草鱼BPI/LBP基因的克隆及特征研究

【目的】克隆草鱼杀菌通透性增加蛋白/脂多糖结合蛋白（Bactericidal permeability-increasing protein/LPSbinding protein,BPI/LBP）基因的cDNA全长,分析其结构特征,研究其表达规律,为进一步探明其功能奠定基础。【方法】首先用同源克隆及快速扩增cDNA末端技术(RACE),克隆草鱼BPI/LBP基因的cDNA全长,然后用生物信息学方法分析BPI/LBP基因的结构特征,最后用半定量RT-PCR检测BPI/LBP基因在草鱼不同组织（血、脑、眼睛、前肠、中肠、后肠、鳔、鳃、头肾、中肾、心脏、肝胰脏、肌肉、皮肤和脾脏）中的表达模式。【结果】草鱼BPI/LBP cDNA全长1 568 bp,编码473个氨基酸,其中包括18个氨基酸组成的信号肽、BPI1结构域（BPI/LBP/CETP N-terminal domain）和BPI2结构域（BPI/LBP/CETP C-terminal domain）。该蛋白的分子质量为51 551 u,等电点为8.69。氨基酸序列同源性分析结果显示,草鱼与鲤鱼BPI/LBP的同源性最高（90%）,其次为虹鳟（73%）、斑点叉尾鮰（73%）、香鱼（72%）等。在系统进化树中,草鱼BPI/LBP首先与鲤科的鲤鱼聚为一类。通过半定量RT-PCR分析可知,草鱼BPI/LBP基因在被检测的15个组织中都有表达,其中在鳃中的表达量最高,其次为头肾、中肾等。【结论】成功克隆了草鱼BPI/LBP基因的cDNA全长,该基因在草鱼体内不同组织中广泛表达。     

草鱼BPI/LBP基因的克隆及特征研究

【目的】克隆草鱼杀菌通透性增加蛋白/脂多糖结合蛋白(Bactericidal permeability-increasing pro-tein/LPS-binding protein,BPI/LBP)基因的cDNA全长,分析其结构特征,研究其表达规律,为进一步探明其功能奠定基础。【方法】首先用同源克隆及快速扩增cDNA末端技术(RACE),克隆草鱼BPI/LBP基因的cDNA全长,然后用生物信息学方法分析BPI/LBP基因的结构特征,最后用半定量RT-PCR检测BPI/LBP基因在草鱼不同组织(血、脑、眼睛、前肠、中肠、后肠、鳔、鳃、头肾、中肾、心脏、肝胰脏、肌肉、皮肤和脾脏)中的表达模式。【结果】草鱼BPI/LBPcDNA全长1 568 bp,编码473个氨基酸,其中包括18个氨基酸组成的信号肽、BPI1结构域(BPI/LBP/CETP N-ter-minal domain)和BPI2结构域(BPI/LBP/CETP C-terminal domain)。该蛋白的分子质量为51 551 u,等电点为8.69。氨基酸序列同源性分析结果显示,草鱼与鲤鱼BPI/LBP的同源性最高(90%),其次为虹鳟(73%)、斑点叉尾鮰(73%)、香鱼(72%)等。在系统进化树中,草鱼BPI/LBP首先与鲤科的鲤鱼聚为一类。通过半定量RT-PCR分析可知,草鱼BPI/LBP基因在被检测的15个组织中都有表达,其中在鳃中的表达量最高,其次为头肾、中肾等。【结论】成功克隆了草鱼BPI/LBP基因的cDNA全长,该基因在草鱼体内不同组织中广泛表达。     

草鱼LXRα基因的克隆及表达研究

【目的】克隆草鱼肝X受体α亚型(Liver X Receptorα,LXRα)cDNA序列,分析其在草鱼不同组织中的表达情况及n-3HUFA对草鱼肝胰脏LXRα基因表达的影响。【方法】以草鱼肝胰脏组织为材料,采用RT-PCR技术对其LXRα基因cDNA进行克隆分析,运用生物信息学的方法分析该基因序列同源性。检测LXRα基因在草鱼10种组织中的表达情况。以含0.52%n-3HUFA的饲料饲喂草鱼95d后,用实时定量PCR法检测n-3HUFA对肝胰脏LXRα表达的影响。【结果】克隆得到了草鱼LXRαcDNA序列(GenBank注册号为:FJ965309),其ORF序列长度为1 230bp,编码409个氨基酸,预测该蛋白分子式为C2083H3343N581O611S30,分子质量为47 263.7u,等电点pI为7.91,半衰期为30h。该蛋白质具有哺乳动物的LXRS特征:包括DNA结合位点(DBD)、p-box,配体结合域(LBD)、激活功能-2(AF-2)区域、D-box、D区域(D region)和属于2个锌指结构的8个半胱氨酸;与其他物种LXRα的同源性为70.7%~100%,其中与鲤鱼和斑马鱼的同源性分别达100%和94.6%。LXRα基因在草鱼肝胰脏、肌肉、心脏、鳃、精巢、肾脏、脑、脾脏、肠、腹腔脂肪等10种组织中均有表达,其中在精巢中表达水平最高(P0.05),在肌肉中表达水平最低(P0.05);饲喂n-3HUFA可显著抑制草鱼肝胰脏LXRα基因的表达水平(P0.01)。【结论】克隆获得了草鱼LXRα基因cDNA序列,该基因在多种组织中均可表达,其编码的氨基酸序列与其他物种相似性较高,在动物进化中比较保守;n-3HUFA可通过影响草鱼肝胰脏LXRα基因的表达,调控草鱼的脂质代谢。     

赤眼鳟Toll样受体9基因的cDNA全长克隆及表达特性分析

为探究赤眼鳟(Squaliobarbus curriculus)Toll样受体9基因(toll–like receptor 9,ScTLR9)的结构特性及其参与免疫应答草鱼呼肠弧病毒(grass carp reovirus,GCRV)感染时的表达特性,采用RACE技术克隆Sc TLR9基因c DNA全长序列,采用实时荧光定量PCR技术比较分析ScTLR9免疫应答GCRV的表达特性。结果显示:ScTLR9的cDNA全长为3 687 bp,编码1 059个氨基酸,有17个富含亮氨酸重复序列(leucine rich repeats,LRRs)结构域。ScTLR9在被检测的9个组织中均有表达,在中肾和头肾中的表达量最高;感染GCRV后,基因TLR9在赤眼鳟和草鱼头肾中的表达量均上调,在赤眼鳟头肾中的表达量于感染后12 h达到峰值,推测TLR9参与了赤眼鳟抗GCRV的免疫应答,且在抗GCRV入侵免疫反应中赤眼鳟较草鱼的免疫应答更为迅速。     

柱状黄杆菌对草鱼TLRs基因表达水平的影响

用柱状黄杆菌Flavobacterium columnare G4株感染草鱼Ctenopharyngodon idella,分别在感染1、4、7d后提取感染组和对照组草鱼鳃、脾脏、肝脏、肠道和头肾5种组织的总RNA,并采用半定量RT-PCR方法检测不同组织中Toll样受体3(TLR3)、Toll样受体7(TLR7)和Toll样受体22(TLR22)3个抗病毒免疫基因的表达变化.结果表明:注射柱状黄杆菌7d后,TLR3在草鱼鳃、肝脏、肠道和头肾4种组织中的表达显著上调(P＜0.05);注射柱状黄杆菌4d和7d后,TLR7和TLR22在5种组织中的表达均显著上调(P＜0.05);而注射柱状黄杆菌1d后,TLR22在鳃、脾脏和肝脏组织中的相对表达量就显著上调(P＜0.05).研究表明,TLR3、TLR7和TLR22基因在机体应对细菌感染的免疫反应过程中发挥着重要的作用.     

番鸭呼肠孤病毒感染对体液免疫功能的影响

 【目的】探讨番鸭呼肠孤病毒感染对体液免疫功能的影响。【方法】将60只5日龄健康番鸭,随机平均分为两组,分室隔离饲养。试验组雏鸭每只腿部肌肉注射番鸭呼肠孤病毒细胞毒0.2 mL（0.01个TCID50=10-3.7558）,对照组相同部位注射等量灭菌生理盐水,每隔5 d,应用组织化学法检测脾脏和法式囊中浆细胞数量,间接血凝法检测血清中禽流感抗体水平和放射免疫法检测血清中IL-2,IL-6含量的变化。【结果】番鸭感染呼肠孤病毒,法氏囊和脾脏中浆细胞数量试验组均比对照组少,在感染后15 d达到最少,试验组极显著地低于对照组（P＜0.01）;同时,番鸭感染呼肠孤病毒可抑制禽流感抗体形成,感染后15d抗体水平最低,试验组极显著地低于对照组（P＜0.01）,此后又逐渐升高;血清中IL-2和IL-6的含量也在感染初期降低后又逐渐回升,感染后10 d均达最低,试验组极显著地低于对照组（P＜0.01）。【结论】番鸭呼肠孤病毒感染5日龄雏番鸭,通过破坏免疫器官(法氏囊,脾脏)中的浆细胞,降低了机体抗体形成能力,同时,也通过对免疫分子的影响反过来影响机体的体液免疫功能。提示,增强机体体液免疫功能是防制该病的一个途径。     

一株鹅源呼肠孤病毒的分离鉴定及致病性研究

【目的】从疑似感染鹅呼肠孤病毒的病料中分离鉴定一株鹅源呼肠孤病毒JS-01,并对病毒分离株的致病性进行初步研究,为开展该病毒的进一步研究奠定基础。【方法】取病死鹅的肝、脾组织冻融3次后充分匀浆,8 000r/min离心15min取上清,接种10日龄鹅胚的卵黄囊,收集24~144h死亡的鹅胚尿囊液,并提取病毒RNA。根据鹅呼肠孤病毒基因的保守序列设计特异性引物,利用该引物对所提取的病毒RNA进行RT-PCR,回收后与pMD18-T载体连接,将重组载体转化到DH5α大肠杆菌并在AMP+/LB培养基中培养,对阳性菌落测序,对测得的序列进行核苷酸及氨基酸同源性比对,并绘制系统遗传进化树。【结果】分离病毒JS-01的RT-PCR显示,其基因序列长度380bp,为鹅呼肠孤病毒σC基因片段;系统遗传进化分析表明,分离株JS-01与水禽源呼肠孤病毒处于同一分支,同源性为94.8%~96.5%,而与鸡呼肠孤病毒的同源性仅为40.6%~52.2%;在雏鹅上进行的动物回归试验表明,病毒JS-01可使雏鹅肝、脾、肾等器官发生病变。【结论】分离毒株为鹅呼肠孤病毒,该分离株对雏鹅有一定致病性,应注意本病的防控。     

鸭呼肠孤病毒人工感染SPF鸡胚的病理学研究

【目的】前人研究表明禽呼肠孤病毒可以经卵垂直传播, 禽呼肠孤病毒能引起雏禽的病毒性关节炎、呼吸道和肠道疾病、肝炎、心肌炎、免疫抑制等。以实验室分离的鸭呼肠孤病毒HP080421株为研究对象,该毒株引起病变主要以鸭软脚为主要临床特征,病鸭肝脏和脾脏表面有大量的白色坏死灶、肾脏肿大、出血为主要病变特点。研究了鸭呼肠孤病毒对鸡胚的致病性,通过雏鸡的病理变化特点,探讨所分离的HP080421鸭呼肠孤病毒株是否也可感染鸡群,旨在为鸡场鸭呼肠孤病毒感染的防控提供理论依据。【方法】运用华中农业大学兽医病理学实验室分离鉴定的HP080421株鸭呼肠孤病毒通过尿囊腔接种SPF鸡胚,建立SPF鸡胚鸭呼肠孤病毒感染模型,培养鸡胚至雏鸡出壳,运用临床观察、病理剖检、H.E染色和免疫组织化学染色等病理组织学检查方法,对鸭呼肠孤病毒感染SPF鸡胚进行病理学研究和致病性分析。【结果】研究发现病毒感染鸡胚孵化培养至22-23日龄均啄壳,但不能自主出壳,需人工剥壳。病理剖检可见雏鸡的肝脏、脾脏肿胀质脆,表面及实质分布有黄白色坏死灶;脑部组织肿胀,并可见出血点和出血斑。H.E染色的组织病理学观察可见接毒组雏鸡肝脏、脾脏的坏死灶周围有大量淋巴细胞浸润;法氏囊的滤泡髓质部和胸腺的髓质部淋巴细胞减少、缺失;脑、肺脏、肾脏存在不同程度的淤血、出血和水肿;免疫组织化学染色结果表明：病毒阳性信号主要分布于肝脏、脾脏、肺脏和法氏囊等器官,并且位于上皮细胞和巨噬细胞的细胞质和胞核内。【结论】鸭呼肠孤病毒株HP080421 能够在SPF鸡胚中复制增殖,并使雏鸡主要器官发生明显的病理变化,病理变化主要集中在肝脏和淋巴器官,因此鸭呼肠孤病毒可通过垂直传播感染鸡群,还可导致雏鸡免疫抑制。本研究通过SPF鸡胚鸭呼肠孤病毒感染模型,阐述了鸭呼肠孤病毒感染鸡群的可能性,因此在实际养殖过程中,养殖户要防止鸭呼肠孤病毒对鸡胚的污染,切断传播途径,以达到预防鸡群感染鸭呼肠孤病毒的目的。     

鸽TLR7基因的克隆、鉴定及表达分析

【目的】克隆鸽Toll样受体(Toll-like receptor 7,TLR7)全基因,预测其主要功能区域并分析在鸽的各种组织中的表达情况.【方法】通过RT-PCR、RACE、相对荧光定量PCR、生物信息学软件分析方法进行研究.【结果和结论】研究发现鸽TLR7基因cDNA全长3 516 bp,ORF全长3 175 bp,编码1 048个氨基酸.其蛋白结构主要由胞外的富含亮氨酸的结构域(LRRs)、跨膜域(TM)和胞内的Toll/白介素-1受体结构域(TIR)3部分构成.鸽TLR7基因编码的氨基酸序列与鸿雁Anser cygnoides、绿头鸭Anas platyrhynchos、鸡Gallus gallus和麻雀Taeniopygia guttata的相似性均高于78%,与哺乳动物的相似性约为60%,与鱼类的相似性低于55%.鸽TLR7基因在小肠、脾脏、肾脏、肝脏中表达量较高,而在大脑、肺脏、气管、心脏、胰腺、肌肉、皮肤中表达量相对较低.该研究克隆了鸽TLR7全基因,并预测其主要功能区域.     

草鱼Pim-1基因克隆、组织表达及多克隆抗体的制备

【目的】旨在进一步研究草鱼（Ctenopharygodon idella）莫洛尼鼠白血病病毒前病毒整合基因1(Proviral integration of moloney murineleukemia virus, Pim-1)的功能。【方法】采用RACE法克隆草鱼Pim-1(CiPim-1)的全长cDNA序列,并对其全长序列进行生物信息学分析。采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测CiPim-1在健康草鱼肝脏、肾脏、头肾、脾脏、肠、心脏、鳃、皮肤、肌肉及血液中的相对表达量,同时将CiPim-1基因（246～318 aa）片段克隆到原核表达质粒pGEX-4T-1中,转入E. coli Rosetta菌株,经IPTG诱导后成功表达重组蛋白pGEX-4T-1-Pim1,随后采用纯化后的融合蛋白免疫新西兰大白兔获得抗血清,并通过ELISA测定抗血清效价,最后采用免疫印迹（Western Blotting）分析抗体的特异性。【结果】CiPim-1基因序列全长1 082 bp,编码318个氨基酸,分子量为36.14 ku,具有1个蛋白激酶结构域（Protein kinase domain...     

优质肉鸡VIP和DRD基因多态性与性成熟的关联分析

为探究鸡血管活性肠肽受体基因(VIP1和VIP2)和多巴胺受体基因(DRD1)多态性与性成熟的关系,采用PCR-SSCP和SNPs测序验证等方法对优质肉鸡F系287个个体进行了性成熟相关性状的关联分析。结果表明,VIP1基因处发现2个突变位点,分别为73352处C→T的突变,68818处T→C的突变;VIP2基因发现1个突变为36 127处A→G的突变。DRD1基因发现3个突变位点,分别为201处C→T的突变,208处A→G的突变及255处A→G的突变。与性成熟的关联性分析表明,VIP1基因73 352处的基因突变与冠高、冠长、冠重和睾丸重显著相关(P0.05),而与生长激素GH、睾酮激素TEST差异不相关(P0.05);VIP2和DRD1各处基因突变与性成熟相关指标均存在不同程度的差异显著(P0.05),但都与生长激素GH和睾酮激素TEST差异不相关(P0.05)。结果提示说明,VIP1、VIP2和DRD1基因可作为性成熟性状标记辅助选择的有效分子标记。     

大肠杆菌cysE和cysM基因的克隆、原核表达及多克隆抗体的制备

【目的】克隆大肠杆菌半胱氨酸合成酶(包括丝氨酸乙酰转移酶(cysE)和O-乙酰丝氨酸硫化氢解酶(cysM))的基因,对其进行原核表达,并制备相应蛋白的抗体。【方法】用PCR方法从大肠杆菌BL21(DE3)中扩增cysE和cysM基因,构建其原核表达载体pET32a(+)-cysE和pET32a(+)-cysM,对其进行BamHⅠ和SacⅠ双酶切鉴定和测序验证后转入大肠杆菌中进行诱导表达,对表达产物进行SDS-PAGE和Western blot(以His抗体作为一抗)检测。用纯化的cysE和cysM蛋白作为抗原免疫新西兰大耳白兔,制备多克隆抗体,并通过酶联免疫吸附试验(ELISA)检测抗体效价。【结果】PCR获得了822bp的cysE基因和912bp的cysM基因。原核表达质粒pET32a(+)-cysE和pET32a(+)-cysM构建成功,并可在大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达,表达的cysE和cysM重组蛋白分子质量分别为56和58ku。制备的多克隆抗体具有较强的免疫结合活性,抗体滴度均达到1∶102 400。【结论】成功克隆了大肠杆菌cysE和cysM基因,并实现了原核表达,同时制备出了相应的多克隆抗体。     

墨兰FT同源基因的时空表达及功能分析

FLOWERING LOCUS T(FT)基因是植物开花调控途径的整合基因,整合来自光周期途径、春化途径和自主途径等不同花发育途径的信号,在植物花发育中发挥着重要作用。从墨兰品种‘企剑黑墨’中克隆了新的FT同源基因,并对其各组织部位的表达特性和生物学功能进行了分析。结果表明,墨兰FT基因c DNA全长序列为618bp,其中开放阅读框为531 bp,编码176个氨基酸。其氨基酸序列与拟南芥、水稻中FT基因的氨基酸序列有较高的同源性。墨兰FT同源基因在‘企剑黑墨’各器官中均有表达,营养生长期FT基因在腋芽中的表达量最高,生殖生长期FT基因在腋芽,花梗,花蕾等器官中的表达量较高,在根和叶中的表达量最低。在拟南芥中超表达墨兰FT同源基因,能显著促进拟南芥开花。     

猪流行性腹泻病毒的RT-PCR鉴定及其 M、N和E基因的序列分析

对引起仔猪严重腹泻的猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)进行RT-PCR检测,并对PEDV部分基因进行克隆和序列分析。从陕西省某发生严重仔猪腹泻的养猪场采集肠道内容物,利用RT-PCR技术成功检测到PEDV感染。克隆检测到的PEDV M、N和E基因片段,并将该基因核苷酸序列和推导的氨基酸序列与其他不同来源的PEDV毒株进行比较分析。结果表明,克隆的M、N和E基因与其他已经发表的PEDV毒株核苷酸的同源性分别为96.3%～99.9%、95.2%～99.5%和96.1%～96.9%,氨基酸同源性分别为95.6%～99.6%、96.1%～99.5%和96.1%～98.7%;系统进化树结果表明,试验检测的PEDV与国内分离株的PEDV株亲缘关系更近。可见:陕西省养殖场存在猪流行性腹泻病毒感染,其M、N和E基因变异不大。     

不同代次牛成肌细胞的诱导分化及相关基因的表达分析

利用初生荷斯坦牛的成肌细胞,在不同代次以含体积分数为2%马血清的DMEM进行诱导分化,在之后0、2、4、6、8、10d观察细胞的形态变化并收集细胞提取总RNA,检测成肌相关基因的表达情况,为进一步研究牛肌肉发生过程及相关基因的表达调控提供依据。同时利用实时荧光定量PCR分别检测肌性相关基因MyoD(生肌决定因子)、MyoG(肌细胞生成素)以及非肌性相关基因A-FABP(脂肪细胞型脂肪酸结合蛋白)表达水平的变化。研究表明:1各代细胞在诱导培养4d后开始有肌管形成,其后越来越多,8d时达高峰。2成肌细胞向成熟肌细胞分化过程中,MyoD、MyoG、A-FABP基因都呈先上升然后下降的趋势。3高代次成肌细胞比低代次细胞增殖慢,而且在诱导分化后,肌管的数目明显变少;MyoD、MyoG、A-FABP随着代次的升高而下降。故推断MyoD、MyoG以及A-FABP基因会在成肌分化开始后的不同阶段被激活,从而发挥不同的调控作用,而且随着传代次数的增加成肌细胞的分化能力减弱。     

日本白鲫BMP15和GDF9基因片段的克隆及组织表达分析

根据斑马鱼GDF9、BMP15基因的保守序列设计引物,采用RT PCR方法扩增获得日本白鲫GDF9、BMP15基因片段。日本白鲫GDF9基因片段长778 bp,编码145个氨基酸;BMP15基因片段长811 bp,编码270个氨基酸。氨基酸序列分析表明日本白鲫GDF9与斑马鱼的同源性最高,为78%,与其他物种的同源性在58%~78%之间;日本白鲫BMP15与斑马鱼同源性最高,为80%,与其他物种的同源性在30%~80%之间。系统进化树分析显示,鱼类的GDF9基因独立聚成一支,其中日本白鲫的GDF9基因与斑马鱼的GDF9基因聚成一支;鱼类的BMP15基因独立聚成一支,其中日本白鲫的BMP15基因与斑马鱼的BMP15基因聚成一支。半定量PCR结果显示,BMP15 mRNA在脾脏、肝脏、鳃、脑、心脏、肌肉、肾脏、卵巢中均有表达,其中卵巢中表达量最高;GDF9 mRNA在肝脏、脑、心脏、肌肉、卵巢中均有表达,而在脾脏、鳃、肾脏中表达量极低或不表达,在卵巢中表达量最高,为进一步研究日本白鲫GDF9与BMP15基因的结构与功能奠定了基础。     

甜玉米类胡萝卜素合成关键基因PSY1、LCYE和CrtRB1的功能分析

【目的】鉴定玉米类胡萝卜素合成关键基因PSY1、LCYE和CrtRB1的功能标记在47份甜玉米骨干自交系中的多态性和对类胡萝卜素各组分含量的影响,为了解玉米类胡萝卜素合成关键基因的功能及维生素A源强化育种提供参考和依据.【方法】以47份甜玉米骨干自交系为材料,用高效液相色谱法检测籽粒乳熟期类胡萝卜素各组分的含量,合成基因PSY1、LCYE和CrtRB1的6个功能标记并在47份甜玉米自交系中检测其基因型,结合基因型和类胡萝卜素各组分的含量,检测3个关键基因的单倍型效应,并分析联合单倍型效应.【结果和结论】除CrtRB1基因的标记Indel4未检出多态性,其余标记均检测出多态性.PSY1的Indel1和Indel4组成的单倍型可解释玉米黄质和总类胡萝卜素含量表型变异的14.81%和13.00%,LCYE的5'Indel和3'Indel位点分别可解释β-胡萝卜素、维生素A源和总类胡萝卜素含量表型变异的15.77%、20.75%和15.92%,CrtRB1的标记3'TE未检测出显著性.基因PSY1、LCYE和CrtRB1组成的联合单倍型分别可解释β-胡萝卜素、维生素A源和总类胡萝卜素含量表型变异的37.20%、40.71%和41.11%.基因间联合单倍型效应高于单基因单倍型效应.PSY1和LCYE有利等位基因对甜玉米中类胡萝卜素的合成有重要影响,其功能标记可用于分子标记辅助选择,为甜玉米的维生素A源强化育种奠定了基础.     

甘薯抗草甘膦生理指标及其相关基因EPSPS和AKR的表达

【目的】研究草甘膦胁迫下甘薯生理指标以及EPSPS和AKR 2个基因相对表达水平的变化,探讨甘薯耐草甘膦的分子机制。【方法】选取对草甘膦敏感性不同的2个甘薯品种N3589(草甘膦敏感型品种)和鄂薯11(草甘膦抗性品种)为试验材料,以喷施清水为对照,研究喷施草甘膦后甘薯莽草酸和脯氨酸含量及根系活力的变化,以及EPSPS和AKR基因的表达情况。【结果】与喷施清水对照相比,喷施草甘膦后,草甘膦敏感型甘薯品种N3589叶片的莽草酸含量显著升高,草甘膦抗性甘薯品种鄂薯11的莽草酸含量升高不显著;2个品种甘薯块根和叶片的脯氨酸含量均显著升高;植株的根系活力均显著降低。q-PCR结果显示,在喷施草甘膦后,草甘膦敏感型甘薯品种N3589的EPSPS基因显著下调,AKR基因先上调表达后下调表达;而草甘膦抗性甘薯品种鄂薯11的EPSPS基因显著上调,AKR基因先下调表达后上调表达。【结论】甘薯耐草甘膦主要是因为喷施草甘膦之后,EPSPS基因迅速上调表达,从而减少体内莽草酸累积对植株造成的伤害;与此同时,喷施草甘膦后AKR基因迅速上调表达,参与了甘薯体内草甘膦的代谢。     

巨桉EgrCBF3基因的克隆与逆境响应表达分析

【目的】克隆巨桉(Eucalyptus grandis)抗逆相关基因EgrCBF3(GenBank登录号:JQ068829)的全长cDNA序列,分析EgrCBF3在低温、干旱、脱落酸(ABA)处理和高盐条件下的表达。【方法】利用RT-PCR结合RACE技术,克隆巨桉抗逆相关基因EgrCBF3全长cDNA序列;分析正常条件下,巨桉根、茎和叶中EgrCBF3的表达情况;同时采用qRT-PCR,分析不同低温(0,2,4,6,8℃)和4℃处理不同时间(2,4,8,24和48h),以及干旱、ABA和高盐等逆境条件下EgrCBF3的响应表达情况。【结果】EgrCBF3cDNA全长1 161bp,含有1个675bp的ORF,编码224个氨基酸,包含1个AP2结构域。该基因编码的蛋白与蓝桉中的CBF蛋白同源性最高,达97%。EgrCBF3在巨桉的叶、茎和根中均有表达,但表达量无明显差异。对不同低温和4℃不同处理时间条件下EgrCBF3表达的qRT-PCR分析表明,EgrCBF3基因受低温诱导,在2℃条件下诱导表达量最强;在4℃条件下随低温时间的延长,其诱导表达特性不变,仅略有波动。在100μmol/L ABA、200mmol/L NaCl和干旱处理条件下,EgrCBF3的表达不受ABA和盐胁迫的影响,但在干旱胁迫下被诱导。【结论】EgrCBF3响应低温胁迫诱导,同时可能也参与了干旱胁迫的逆境响应机制。     

玉米ZmPGP1基因启动子的克隆及结构功能分析

为分析玉米ZmPGP1基因启动子的功能,利用巢式PCR方法克隆出了玉米ZmPGP1基因的启动子调控区,并将该启动子与GUS基因融合,通过基因枪法转入玉米(Zea mays)中,分析ZmPGP1启动子表达特性。结果显示,在玉米中克隆出ZmPGP1基因5′端上游1 090bp的启动子序列,该启动子序列包括光响应元件、激素响应元件和胁迫诱导及发育相关顺式作用元件。GUS染色表明ZmPGP1基因在玉米幼苗的茎部、叶子及根中都有表达,其中茎的节间处以及叶鞘部位表达量较高,这与ZmPGP1基因的Real-time PCR分析结果一致。研究结果进一步阐明ZmPGP1基因的功能以及作用机理。