百合花特异启动子PchsA表达载体的构建及功能分析

【目的】分析从百合中克隆获得的查耳酮合成酶基因(chsA)启动子的组织表达特性。【方法】将chsA启动子片段插入到双元表达载体pCAMBIA 1381中,成功构建了植物表达载体pCAMBIA-CHS,通过根癌农杆菌EHA 105转化拟南芥,用50 mg/L潮霉素对转化植株进行筛选,对阳性植株进行PCR检测和GUS组织化学分析。【结果】PCR检测表明,chsA启动子片段已经整合到拟南芥基因组中,GUS组织化学分析显示,在拟南芥花序中有很强的GUS活性,叶腋处有微量表达,其他组织中不表达。【结论】初步证明百合chsA启动子为花特异表达启动子。     

大豆紫色酸性磷酸酶基因GmPAP4启动子结构与活性分析

【目的】克隆GmPAP4启动子(PAP4-pro),并分析其表达特性,为进一步研究其作用机制奠定基础。【方法】依据GmPAP4 c DNA序列(Gen Bank No.HQ162477),通过比对大豆参考基因组,设计特异引物,克隆GmPAP4启动子序列,通过PLACE与Plant CARE在线生物信息学数据库预测该启动子相关调控元件。构建GmPAP4启动子驱动GUS表达载体(PAP4-pro-GUS)并转化根癌农杆菌GV3101;通过Floral dip法将PAP4-pro-GUS转化拟南芥,利用卡那霉素(Kan)抗性筛选和特异引物的PCR鉴定,最终获得T3转基因拟南芥。通过对T_3转基因拟南芥不同组织GUS染色,分析启动子的组织表达特性,将T3转基因拟南芥通过适磷和植酸磷处理,20 d后,取其根部进行GUS活性和表达分析,研究启动子对不同磷环境的响应。【结果】克隆了GmPAP4上游启动子序列,通过PLACE与Plant CARE在线生物信息学数据库预测显示,GmPAP4启动子除含有启动子核心的调控元件外,还含有(1)组织特异调控元件:as1(根系特异表达调控元件)和Skn-1_motif(胚乳特异表达调控元件);(2)应答元件:TC-rich repeats(逆境胁迫反应调控元件)和Box-W3(真菌应答相关调控元件);(3)结合位点:MBS(MYB转录因子的结合位点)等。不同组织GUS染色结果显示,转基因拟南芥整个根系GUS染色较深,茎、叶中仅微管组织有较明显GUS染色,花瓣微管组织中也能观察到微弱GUS染色。定量PCR结果显示,植酸磷处理条件下转基因拟南芥根系GUS表达比适磷处理提高了1.3倍(P0.05);同时GUS活性测定显示,与适磷处理相比,植酸磷处理条件下转基因拟南芥根系GUS活性提高了1.9倍(P0.05)。【结论】获得大豆GmPAP4启动子,通过不同组织GUS染色和不同磷环境GUS表达分析显示该启动子主要在根部且受低磷信号诱导表达,为诱导型启动子。     

苹果6-磷酸山梨醇脱氢酶基因启动子的转化及其转录活性

【目的】研究6-磷酸山梨醇脱氢酶基因启动子(S6PDHp)的组织表达特点。【方法】利用Gateway技术构建了S6PDHp与GUS基因的融合表达载体,然后通过农杆菌介导法转化番茄"中蔬5号",对转基因植株进行PCR检测,对鉴定为阳性的植株进行GUS组织化学染色,验证S6PDHp的组织表达特性。【结果】将S6PDHp-GUS融合表达载体转化番茄,经PCR检测显示,成功获得了转S6PDHp基因的阳性番茄植株。对阳性植株各组织器官的GUS化学染色和活性检测结果显示,除叶片外许多器官都有很强的GUS活性,且在转基因番茄成熟期植株的茎部活性最高,根部活性最低;叶片从新叶到老叶的各个时期,GUS活性持续降低。【结论】S6PDHp表达在植物衰老过程中降低;且在转基因番茄茎部的GUS活性最强,说明该启动子具有组织表达特异性。     

拟南芥AtNUDT2启动子的分离及其功能分析

根据已发表的拟南芥基因组序列设计合成1对引物,以拟南芥基因组DNA为模板克隆AtNUDT2上游非编码区,并将其与pBAR－GUS3相连,构建了植物表达载体pNUD12P－GUS,采用以农杆菌GV3101介导的渗透法转化野生型拟南芥,通过除草剂筛选获得了一批抗性纯合子转基因植株。然后对转基因植株（2周幼苗）进行GUS活性的组织化学染色分析,并对3．5～4周的转基因植株叶片进行病原菌诱导表达分析。结果表明,已获得AtNUDT2启动子,且该启动子为组成型表达启动子;病原菌Pst．DC3000及风t．DC3000 AvrB对该启动子没有诱导作用。     

大豆豆荚特异性启动子的克隆及功能分析

【目的】克隆大豆豆荚特异性启动子,并对其进行功能分析,为研究抗病虫基因在大豆荚中的特异性表达奠定基础。【方法】利用PCR技术克隆得到豆荚特异性启动子(Pod Specific Promoter,PSP)的核心序列,用PSP序列取代质粒pBI121中的CaMV 35S启动子,构建与GUS基因融合的豆荚特异性报告载体pPSP-GUS,通过农杆菌介导法转化烟草"NC89",对转基因植株进行分子生物学检测,将鉴定为阳性的植株经GUS组织化学染色,验证PSP片段的功能。【结果】所获得的豆荚特异性启动子PSP大小为1 270bp,与已报道序列的同源性为98%,具有多种典型的启动子表达调控元件,如A/T-rich core、CAATBOX、TATABOX、GATABOX等。将pPSP-GUS质粒转化烟草后,经PCR和Southern blot检测结果显示,成功获得了转基因阳性烟草植株。GUS活性检测结果显示,在转pPSPGUS质粒的烟草根和叶片中均未检测到GUS活性,在萼片中可检测到低水平的GUS活性;而在花荚中可检测到高水平的GUS活性,且明显高于转pBI121质粒的对照植株。【结论】克隆得到的豆荚特异性启动子PSP片段具有启动基因在豆荚中特异性表达的功能。     

玉米根部特异性启动子的克隆及功能分析

【目的】从玉米幼根基因组DNA中克隆β-葡萄糖苷酶基因根部特异性启动子序列ZmGLU1P,并对其功能进行分析。【方法】利用PCR技术从玉米品种P138幼根基因组DNA中克隆玉米根部特异性启动子片段ZmGLU1P,将其与GUS基因融合,构建植物表达载体pCAMBIA121-ZmGLU1P,转化到EHA105根癌农杆菌中,通过根癌农杆菌介导法转化烟草NC89,对转化烟草植株进行PCR和Southern杂交检测。采集PCR和Southern杂交检测为阳性的转基因烟草的根、茎、叶,进行GUS活性的组织染色检测。【结果】克隆获得了ZmGLU1P片段,其长度为1 846 bp,与已报道的序列同源性达99%以上。转基因烟草植株的PCR和Southern杂交结果显示,成功地获得了转基因阳性植株;GUS活性检测表明,根中GUS活性最强,而在茎和叶等组织中GUS活性甚微,表明ZmGLU1P片段具有根部特异性启动子功能。【结论】玉米β-葡萄糖苷酶基因上游1 846 bp的片段ZmGLU1P具有根部特异性启动子功能,为根部特异性启动子。     

水稻基因启动子OsBTF3p的克隆和启动活性分析

 【目的】分子克隆水稻基因OsBTF3启动子片段,明确其对靶基因表达的启动作用,为抗病转基因水稻研究提供理论依据和启动子元件材料。【方法】对OsBTF3编码区上游1387 bp的启动子（OsBTF3p）序列进行了克隆和序列分析,构建了OsBTF3p∷GUS融合基因植物表达载体pCAM-OsBTF3p,利用农杆菌介导的水稻遗传转化,获得了39株OsBTF3p∷GUS转基因植株,对OsBTF3p进行了启动活性、组织特异性及病原菌诱导性分析。【结果】分子克隆了OsBTF3p片段,其序列与GenBank中的已知序列一致。在转基因水稻愈伤组织中能够检测到GUS活性,表明该启动子具有启动活性。在转基因水稻叶片维管束组织和根部组织能检测到GUS活性。水稻白叶枯病菌(Xoo)侵染后OsBTF3p驱动的GUS活性明显地上调表达。【结论】OsBTF3p具有驱动GUS基因表达的启动活性、组织表达特异性和病原菌诱导性。     

大豆种子特异性启动子的克隆及功能分析

【目的】从大豆中克隆得到β-伴球蛋白α亚基基因的启动子序列7αP,并对其进行功能分析。【方法】利用PCR技术从大豆基因组DNA中分离β-伴球蛋白α亚基基因启动子序列7αP,将其与GUS基因融合,构建种子特异性表达载体p7αP-GUS,通过根癌农杆菌介导法转化烟草(Nicotiana tabacum)NC89,对再生植株进行PCR、Southern blot检测和GUS组织化学分析。【结果】序列分析表明,7αP长度为1 382 bp,其中含有多种种子特异性启动子的序列元件,如RY重复序列元件、E-box、SEF1-motif、SEF4-motif(、CA)n、Dc3启动子结合因子和ACGT序列元件及一些诱导物应答元件。转基因植株的PCR和Southern blot结果显示,成功地获得了转基因阳性植株;GUS活性检测表明,仅能在种子中检测到GUS活性,而在根、茎和叶等其他组织中均未检测到GUS活性。【结论】大豆β-伴球蛋白α亚基基因上游1 382 bp片段具有种子特异性启动子功能,7αP为种子特异性启动子。     

LYC-b基因反义表达对番茄果实番茄红素含量的影响

【目的】研究番茄红素β-环化酶(LYC-b)基因反义表达对番茄果实中番茄红素含量的影响,为番茄品质育种提供新方法。【方法】以番茄品种"TTI1117A"和"灵光3号"为材料,构建了分别由CaMV35S启动子驱动的GUS标记基因和反义LYC-b5′基因双价植物表达载体,通过农杆菌GV3101介导,将基因整合到番茄基因组中,采用GUS、PCR以及RT-PCR、Northern杂交进行检测,并测定了转基因植株果实中的番茄红素含量。【结果】由GUS、PCR检测结果可知,筛选出1株"TTI1117A"和4株"灵光3号"转基因植株;RT-PCR、Northern杂交检测结果表明,目的基因在RNA水平上已经表达;对番茄果实中番茄红素含量的测定结果表明,转基因植株果实中番茄红素含量均高于未转基因植株。【结论】LYC-b基因的反义表达具有提高番茄果实中番茄红素含量的作用。     

不结球白菜硝酸还原酶基因BcNR的克隆及其在拟南芥中的转化

 【目的】克隆不结球白菜硝酸还原酶基因（BcNR ）,并转化拟南芥做初步的功能鉴定。【方法】采用分段RT-PCR及3′RACE和5′RACE技术克隆了BcNR基因的全长cDNA,利用生物信息学方法进行序列分析和蛋白结构分析。构建pCAM-BcNR植物过量表达载体,通过农杆菌介导的真空渗透法将其转入野生拟南芥中,经抗性筛选及PCR验证获得T0代转基因植株,用Real-time PCR方法对30 mmol?L-1 KNO3溶液处理的转基因拟南芥的硝酸还原酶基因表达进行检测,并测定转基因植株的硝酸还原酶活性。【结果】获得了编码不结球白菜硝酸还原酶基因(BcNR )的cDNA全序列3 049 bp,包含有2 733 bp的开放阅读框,编码910个氨基酸。其氨基酸序列与拟南芥、烟草、甘蓝型油菜、马铃薯等编码的氨基酸序列具有较高同源性。蛋白质结构域分析表明,所推导的氨基酸序列具有完整的硝酸还原酶结构,同时证明从不结球白菜中克隆的这条基因属于NADH-NR型。GenBank登录号为EU662272。转基因拟南芥T0代植株进行GUS基因PCR检测,证明重组质粒已整合到转基因植株基因组中。硝酸盐处理后的转基因植株硝酸还原酶基因的表达比野生型显著提高,且硝酸还原酶活性有不同程度的提高。【结论】本研究首次从不结球白菜中克隆获得BcNR基因的全长cDNA序列,揭示了其序列特征并对其进行了初步的功能鉴定,为进一步利用该基因开展蔬菜硝酸盐含量的基因调控研究奠定了基础。