵条件的优化

枯草芽孢杆菌B2是从土壤中选出的,它的代谢产物中的抑菌物质对多种病原菌具有强烈的抑制作用。对其发酵条件的研究表明,其产抑菌物质的最佳发酵培养基为葡萄糖15g、黄豆饼粉30g、蛋白胨2g、NaCI 1g、（NH4）2SO45g、CaCO36g、MgSO46g,蒸馏水1000ml,最佳发酵条件为pH值7.0、接种量4％、30℃恒温振荡培养箱培养,发酵时间约60h。     

4株枯草芽孢杆菌对香蕉冠腐病的防效测定

香蕉采后用枯草芽孢杆菌(Bacillus subtgLs)的B63、B68、B74、B75菌株的菌液和无细菌滤液处理，可有效防治由镰刀菌引起的香蕉冠腐病。各处理中，无论是菌液处理还是无菌滤液处理，均以1368菌株的防效最高(分别为94．74％和95．24％)，明显高于生产上使用的杀菌剂施保功的防效(分别为52．63％和76．19％)。从不同的时间处理看，0h防治的效果最好。防效随滤液浓度的增加而提高。差异显著性分析表明，4个菌株的菌液处理蕉果，防效无显著性差异。     

枯草芽孢杆菌BS-1菌株抑菌活性研究

对1株枯草芽孢杆菌BS-1进行了抑菌活性测定研究。以苹果炭疽病菌、番茄灰霉病菌、水稻恶苗病菌、小麦赤霉病菌、棉花枯萎病菌、辣椒疫霉病原菌、玉米小斑病菌7种植物病原菌为指示菌,采用对峙培养法、杯碟法以及菌丝生长速率法测定了枯草芽孢杆菌及其无菌发酵液对7种植物病原菌的拮抗活性,结果表明,枯草芽孢杆菌及其发酵液对番茄灰霉病菌生长有较强的抑制作用,对苹果炭疽病菌没有抑制作用。     

枯草芽孢杆菌a1所产抗真菌活性物质的稳定性研究

在实验室分离得到的1株枯草芽孢杆菌a1,其代谢产物对油菜菌核病菌和灰霉病菌都有很好的抑制活性。研究pH,温度,光照等因素对其所产抗真菌物质活性的影响,结果表明,该菌株所产抗真菌活性物质具有很强的耐酸性,在光照和中性条件下活性稳定,在温度高于100℃,紫外光照射和碱性条件下不稳定。此外还发现a1菌株的遗传稳定性较好。     

内生枯草芽孢杆菌Em7抑菌物质的产生条件及其活性

为研究内生枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)Em7抑菌物质产生条件及其特性,以油菜菌核病菌(Sclerotinia sclerotiorum)为指示菌,采用单因素和正交试验测定不同培养基成分及培养条件对菌株Em7抑菌物质产生的影响。结果显示,菌株Em7的最佳培养基配方为:麸皮20g/L,牛肉膏10g/L,MnSO41.5g/L;当培养基初始pH=7.0,接种量φ=1%,250mL摇瓶装液量为50mL时,在28℃,150r/min培养获得的培养液抑菌活性最强。此外,菌株Em7的抑菌物质能够抑制10多种重要植物病原菌的菌丝生长、孢子萌发,并致使病菌菌丝出现细胞质外渗、膨大,致使病菌孢子出现顶端膨大、不能正常形成芽管等畸形发育。     

枯草芽孢杆菌对百合枯萎病的防治效果

采用菌丝生长速率法及孢子萌发法,研究枯草芽孢杆菌对百合枯萎病菌的抑杀效应。枯草芽孢杆菌无菌滤液在一定体积分数范围内能有效抑制枯萎病菌菌丝生长,减少孢子萌发,且随着无菌滤液体积分数的增加,孢子萌发抑制率也增大。体积分数为20%的枯草芽孢杆菌无菌滤液,处理后7d抑制率可达78.8%。体积分数为60%时,可完全抑制孢子萌发。盆栽防治试验表明,枯草芽孢杆菌菌液对百合枯萎病的发病抑制率达65.3%。且该菌液对百合的生长有一定的促生功效,说明枯草芽孢杆菌对百合枯萎病有抑菌和防病作用,且抑菌作用随枯草芽孢杆菌菌液体积分数的增加而增强。     

枯草芽孢杆菌高效表达系统的构建

【目的】优化枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)启动子和表达宿主,构建其高效的表达系统,为重组枯草芽孢杆菌的研究和应用奠定基础。【方法】以β-半乳糖苷酶编码基因为报告基因,以诱导型的枯草芽孢杆菌麦芽糖操纵元启动子为调控元件、大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭质粒为载体骨架,构建枯草芽孢杆菌高效表达载体pGJ222,将其电转化到B.subtilis 1A747菌株后进行诱导表达试验和葡萄糖抑制试验。利用同源重组的方法,用枯草芽孢杆菌组成型启动子P43替换了B.subtilis野生型菌株1A747麦芽糖操纵元的上游调控序列,得到优化重组表达宿主菌B.subtilis BCYL,将pGJ222转入B.subtilis BCYL后,对优化的表达系统进行诱导表达试验和葡萄糖抑制试验。分别用PCR扩增大肠杆菌和枯草芽孢杆菌维生素B12合成前期途径的谷氨酰-tRNA合成酶编码基因hemA,构建其表达载体,并将其转化B.subtilis BCYL中进行诱导表达检测。【结果】成功构建了枯草芽孢杆菌高效表达载体pGJ222,并实现了β-半乳糖苷酶的高效表达,其表达量占总可溶性蛋白的18%;质量分数5%的麦芽糖诱导24hβ-半乳糖苷酶活达到16U/mL。成功获得了优化重组表达宿主菌B.subtilis BCYL,其可使β-半乳糖苷酶活性有大幅度提高,在质量分数5%麦芽糖诱导24hβ-半乳糖苷酶活达到21U/mL,葡萄糖的抑制作用明显减弱。【结论】通过对启动子和表达宿主的优化,获得了枯草芽孢杆菌高效表达系统,为枯草芽孢杆菌基因工程研究提供了有力工具。     

磁化水对根瘤菌和生防枯草杆菌的生物效应

以苜蓿根瘤菌(Sinorhizobium meliloti)XGL026和生防枯草杆菌(Bacillus subtilis)2-4菌株为材料,研究4 000Gs和20 000Gs的磁处理水对其生长和功能的影响。结果表明,4 000Gs磁场强度下处理的磁化水对苜蓿根瘤菌生长繁殖有明显促进作用,菌体繁殖速度加快,培养液浓度增加,活菌数显著提高。4 000Gs磁化1次(T1)、2次(T2)和3次(T3)处理活菌数最大值分别较对照(普通水)增加11.02%、76.92%、72.47%,T2、T3处理缩短了达到最高活菌数的时间。苜蓿盆栽试验表明磁化水处理的单株结瘤数较对照平均增加5~11个;接种T3磁化水培养的根瘤菌+T3磁化水浇灌处理,苜蓿结瘤数的增加幅度最显著(P0.01)。试验发现,4 000Gs磁化1次(T1)、2次(T2)的磁处理水对枯草杆菌前期生长速度有一定延缓,但对生长量影响不大。4 000Gs磁化3次(T3)和20 000Gs磁化1次(T4)的磁处理水对枯草杆菌的整个生长期都有显著的抑制作用,活菌数较对照降低33.17%和93.52%(P0.01)。平板对峙试验测定磁处理水培养的枯草杆菌对棉花黄萎病菌的抑菌效果显示,与对照相比,T1磁处理水对枯草芽孢杆菌的抑菌能力有一定增效作用,而T3和T4磁处理水培养的枯草杆菌对棉花黄萎菌的抑菌效果显著减弱(P0.01)。     

一株枯草芽孢杆菌环状糊精葡糖基转移酶的提取、纯化和性质

枯草芽孢杆菌SC3-2是一株高产环状糊精葡糖基转移酶(CGTase)的菌株,将其发酵液通过(NH4)2SO4分级沉淀、DEAE-纤维素(DEAE-cellulose-52)离子交换层析和Sephadex S-200凝胶层析进行纯化。经过几步纯化后CGTase比活力达到4 923 U/mg,纯化倍数达11.37倍,回收率为20%。通过对酶性质的测定,结果表明:在pH6.5,30℃条件下,菌种产酶量最高;在pH5.5~7.5,40℃以内该酶较为稳定;Mn2+和Ca2+对酶活具有一定的促进作用;EDTA、Na+、Fe3+、Cr3+、Zn2+、Cu2+对酶活影响不大;SDS、Ag+和Hg+使酶几乎失去活性。本研究为环状糊精葡糖基转移酶的应用提供了依据。     

应激诱导木聚糖酶基因在枯草芽孢杆菌中表达

克隆含有信号肽碱性木聚糖酶基因(xynA)片段与依赖转录起始因子σB的启动子PgsiB片段,将其克隆至实验室前期构建的大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭载体上,并转化入枯草芽孢杆菌WB700菌株,获得重组菌BXS-W.当细菌生长至对数期中期时,施加不同的应激处理,采用DNS法测定木聚糖酶活性.结果显示,获得了xynA与PgsiB片段;成功构建表达载体pBXS,并获得重组菌株BXS-W;应激试验表明,施加的5种应激条件均极显著提高(P＜0.01)木聚糖酶基因的表达量,其中以乙醇应激效果最好.     

枯草芽孢杆菌对湖羊瘤胃菌群和血清代谢物的影响

【目的】利用16S rDNA高通量测序技术和LC-MS/MS非靶向代谢组学技术,研究短期和长期饲喂添加枯草芽孢杆菌日粮对育肥湖羊瘤胃内容物菌群和血清代谢物的影响。【方法】选择日龄((60±10) d)相近、体质量((19.51±2.07) kg/头)接近的湖羊断奶公羔36只,随机分为3组,分别为对照组(CON)、枯草芽孢杆菌Ⅰ组(BSN)和枯草芽孢杆菌Ⅱ组(BSH),每组12只羊。CON组饲喂基础饲粮,BSN组饲喂基础饲粮+100 mg/kg枯草芽孢杆菌,BSH组饲喂基础饲粮+200 mg/kg枯草芽孢杆菌。预试期10 d,正试期60 d,分别在正试期的第30天（短期）和第60天（长期）每组随机选择6只羊取瘤胃内容物和血清进行分析。【结果】① 短期和长期饲喂添加枯草芽孢杆菌饲粮对湖羊瘤胃微生物丰富度指数Chao 1指数和多样性指数Shannon指数、Simpson指数均无显著影响(P＞0.05)。湖羊瘤胃菌群在门水平上,短期饲喂BSN组的螺旋体菌门、迷踪菌门相对丰度较CON组显著降低(P＜0.05),长期饲喂BSH组的变形菌门相对丰度显著升高(P＜0.05);在属水平上,短期饲喂BSN组普雷沃氏菌属UCG-003相对丰度显著降低(P＜0.05),而瘤胃球菌属1相对丰度显著升高(P＜0.05)。长期饲喂BSN和BSH组湖羊普雷沃氏菌属UCG-003相对丰度显著降低(P＜0.05)。② 短期饲喂BSN和BSH组湖羊血清代谢物中L-苹果酸、D-2,3-二羟基丙酸、5-氨基水杨酸、2-氮杂环丁烷羧酸、棕榈酰溶血磷脂酸、1-磷酸果糖、核黄素均较CON组显著降低(P＜0.05);BSN组5 磷酸脱氧核糖、丙烯酸、甘氨酰异亮氨酸、2-酮丁酸、1,2,4-偏苯三酚、β-D-半乳糖、丁酸乙酯均较CON组显著降低(P＜0.05),而3′-磷酸腺苷较CON组显著升高(P＜0.05),差异代谢物相关通路为辅因子的生物合成、核黄素代谢、磷酸转移酶系统等。长期饲喂BSH组10E,12Z 共轭亚油酸、N4-乙酰胞嘧啶、吡咯烷酮羧酸、9,10-环氧十八烷酸、肌酸酐均较CON和BSN组显著升高(P＜0.05),差异代谢物相关性最高的关键通路为程序性坏死、鞘脂信号通路和鞘脂代谢。③ 属水平上差异微生物和差异代谢物相关性分析发现,普雷沃氏菌属UCG-003与大豆苷显著负相关(P＜0.05),螺旋菌属2与3′-磷酸腺苷显著负相关(P＜0.05),而瘤胃球菌属UCG-011与对苯二甲酸、喹啉酸、5,7-二羟基-2-(4-羟基-3,5-二甲氧基苯基)-4H-色胺-4-酮显著正相关(P<0.05)。【结论】枯草芽孢杆菌短期饲喂可调节湖羊瘤胃微生态平衡,使纤维降解有关的细菌相对丰度增加,但长期饲喂不仅调节能力降低,且长期大剂量（200 mg/kg饲粮）饲喂还会引起瘤胃微生物菌群失调;同时,枯草芽孢杆菌可影响湖羊代谢过程,短期饲喂可能调控辅因子的生物合成、核黄素代谢、磷酸转移酶系统等代谢过程,长期饲喂可能调控程序性坏死、鞘脂信号通路和鞘脂代谢。     

枯草芽孢杆菌DNKAS对分枝列当的防效、安全性及作用机理

分枝列当是全寄生性恶性杂草,为探讨生防菌对分枝列当寄生和生长的影响,以枯草芽孢杆菌 DNKAS为材料,通过盆栽、大田和酶活试验,研究DNKAS对分枝列当的防治效果、寄生体系植株生长量、常见作物果蔬生长安全性评价及对寄生体系防御酶系的影响。结果表明：在温室及田间验证下,枯草芽孢杆菌DNKAS对分枝列当防治效果分别为49.7%与43.1%;同时,在大田试验中,枯草芽孢杆菌DNKAS使产量和单果质量分别提高45.91%和45.89%,病虫果数减少48.5%。对5种常规作物生长安全性检测结果表明,该菌剂未对植物生长产生畸变,且具备一定促生作用;通过检测寄生体系的防御酶活性,施用枯草芽孢杆菌DNKAS使加工番茄根部苯丙氨酸解氨酶、多酚氧化酶、超氧化物歧化酶和抗坏血酸过氧化物酶活性分别增加 7.72%、111.41%、24.24%、14.06%,分枝列当酶活分别提高44.32%、137.59%,53.53%、15.67%。可见,枯草芽孢杆菌在分枝列当防除中作用是有效的,在分枝列当寄生期可提高寄生体系防御酶系统活性,阻碍分枝列当的寄生规模和数量,减轻其对寄主植物的危害;同时,菌剂的施用对常见果蔬等生长指标未见不良作用。     

枯草芽孢杆菌DZSY21抗菌肽的提取及其应用

为了提取枯草芽孢杆菌抗菌肽以探索其对食品的防腐效果,选用枯草芽孢杆菌DZSY21、解淀粉芽孢杆菌FZB42和枯草芽孢杆菌OKB105 菌种发酵,然后将这3个菌种的发酵上清液分别与丙酮按1:2的体积比混合,旋转蒸发浓缩得到3种菌的抗菌肽粗提物。对抗菌肽的热稳定性试验可知3种菌的抗菌肽经100 ℃加热30 min后抑菌效果均有小幅度降低,但抑菌活性仍较强。抗菌肽蛋白酶稳定性试验结果显示,3种菌的抗菌肽对胰蛋白酶和木瓜蛋白酶都很敏感;应用性试验中采用牛奶、苹果、肉等作为食品模型,结果显示经枯草芽孢杆菌DZSY21抗菌肽处理后的试验组品相均明显好于对照组。表明枯草芽孢杆菌DZSY21抗菌肽具有较好的防腐效果。     

枯草芽孢杆菌XF-1提取物对11种植物病原菌的抑制作用

采用盐酸和甲醇抽提法,提取了枯草芽孢杆菌XF-1(Bacillus subtilis XF-1)的抑菌物质。以该提取物处理根肿菌孢子2 d,有50%孢子活性被抑制;处理9 d后,孢子萌发相对抑制率始终保持在90%以上。提取物对三七根腐病菌、水稻纹枯病菌、禾谷镰刀菌、魔芋基腐菌、烟草赤星菌生长抑制率分别为71.97%、62.23%、60.96%、60.70%和57.92%。