透明颤菌vgb基因在枯草芽孢杆菌中的整合表达

【目的】将透明颤菌血红蛋白(VHb)基因(vgb)在枯草芽孢杆菌中进行整合表达,提高β-半乳糖苷酶的产量。【方法】用枯草芽孢杆菌整合载体pA01和启动子P43构建vgb基因的整合表达载体pA-vgb,通过双交叉整合方式,将vgb基因整合到枯草芽孢杆菌DB104:bga的染色体上,构建枯草芽孢杆菌DB104:vbga。采用PCR和Southern blot对DB104:vbga进行检测,并通过发酵摇瓶试验研究VHb对β-半乳糖苷酶产量的作用。【结果】PCR与Southern blot检测结果表明,枯草芽孢杆菌DB104:vbga中vgb基因整合位置正确,且表达的VHb蛋白具有生物学活性。摇瓶试验结果表明,在转速250 r/min条件下,枯草芽孢杆菌DB104:vbga与DB104:bga的β-半乳糖苷酶活性无显著差异;在150 r/min的限氧条件下,vgb基因的表达促使DB104:vbga的β-半乳糖苷酶活性较DB104:bga提高了14.9%。【结论】vgb基因可用于提高枯草芽孢杆菌目的蛋白的产量。     

苏云金芽孢杆菌几丁质酶基因chiA在枯草芽孢杆菌中的分泌表达

[目的]研究来源于苏云金芽孢杆菌的几丁质酶基因chiA在枯草芽孢杆菌中的表达情况。[方法]以苏云金芽孢杆菌染色体DNA为模板,PCR扩增获取几丁质酶基因chiA,将其与枯草芽孢杆菌表达载体pHSG连接,构建重组菌,经IPTG诱导后,检测培养液中的几丁质酶活性。[结果]扩增得到几丁质酶基因chiA大小为2.5 kb。构建的重组菌对底物[4-MU-(GlcNAc)3]显示出一定的水解活性,培养液酶活约为2.8 U/ml,而pHSG空质粒转化子在同样条件下其培养液没有明显酶活。该重组酶的最适pH值为6.5,最适反应温度为50℃,与苏云金芽孢杆菌自身产生的几丁质酶性质一致。[结论]几丁质酶基因chiA能在枯草芽孢杆菌中成功表达,表达产物可成功分泌到细胞外。     

枯草芽孢杆菌信号肽筛选载体的构建及木聚糖酶基因的表达

构建枯草芽孢杆菌信号肽筛选载体并用菌体自身信号肽引导表达外源木聚糖酶基因,为枯草芽孢杆菌木聚糖酶高效分泌表达系统的建立奠定基础。利用基因工程的原理和方法,将壮观霉素抗性基因(spec)与短小芽孢杆菌的木聚糖酶基因(xynA)克隆到大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭表达载体GJ148上,构建枯草芽孢杆菌信号肽筛选载体pYG,将枯草芽孢杆菌信号肽Epr克隆到已构建载体上,以枯草芽孢杆菌WB700为表达宿主,引导木聚糖酶基因进行表达。最终成功构建枯草芽孢杆菌信号肽筛选载体pYG,将枯草芽孢杆菌信号肽Epr克隆到pYG上,在WB700中引导并表达木聚糖酶基因。试验证明信号肽筛选载体可以成功构建,在克隆入信号肽后可成功表达木聚糖酶基因,为信号肽的系统性筛选和木聚糖酶高效表达提供依据。     

枯草芽孢杆菌α-淀粉酶基因的克隆及表达

采用鸟枪法克隆到了枯草芽孢杆菌α－淀粉酶基因,试验证实,已报道的α－淀粉酶的基因大小为２ｋｂ左右,因此回收３￣７ｋｂ的目的片段较适宜,对质粒去磷可防止自连,并能显著提高外源片段的连接效率,采用扩大酶连的方法有助于酶连产物的进一步提高,高效感受态比普通感受态构建基因文库效率要高２个数量级。高效,快捷的鉴定α－淀粉酶的筛选培养基是克隆α－淀粉酶基因必不可少的条件。     

枯草芽孢杆菌apr基因的克隆和表达

通过PCR技术克隆枯草芽孢杆菌蛋白酶apr基因,并分别对该基因和编码蛋白进行同源性比较和酶学性质分析。结果表明,apr基因序列全长1509bp,编码503个氨基酸,同源性100%;克隆到表达质粒pET-22b(+)后,将重组质粒经热激转化至大肠杆菌BL21(DE3)中,IPTG诱导表达,蛋白分子质量为55ku。测定酶活为19500U·mL-1。该基因克隆和表达的成功对于制备大豆抗氧化肽具有实际应用价值,对进一步深入研究其生物学和酶学机制具有重要意义。     

枯草芽孢杆菌bioI基因的克隆和高效表达及BioI蛋白的纯化

【目的】克隆和表达枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)bioI基因并纯化表达产物。【方法】提取B.sub-tilis1A747基因组DNA,从中扩增bioI基因并将其克隆到大肠杆菌(Escherichia coli)的表达载体pET-28a(+)上,构建bioI的表达载体pET28a-bioI。将重组质粒pET28a-bioI电转化到大肠杆菌表达宿主BL21(DE3)中进行IPTG诱导表达,对表达产物BioI用Ni2+-NAT亲和层析树脂进行纯化,并对纯化蛋白进行波长扫描。【结果】成功构建了表达载体pET28a-bioI,酶切鉴定结果正确并在大肠杆菌中表达成功,经IPTG诱导8 h后,重组蛋白BioI的表达量占总可溶性蛋白的20%;波长扫描发现,重组蛋白BioI在400 nm处有特征吸收峰。【结论】bioI基因克隆表达成功,其表达产物BioI具有P450蛋白的特征,为蛋白性质的进一步研究和抗体的制备奠定了基础。     

生防枯草芽孢杆菌B579芽孢形成关键基因的研究

[目的]克隆生防菌芽孢形成关键基因spo0A启动子Pspo0A,并检测其特性.[方法]从生防菌B579 DNA中,经PCR扩增芽孢形成关键基因spo0A启动子Pspo0A,插入载体pGFP,构建重组表达质粒pGFP-Pspo0A.[结果]重组表达质粒经双酶切和PCR鉴定,证明构建正确,测序,结果与GenBank中的序列同源性为98％.[结论]该方法获得了含有绿色荧光蛋白基因和芽孢形成关键基因Spo0A的重组质粒,为进一步研究生防菌B579芽孢形成规律奠定了基础.     

枯草芽孢杆菌224 yplQ基因敲除及其对溶血性的影响

为了确定枯草芽孢杆菌224(Bacillus subtilis 224,BS224)的溶血基因或引起溶血的主效基因,以枯草芽孢杆菌224基因组DNA为模板,用PCR方法分别扩增yplQ基因上游约1.0 kb和yplQ基因下游0.5 kb两段DNA序列,并以携带新霉素抗性基因的重组质粒pMD18-T-neo为骨架,构建基于yplQ基因位点的基因阻断质粒pMD18-T-neo-yplQ,线性化后电转化至枯草芽孢杆菌224,通过新霉素抗性平板得到36个neor抗性转化子,基因组PCR鉴定和核苷酸测序证明,确定yplQ18为yplQ基因缺失菌株,将其接种到5%的绵羊血琼脂平板上进行溶血性检测,仍能引起溶血。结果表明,单独敲除枯草芽孢杆菌224染色体上yplQ基因对菌株的溶血性无影响或影响不大。     

应激诱导木聚糖酶基因在枯草芽孢杆菌中表达

克隆含有信号肽碱性木聚糖酶基因(xynA)片段与依赖转录起始因子σB的启动子PgsiB片段,将其克隆至实验室前期构建的大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭载体上,并转化入枯草芽孢杆菌WB700菌株,获得重组菌BXS-W.当细菌生长至对数期中期时,施加不同的应激处理,采用DNS法测定木聚糖酶活性.结果显示,获得了xynA与PgsiB片段;成功构建表达载体pBXS,并获得重组菌株BXS-W;应激试验表明,施加的5种应激条件均极显著提高(P＜0.01)木聚糖酶基因的表达量,其中以乙醇应激效果最好.     

枯草芽孢杆菌GMP还原酶基因（guaC）突变株的构建

以受体菌的guaC基因为同源重组的指导序列,构建了整合表达载体pGT9GH,通过双交叉同源重组的方法将线性化的pGT9GH整合到受体菌的染色体上,构建了guaC基因的缺失突变株B.subtilis GJ07,并在guaC基因的5′端和3′端之间引入了一个拷贝核黄素操纵子,通过PCR方法验证了同源重组的正确性,最后测定了同源重组突变后的菌株GJ07的核黄素产量。结果表明：同源重组突变后的菌株GJ07的核黄素产量明显高于初始菌株GJ06,发酵60 h提高了24.5%。     

一株枯草芽孢杆菌环状糊精葡糖基转移酶的提取、纯化和性质

枯草芽孢杆菌SC3-2是一株高产环状糊精葡糖基转移酶(CGTase)的菌株,将其发酵液通过(NH4)2SO4分级沉淀、DEAE-纤维素(DEAE-cellulose-52)离子交换层析和Sephadex S-200凝胶层析进行纯化。经过几步纯化后CGTase比活力达到4 923 U/mg,纯化倍数达11.37倍,回收率为20%。通过对酶性质的测定,结果表明:在pH6.5,30℃条件下,菌种产酶量最高;在pH5.5~7.5,40℃以内该酶较为稳定;Mn2+和Ca2+对酶活具有一定的促进作用;EDTA、Na+、Fe3+、Cr3+、Zn2+、Cu2+对酶活影响不大;SDS、Ag+和Hg+使酶几乎失去活性。本研究为环状糊精葡糖基转移酶的应用提供了依据。     

2株枯草芽孢杆菌的分离鉴定及特性研究

【目的】寻求适合制作水产类微生态制剂的益生菌。【方法】从养鱼塘底泥和健康鲫鱼Carassius auratus肠道中分离芽孢杆菌,结合细菌形态学、生理生化特征和16S rRNA序列分析对其进行鉴定,对菌株安全性、高温耐受性、酸性耐受性、拮抗性及产酶情况等特性进行研究。【结果】分离到2株芽孢杆菌,分别命名为B1和B2,细菌形态学、生理生化特征和16S rRNA序列分析的结果显示,B1和B2均为枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis。特性研究结果证实B1、B2菌株都具有较好的安全性、高温耐受性和酸性耐受性,可对致病性大肠埃希菌Escherichia coli、金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus、嗜水气单胞菌Aeromonas hydrophila以及温和气单胞菌A.sobria有良好的体外抑菌能力,均具有产脂肪酶、淀粉酶、蛋白酶和纤维素酶的能力。【结论】分离到2株性能优良的枯草芽孢杆菌,可将其作为水产微生态制剂的候选菌株。     

麦芽糖诱导耐碱性木聚糖酶基因在枯草芽孢杆菌中的表达

考察麦芽糖诱导木聚糖酶基因在枯草芽孢杆菌WB700中的表达。以麦芽糖为诱导剂,对诱导质量分数、诱导时机、诱导温度和麦芽糖的添加方式等主要因素进行了分析比较。结果表明,当菌体生长至发酵液吸光值OD600达到1.3时加入终质量分数为4.5%麦芽糖,37℃,持续诱导10 h,木聚糖酶活力达到最高,为56.32 U。通过SDS-PAGE检测对比显示:经麦芽糖诱导表达的木聚糖酶比不加麦芽糖诱导的木聚糖酶表达量高,表达效果更明显。     

枯草芽孢杆菌对百合枯萎病的防治效果

采用菌丝生长速率法及孢子萌发法,研究枯草芽孢杆菌对百合枯萎病菌的抑杀效应。枯草芽孢杆菌无菌滤液在一定体积分数范围内能有效抑制枯萎病菌菌丝生长,减少孢子萌发,且随着无菌滤液体积分数的增加,孢子萌发抑制率也增大。体积分数为20%的枯草芽孢杆菌无菌滤液,处理后7d抑制率可达78.8%。体积分数为60%时,可完全抑制孢子萌发。盆栽防治试验表明,枯草芽孢杆菌菌液对百合枯萎病的发病抑制率达65.3%。且该菌液对百合的生长有一定的促生功效,说明枯草芽孢杆菌对百合枯萎病有抑菌和防病作用,且抑菌作用随枯草芽孢杆菌菌液体积分数的增加而增强。     

枯草芽孢杆菌高效表达系统的构建

【目的】优化枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)启动子和表达宿主,构建其高效的表达系统,为重组枯草芽孢杆菌的研究和应用奠定基础。【方法】以β-半乳糖苷酶编码基因为报告基因,以诱导型的枯草芽孢杆菌麦芽糖操纵元启动子为调控元件、大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭质粒为载体骨架,构建枯草芽孢杆菌高效表达载体pGJ222,将其电转化到B.subtilis 1A747菌株后进行诱导表达试验和葡萄糖抑制试验。利用同源重组的方法,用枯草芽孢杆菌组成型启动子P43替换了B.subtilis野生型菌株1A747麦芽糖操纵元的上游调控序列,得到优化重组表达宿主菌B.subtilis BCYL,将pGJ222转入B.subtilis BCYL后,对优化的表达系统进行诱导表达试验和葡萄糖抑制试验。分别用PCR扩增大肠杆菌和枯草芽孢杆菌维生素B12合成前期途径的谷氨酰-tRNA合成酶编码基因hemA,构建其表达载体,并将其转化B.subtilis BCYL中进行诱导表达检测。【结果】成功构建了枯草芽孢杆菌高效表达载体pGJ222,并实现了β-半乳糖苷酶的高效表达,其表达量占总可溶性蛋白的18%;质量分数5%的麦芽糖诱导24hβ-半乳糖苷酶活达到16U/mL。成功获得了优化重组表达宿主菌B.subtilis BCYL,其可使β-半乳糖苷酶活性有大幅度提高,在质量分数5%麦芽糖诱导24hβ-半乳糖苷酶活达到21U/mL,葡萄糖的抑制作用明显减弱。【结论】通过对启动子和表达宿主的优化,获得了枯草芽孢杆菌高效表达系统,为枯草芽孢杆菌基因工程研究提供了有力工具。     

枯草芽孢杆菌XF1菌株中XFsacA基因的克隆及功能验证

枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis XF1是从土壤中分离的一株利用蔗糖快、能高效防治根肿病的专利菌株.为探明其高效的蔗糖代谢机制,用PCR从该菌中扩增到蔗糖代谢关键基因蔗糖-6-磷酸水解酶基因(XFsacA基因),其编码的蛋白质氨基酸序列与枯草芽孢杆菌B168菌株中的XFsacA基因有97%的相似性,且发生了12个氨基酸突变.将该基因中约1.4 kb的编码框序列连接到表达载体pQE30上,构建了重组表达质粒pQE30-XFsacA,该质粒转入到不能利用蔗糖的Escherichia coli BL21中,后者能在以蔗糖为唯一碳源的M9无机离子培养基中正常生长,并表达出了一条约54 000蛋白条带.结果预示XFsacA基因氨基酸序列的替代可能是XF1高效利用蔗糖的基础,同时XFsacA基因的克隆与其在E.coli中的表达研究,为利用蔗糖发酵的工程E.coli构建奠定了基础.     

磁化水对根瘤菌和生防枯草杆菌的生物效应

以苜蓿根瘤菌(Sinorhizobium meliloti)XGL026和生防枯草杆菌(Bacillus subtilis)2-4菌株为材料,研究4 000Gs和20 000Gs的磁处理水对其生长和功能的影响。结果表明,4 000Gs磁场强度下处理的磁化水对苜蓿根瘤菌生长繁殖有明显促进作用,菌体繁殖速度加快,培养液浓度增加,活菌数显著提高。4 000Gs磁化1次(T1)、2次(T2)和3次(T3)处理活菌数最大值分别较对照(普通水)增加11.02%、76.92%、72.47%,T2、T3处理缩短了达到最高活菌数的时间。苜蓿盆栽试验表明磁化水处理的单株结瘤数较对照平均增加5~11个;接种T3磁化水培养的根瘤菌+T3磁化水浇灌处理,苜蓿结瘤数的增加幅度最显著(P0.01)。试验发现,4 000Gs磁化1次(T1)、2次(T2)的磁处理水对枯草杆菌前期生长速度有一定延缓,但对生长量影响不大。4 000Gs磁化3次(T3)和20 000Gs磁化1次(T4)的磁处理水对枯草杆菌的整个生长期都有显著的抑制作用,活菌数较对照降低33.17%和93.52%(P0.01)。平板对峙试验测定磁处理水培养的枯草杆菌对棉花黄萎病菌的抑菌效果显示,与对照相比,T1磁处理水对枯草芽孢杆菌的抑菌能力有一定增效作用,而T3和T4磁处理水培养的枯草杆菌对棉花黄萎菌的抑菌效果显著减弱(P0.01)。