柔嫩艾美耳球虫杨凌株RB1-a基因的克隆表达及免疫保护性研究

【目的】对柔嫩艾美耳球虫(E.tenella)杨凌株RB1-a基因进行克隆与表达,检测表达产物的免疫保护性,为鸡球虫基因工程疫苗的研制奠定基础。【方法】以纯化的E.tenella杨凌株孢子化卵囊的总RNA为模板,用RT-PCR方法扩增出其RB1-a基因,测序后进行序列分析。然后将RB1-a基因N端不含信号肽序列克隆到表达载体pET-32a(+)中,构建pET-32a-RB1-a重组质粒,并在大肠埃希菌BL21(DE3)中诱导表达出重组蛋白,将重组蛋白纯化后免疫雏鸡,对其免疫效果进行评价。【结果】柔嫩艾美耳球虫杨凌株RB1-a基因的开放阅读框(ORF)包含618个碱基,编码205个氨基酸,与GenBank报道的柔嫩艾美耳球虫PAPa46株ORF序列相似性为99.84%,两者推导的氨基酸序列相同。SDS-PAGE分析表明,重组质粒表达分子质量为42ku的融合蛋白。免疫效果测定结果显示,RB1-a免疫组和RB1-a+佐剂免疫组的相对增重率分别为64.2%和69.4%,卵囊减少率分别达37.22%和30.56%,抗球虫指数分别为146.2和150.4。【结论】RB1-a基因具有很强的保守性,种间差异不大;RB1-a重组蛋白具有一定的免疫保护效果。     

柔嫩艾美耳球虫YZ株SO7基因的克隆与序列分析

对柔嫩艾美耳球虫(E im eria tenella)YZ株折光体SO 7基因进行克隆,并对其核苷酸及氨基酸进行序列分析。以纯化的发育7 h的E.tenella YZ株卵囊孢子提取的总RNA为模板,设计特异性引物,应用两步法RT-PCR技术扩增出SO 7基因特异性片段。将扩增出的片段插入pUCm-T载体,随机选择经蓝白斑筛选、PCR及酶切鉴定为阳性的两个克隆分别进行测序分析,并对结果进行验证。结果表明:两个阳性克隆所含插入片段的DNA序列完全一致,含全长为651个核苷酸的开放阅读框,富含AGC和CTG重复序列,编码区核苷酸与LS18株和B J株的同源性都为99.5%,与HB株同源性为99.4%,与GD株同源性为99.7%。其推测的氨基酸序列与LS18株和GD株的同源性都为99.1%,与B J和HB株同源性为98.6%。通过对其蛋白抗原性、表面可能性、亲水性、柔性区、二级结构等参数预测表明,YZ株核苷酸的变异未引起其蛋白主要特性和B细胞表位的变化。该结果为研制E.tenella的基因工程疫苗奠定了基础。     

不同地理株及其杂交株柔嫩艾美耳球虫免疫保护性研究

将不同地理株及其杂交株的柔嫩艾美耳球虫的孢子化卵囊饲喂肉鸡,选择12日龄的AA肉鸡进行免疫,首免的剂量为1×104。免疫10d后攻虫,剂量为1×103。攻虫后以排卵数、增重、粪便记分、盲肠病变记分等指标测定其免疫功能,并计算各株的保护率。结果表明:杂交株的柔嫩艾美耳球虫的免疫保护率明显高于亲本株。     

柔嫩艾美耳球虫LZ株MIC-5基因的克隆与表达

提取柔嫩艾美耳球虫兰州株孢子化卵囊总RNA,运用RT-PCR技术扩增Et MIC-5基因片段进行测序,并克隆入大肠杆菌表达载体pET28a中进行诱导表达.结果表明,该基因片段长918 bp,编码306个氨基酸.与GenBank报道的柔嫩艾美耳球虫Houghton株MIC-5基因相比,核苷酸和推导的氨基酸序列同源性为99.2%和99.6%.在推导的MIC-5氨基酸序列中,第15~89、90~160、173~242和245~306位保守的cys残基形成4个Apple样结构域(A-domain),推测该蛋白可能在虫体与宿主细胞的黏附中起重要作用.转化重组质粒pETMIC-5的BL21(DE3)经IPTG诱导后,SDS-PAGE和western blot分析证实目的蛋白成功表达,重组蛋白的表达量可占菌体蛋白的15.2%.     

柔嫩艾美耳球虫长春株克隆的建立

从柔嫩艾美耳球虫长春株(由单卵囊接种建立)挑选出单孢子囊,制备成单孢子囊胶囊,给鸡接种后建立5个克隆,传代后提取DNA,用已筛选的13条随机引物进行PCR扩增。结果表明:每个克隆均获得RAPD图谱,有特异条带。5个克隆中C2和C3相似值为0.993 1,C4和C5相似值为0.992 7,C1与C2和C4的相似值分别为0.931 6和0.875 3。鉴别结果表明C1为1个克隆,C2和C3为1个克隆,C4和C5为1个克隆,说明柔嫩艾美耳球虫卵囊中的4个孢子囊的基因组成不一致。     

柔嫩艾美耳球虫长春株的抗药性试验研究

对柔嫩艾美耳球虫长春株的抗药性进行试验研究。用最适抗球虫活性百分率、病变记分减少率、相对卵囊产量和抗球虫指数4项指标进行综合判定,观察柔嫩艾美耳球虫长春分离株对氯苯胍、克球粉、地克珠利、马杜拉霉素、氨丙啉、盐霉素、莫能菌素和常山酮的抗药性。表明:柔嫩艾美耳球虫长春分离株对地克珠利和马杜拉霉素敏感,对莫能菌素轻度耐药,对克球粉和常山酮中度耐药,对氯苯胍、氨丙啉和盐霉素重度耐药。本地区防治柔嫩艾美耳球虫可合理使用地克珠利、马杜拉霉素和莫能菌素,对克球粉、常山酮慎用,氯苯胍、氨丙啉和盐霉素暂停使用。     

鸡柔嫩艾美耳球虫免疫保护性研究

鸡的球虫病是危害现代化养鸡业的重大疫病。柔嫩艾美耳球虫(E．tenella)是球虫病爆发中致病性最强的虫种之一，它由Tyzzer于1927年命名为Eimeria tenella的。它具有严格的寄生部位，主要在鸡的盲肠，通过裂殖体在盲肠上皮细胞中大量繁殖，破坏肠粘膜，引发肠管发炎和上皮细胞崩解，鸡表现为排血便，严重的导致死亡。年龄在10～40日龄左右的雏鸡最容易感染，受害严重，死亡率可达80％以     

柔嫩艾美耳球虫F2杂交株Rhomboid基因在大肠杆菌中的表达

根据ET-Rhomboid基因开放阅读框,插入有利于表达的酶切位点设计引物,以虫体DNA为模板扩增并克隆了ET-Rhomboid基因,并将该基因与PET-28a(+)质粒载体连接,构建成了原核表达载体PET-ET-Rhomboid.将构建好的表达质粒转入大肠杆菌DE3,经IFTG诱导表达后,用SDS-PAGE检测表达产物,用蛋白印迹(Western blotting)检测其反应原性.结果表明:含重组质粒的工程菌有明显的表达产物为31 kD的融合蛋白,与推测的融合蛋白的分子量吻合,蛋白印迹检测具有反应原性.     

柔嫩艾美耳球虫杨陵株3-1E基因的克隆与序列分析

根据GenBank发表的鸡柔嫩艾美耳球虫(Ei meriatenella)3-1E基因的ORF设计一对引物,用RT-PCR方法从E.tenella杨陵(YL)株总RNA中扩增3-1E基因,并将扩增产物与pMD18-T easy载体进行连接并测序,用DNAstar 5.0软件对测序结果进行分析。结果表明,2009年分离的E.tenellaYL株3-1E基因与其他虫株相比,核苷酸有9个位点发生变化,其中7个位点的变化引起了相应氨基酸位点的改变,其他2个位点的变化未引起氨基酸的改变。对2006年和2009年分离的YL株3-1E基因的核苷酸进行了比对,结果发现,有两个核苷酸位点发生了变化。系统发育树分析表明,E.tenellaYL株3-1E基因同种间与E.tenella甘肃株遗传关系最近,同属间与E.acervulina法国株遗传关系最近。     

柔嫩艾美耳球虫GZ株子孢子表面抗原基因的克隆及序列分析

利用RT-PCR方法从柔嫩艾美耳球虫(Eimeria tenella)的孢子化10 h卵囊中扩增出了λMZ5-7基因,并把该基因片段克隆到pMD18-T载体上,对阳性克隆进行PCR鉴定及酶切分析并进行测序.结果表明,该序列全长936bp,为一完整的开放阅读框,与国外报道的柔嫩艾美耳球虫第二代裂殖子表面抗原基因λMz5-7的同源性为98%,氨基酸的同源性为95.6%.该基因的克隆有望用于基因工程苗的研究.     

柔嫩艾美耳球虫杨凌株3-1E基因的表达及其产物的生物活性分析

【目的】探讨原核表达的柔嫩艾美耳球虫杨凌株3-1E蛋白的生物学活性。【方法】将含有3-1E基因的pGEX-3-1E重组质粒转化大肠杆菌BL21,进行表达并对表达条件进行优化,表达产物纯化后进行Western-blot-ting分析。【结果】表达的3-1E重组蛋白相对分子质量为44.7 ku,与推导结果一致。在28℃、IPTG诱导浓度为0.5mmol/L的条件下诱导6 h,可溶性3-1E重组蛋白表达量最高。Western-blotting结果表明,3-1E重组蛋白可与兔抗鸡E.tenellaYL阳性血清发生反应。【结论】3-1E重组蛋白表达成功,表达产物具有免疫原性。     

兔出血症病毒YL株衣壳蛋白VP60基因在原核系统中的高效表达

为了在原核系统中高效表达兔出血症病毒(RHDV)衣壳蛋白VP60,应用RT-PCR方法从兔出血症病毒(RHDV)西北分离株YL中克隆出了衣壳蛋白VP60基因并测序,结果显示,YL株VP60基因全长1740 bp,GC含量为55.3%,已在GenBank中注册(登录号为DQ530363),VP60基因与中国RHDV最早期分离株WX84的VP60基因核苷酸序列同源性为93.0%,氨基酸序列同源性为95.8%。构建成功YL株VP60基因原核表达载体VP60-pET32a,转化到大肠杆菌表达菌株BL21(DE3)中。1 mmol/L IPTG诱导表达,SDS-PAGE检测结果显示,VP60融合蛋白分子质量约为75 ku,其表达量占总菌体蛋白的39.8%。Western blot检测结果表明,VP60融合蛋白可以和RHDV抗血清发生特异反应。本研究结果显示,兔出血症病毒在干旱半干旱条件下的遗传变异和免疫学特征无较大变化。     

苹果PGIP基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达

【目的】从富士苹果幼果果实中克隆多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白(PGIP)基因,并进行原核表达,为进一步研究PGIP的生物学功能奠定基础。【方法】根据Genbank中已经发表的苹果PGIP基因序列设计引物,采用RT-PCR从苹果果实中扩增PGIP基因cDNA,回收目的基因片段并连接到pMD18-T载体,鉴定后进行测序。然后将PGIP全长cDNA和去信号肽的cDNA导入到pET-32a(+)表达载体中,分别获得融合表达质粒pET-PGIP和pET-PGIP-X,将其分别转化大肠杆菌BL21感受态细胞,用不同终浓度IPTG进行诱导表达,收集表达产物并进行SDS-PAGE电泳。对pET-PGIP-X基因工程菌表达产物的可溶性进行检测。【结果】苹果PGIP cDNA序列长为1 091 bp,编码区为993 bp,可编码330个氨基酸残基,将其命名为MdPGIP;重组表达质粒pET-PGIP和pET-PGIP-X在宿主大肠杆菌中分别表达出分子质量约49.6和46.1 ku的融合蛋白,pET-PGIP-X表达产物以包涵体的形式存在。【结论】成功克隆了苹果PGIP基因,并在大肠杆菌中获得高效表达。     

烟草蚀纹病毒外壳蛋白基因的克隆与原核表达

根据烟草蚀纹病毒(TEV)CP序列设计合成上下游引物,利用RT-PCR方法获得了TEV CP基因,大小为789 bp。将TEV CP基因克隆到pM D 18-T S im p le V ector,经E coRⅠ/S acⅠ双酶切得到目的片段,并将其定向插入到pET 30a载体中构建了原核表达载体pET 30-TEV CP,重组质粒经E coRⅠ和S acⅠ双酶切鉴定及基因测序验证正确后,转化大肠杆菌BL 21,用IPTG进行诱导表达。结果表明,TEV CP基因在大肠杆菌中获得了高效表达,分子量约为37 ku。以表达产物为抗原免疫家兔,制备了特异性抗血清,其效价为1/1 204。W estern b lot检测结果表明,制备的抗血清可用于检测田间的发病植株。     

克氏原螯虾泛素结合酶E2基因的克隆及其在卵巢中的表达分析

利用RACE技术获得了UB-E2基因c DNA全长,通过RT-PCR技术研究UB-E2基因在不同组织、发育时期的表达量和17α-羟孕酮激素刺激后UB-E2表达量及性腺发育情况。结果表明:该基因序列全长3 943bp,开放阅读框675 bp,编码224个氨基酸,相对分子量23. 93 ku,等电点8. 61,82～219位氨基酸序列为泛素结合酶家族特有的结构域。氨基酸序列比对发现,克氏原螯虾UB-E2基因与节肢动物UB-E2基因有较高的同源性;系统进化分析表明,UB-E2基因与凡纳滨对虾和斑节对虾聚为一支。荧光定量结果显示,UB-E2基因在克氏原螯虾卵巢组织中的表达量显著高于其他组织(P 0. 05);在卵巢发育初期表达量最低,随后逐渐升高,到产卵后期开始下降; 17α-羟孕酮刺激结果显示,试验组卵巢发育速度明显加快,同时UB-E2基因的表达量也显著上升,卵巢发育速度和UB-E2基因表现为受17α-羟孕酮刺激响应一致。推测UB-E2基因在克氏原螯虾的卵巢发育和配子发生中起着重要的作用,本研究为克氏原螯虾性腺发育分子调控机制提供一定的理论依据。     

中国荷斯坦牛SRY基因编码区的克隆与原核表达

利用PCR技术从雄性中国荷斯坦牛的基因组DNA中克隆了Y染色体性别决定基因(Sex-deter-m in ing R eg ion on the Y Chrom osom e,SRY)的编码区全长序列,构建了表达载体pET-28a/SRY,并将其在大肠杆菌(E.coli)中进行了诱导表达,对表达产物进行了检测。结果表明,SRY基因编码区长687 bp,编码229个氨基酸;表达载体pET-28a/SRY构建成功;表达产物中含有相对分子质量为33 ku的SRY蛋白。     

猪瘟病毒石门株NS3基因在大肠杆菌中的表达

采用PCR技术,扩增了猪瘟病毒石门株NS3基因的丝氨酸蛋白酶、NTPase、RNA解螺旋酶活性功能区长度为2 000 bp的片段,将其克隆到pET-32a中,构建了原核表达载体pET-NS3,并将其在大肠杆菌Rosetta(DE3)中进行了表达,同时对表达产物进行了SDS-PAGE和Western blotting检测。结果表明,IPTG诱导表达得到的pET-NS3融合蛋白的相对分子质量约为97 ku,与预期结果一致,且该重组蛋白能被CSFV阳性血清所识别。     

鸡柔嫩艾美耳球虫单卵囊分离技术的构建及致病性研究

构建了一种新的鸡柔嫩艾美耳球虫单卵囊分离技术 ,并对杨陵柔嫩艾美耳球虫地理株进行了分离 ,对继代增殖的纯种卵囊进行了致病性试验。结果表明 ,该单卵囊分离技术简单易行 ,单卵囊感染成功率可达4 0 % ;该虫株对雏鸡有很强的致病性 ,经口接种 1× 10 5个孢子化卵囊 ,致死率高达 80 %。