苹果黑星病菌的早期分子检测

苹果黑星病(Venturia inaequalis)是中国苹果产区的重要病害之一,为了建立该病原菌的早期快速检测技术,筛选出了对苹果黑星病菌具有特异性的PCR引物.利用这对引物能从苹果黑星病菌基因组DNA中扩增出一条分子量为190 bp的特异性条带,准确地把苹果斑点落叶病、苹果褐斑病和苹果白粉病等常发性苹果叶斑病害区分开.采用改进的CTAB法,快速提取发病叶片组织的DNA,并结合PCR检测技术,可从苹果黑星病显症叶片以及未显症而处于潜育期的叶片组织中特异性地检测到苹果黑星病菌.结果表明,建立的苹果黑星病菌分子检测方法,可用于该病害的早期快速分子诊断.     

苹果黑星病菌分离培养技术

不同分离方法对苹果黑星病菌分离培养效果不同,试验结果表明,用自制针加专用粘着剂在水玻片上划线或粘单孢这两种孢子分离方法较易成功。不同季节标样分离培养结果表明,夏季标样在(5～7月)16℃条件下分离培养极易成功。     

苹果黑星病菌DNA提取方法研究

采用CTAB法、SDS法、Parker法及改进的SDS法提取苹果黑星病菌的DNA,经紫外分光光度计测定,改进SDS法提取的DNA得率较其他3种方法高,约为Parker法的2倍。改进SDS法提取的DNAA260nm/A280nm值为1.700～1.900,DNA纯度较高,而其他3种方法提取的DNAA260nm/A280nm值均高于1.900,DNA中所含RNA的量较高。4种方法提取的DNA在230nm波长处的吸收值分别为0.658,0.257,0.926和0.208,说明DNA不同程度地被酚类物质所污染,但改进的SDS法提取的DNA受污染程度最小。     

苹果黑星病菌致病力分化的研究

为了明确田间苹果黑星病菌致病力的分化情况,选取中国、英国、印度3个国家不同苹果产区的57株有代表性的苹果黑星病菌株,分别接种嘎啦、富士、秦冠3个寄主品种进行致病力测定。结果表明,不同菌株在相同寄主上能产生不同类型的病斑,其病斑大小、形状、颜色存在较大差异。同一菌株对不同寄主品种的致病力也存在较大差异。根据寄主对病菌的反应类型并结合病害严重度的聚类分析结果,可将57株苹果黑星病菌菌株划分为3个类群:强致病力Ⅰ型、中等致病力Ⅱ型、弱致病力Ⅲ型。     

黄瓜黑星病菌核糖体基因ITS区段的克隆及序列分析

为了探讨枝孢霉属的系统发育情况,采用真菌核糖体基因转录间隔区域(ITS)通用引物,PCR扩增3株来自不同地方的黄瓜黑星病菌核糖体基因的ITS序列,并对PCR产物进行测序和序列分析。结果表明:3株黄瓜黑星病菌之间同源性为100%,ITS全长463bp,其中ITS1长154bp,5.8S rDNA长159bp,ITS2长150bp,各碱基的个数分别为G 119个、C 118个、A 120个、T 106个,GC含量为51.2%。利用MEGA4软件中的NJ法和ME法,对3个样品序列以及GenBank中登陆的枝孢霉属其他25个种构建ITS聚类分析树状图,NJ法和ME法构建的结果基本相同,枝孢霉属可以分为5个聚类组,所测的3个样品和Cladosporium cucumerinum在一个聚类组中。     

陕西省苹果黑星病菌的致病力分化研究

选用陕西省18个有代表性的苹果黑星病菌菌株分别接种秦冠、富士、嘎啦、红星和乔纳金等5个寄主品种进行致病力测定。结果表明,不同菌株在相同寄主上能产生不同类型的病斑,其大小、形状、颜色存在较大差异。根据寄主对病菌的反应类型并结合病害严重度聚类分析结果,可将18个菌株划分为:强致病力Ⅰ型;中等致病力Ⅱ型和弱致病力Ⅲ型。     

陕西省苹果黑星病菌遗传多样性的AFLP分析

【目的】明确陕西省苹果黑星病菌的遗传多样性,为苹果抗病育种和黑星病菌的综合防治提供理论依据。【方法】利用25对AFLP引物,对采自陕西兴平、旬邑的46个苹果黑星病菌菌株进行群体结构和遗传多样性分析。【结果】25对AFLP引物共扩增出421个条带,其中多态性条带326个,占总带数的77.4%;陕西兴平和旬邑苹果黑星病菌AFLP多态位点比率为22.57%～69.83%,平均为47.74%;等位基因观测数为1.23～1.70,平均为1.48;有效等位基因数为1.16～1.46,平均为1.33;Nei氏基因多样性指数为0.09～0.27,平均为0.19;Shannon信息指数为0.14～0.39,平均为0.27;各类群间的Nei氏遗传相似系数为0.8151～0.9487,遗传距离为0.0527～0.2044;总的遗传多样性为0.29,群体内遗传多样性为0.18,群体间遗传多样性为0.11,遗传分化系数为0.38;陕西苹果黑星病菌菌株分为2大类,分离自旬邑嘎啦、兴平嘎啦、旬邑富士的菌株聚为一类,分离自旬邑红星、兴平红星、旬邑秦冠、兴平秦冠的菌株聚为另一类。【结论】陕西苹果黑星病菌菌株的遗传多样性与地理来源没有明显的相关性,而与寄主品种具有一定相关性。     

苹果黑星病菌培养基的比较研究

分析了苹果黑星病菌在12种固定配方培养基和3种自配方改良培养基上的菌落生长量，结果表明，苹果叶汁培养基、苹果果汁培养基、麦芽浸渍物培养基、马铃薯蔗糖培养基、马铃薯葡萄糖培养基、马铃薯麦芽糖洋菜培养基及马铃薯蔗糖肉汤培养基的培养效果均较好，其中，苹果叶汁培养基和苹果果汁培养基的培养效果最好，马铃薯蔗糖培养基和马铃薯葡萄糖培养基与之无显著差异，且易配制，是比较理想的苹果黑星病菌培养基。     

多菌灵与代森锰锌混配对梨黑星病菌和苹果斑点落叶病菌的增效研究

采用孢子萌发法和生长速率法分别测定了多菌灵与代森锰锌混配对梨黑星病菌和苹果斑点落叶病菌的增效作用。结果表明 ,5种不同比例的多菌灵与代森锰锌混配制剂对 2种病原菌均具有显著增效作用 ,多菌灵∶代森锰锌为 1∶ 1～ 1∶ 4的混配组合均表现出协同增效作用 ,SR值均 >1.5 ,仅 1∶ 5的混配组合 SR值 <1.5 ,表现为相加作用。研究结果初步还表明 ,病原菌抗药性水平愈高 ,混剂增效比率值越大 ,增效作用越显著。从降低产品的生产成本和克服病菌的抗药性方面考虑 ,应以 1∶ 1～ 1∶ 3的配比组合较为合理。     

英法两国不同生理小种苹果黑星病菌遗传多样性的SSR分析

【目的】对来自英、法两国20株苹果黑星病菌的遗传多样性与其生理小种和地理来源之间的关系进行研究。【方法】设计了5对SSR引物,对分属于7个生理小种的苹果黑星病菌的基因组DNA进行了PCR扩增,检测其多态性位点,计算各位点的多态性信息含量(PIC)和菌株间的遗传相似系数(GS),并对各菌株间的亲缘关系进行了聚类分析。【结果】5对引物共检测到43个等位位点,每对引物平均获得等位位点8.6个;PIC变幅为0.76~0.90,平均为0.85,GS变幅为0.72~1.0,平均为0.85;供试苹果黑星病菌的遗传多样性与其生理小种和地理来源之间均无明显相关性。【结论】英、法两国的苹果黑星病菌之间存在人为原因造成的基因流动,抑制了自然发生的遗传变异;病菌生理小种的划分应以传统生物学方法为主,分子生物学分析方法为辅。     

短颈剑线虫和喜马拉雅剑线虫的形态与rDNA分子特征

描述了日本进境罗汉松根际截获的2种美洲剑线虫:短颈剑线虫Xiphinema brevicollum Lordello et Da Costa,1961和喜马拉雅剑线虫Xiphinema himalayense Ahmad,Lamberti,Rawat,Agostinelli et Srivastava,1998,并对这2种线虫rDNA-ITS和D2D3序列进行了扩增、克隆、测序及系统进化分析.短颈剑线虫和喜马拉雅剑线虫在国家质量监督检验检疫局内首次截获,喜马拉雅剑线虫在日本首次报道,在中国没有分布记载.     

梨黑星病菌的分离培养和基质研究

用18种培养基对梨黑星病菌进行分离培养结果表明,用PDA、改进PDA及PSA培养较易分离成功,在改进PDA+L′中营养生长速率最大,20℃下培养20d菌落直径可达12mm,并产生分生孢子。药效测定试验表明,10.0μg/mL的70%代森锰锌或5%杀菌清水剂及5.0μg/mL的植物制剂20%苦皮藤水浸液,对梨黑星病菌分生孢子萌发有很高的抑制作用,抑制率分别达100%,100%和78.71%。     

渭北旱塬苹果黑星病春季流行模拟系统

根据2001-2005年对苹果黑星病研究的田间和室内试验结果,结合1997至2005年的气象资料,构建了累积温度、苹果叶片面积、叶片数量、叶龄、子囊成熟概率、子囊孢子释放、子囊孢子着落、苹果叶片表面湿润时间、子囊孢子萌发、子囊孢子侵染概率、病斑数目、病斑面积等12个子模型.采用面向对象程序设计语言Borland Delphi 5.0开发出了"苹果黑星病春季流行模拟系统(SSASS)",测试了2006年该病害在渭北旱塬的发生情况,结果表明,该系统灵敏度高,能较好地模拟渭北旱塬苹果黑星病的春季流行规律.     

甘蓝型油菜DGAT1重复基因的克隆与表达分析

二酰甘油酰基转移酶(Diacylglycerol acyltransferase,DGAT1)是十字花科植物种子三酰甘油积累主要的贡献者。甘蓝型油菜为异源四倍体,存在多个DGAT1重复基因,目前还缺乏对这些基因的系统研究。以甘蓝型油菜为试验材料,根据TAIR已公布的拟南芥DGAT1基因序列在BRAD数据库中进行BLAST比对,根据比对得到的2个白菜型油菜与2个甘蓝的DGAT1基因序列设计引物,利用RT-PCR技术获得4个甘蓝型油菜DGAT1包含完整编码区的基因片段,并对所得到片段进行测序和生物信息学分析。结果表明:克隆得到的基因片段分别为BnDGAT1-1,1 509bp;BnDGAT1-2,1 533bp;BnDGAT1-3,1 515bp;BnDGAT1-4,1 506bp。这4个基因具有极高的相似性,BnDGAT1-1与BnDGAT1-2、BnDGAT1-3与BnDGAT1-4的2个基因相似度均高达97%以上。跨膜结构分析表明BnDGAT1-1与BnDGAT1-2这1对基因所编码的蛋白质含有9个跨膜结构域,而BnDGAT1-3与BnDGAT1-4这对基因所编码的蛋白质含有8个跨膜结构域。包含有BnDGAT1-1与BnDGAT1-3的基因对BnDGAT1-a与包含有BnDGAT1-2与BnDGAT1-4的基因对BnDGAT1-b在含油量不同的各种甘蓝型油菜种子中表达无明显差异,表明这2对DGAT1基因的表达差异并不是影响所选材料种子含油量的决定因素。