中国白梨S基因研究——I 7个品种S基因型的确定和2个新S基因的鉴定

梨S基因型的确定对授粉品种的选择具有指导作用．采用PCR—RFLP检测、DNA序列分析和田间杂交试验，鉴定了两个新S-RNase基因．分别为S17-RNase和S21-RNase．同时确定了7个白梨品种的S基因型．S17-RNase和S22—RNase基因的内含子大小分别为142bp和139bp．HV区长度分别为16个和15个氨基酸．信号肽-P2的推导氨基酸长度分别为99个和98个氨基酸．信号肽大小均为27个氨基酸．C1大小均为11个氨基酸，C2大小均为12个氨基酸．白梨品种海棠酥、六瓣、恩梨、鸭梨、大核白、香椿、青梨等品种的S基因型分别为S1S12S19、S17S19、S1S19、S1S21、S16S19、S3S19、S19S19．该研究可为梨遗传改良和丰产栽培提供重要的理论依据．     

中国梨品种自交不亲和新基因的分离鉴定

采用分子生物学技术、田间杂交试验和生物信息学方法研究了中国梨自交不亲和基因和品种的S基因型．从中国白梨和沙梨品种中分离鉴定了15个梨自交不亲和新基因；分析了新S基因的序列特征；确定了中国白梨中至少存在17个S等位基因，中国沙梨中至少存在10个S等位基因；鉴别了34个梨品种的S基因型．这些新S基因的发现和品种S基因型的确定为中国梨品种的优化配置、丰产栽培和遗传改良提供了科学依据。     

金珠果梨S基因型的确定

大多数梨属于配子体自交不亲和果树,自然授粉结实率低、品质差。通过确定梨品种S基因型可寻找简便快速克服自交不亲和性的方法。金珠果梨是从野生砂梨中选育出来的新种质。以金珠果梨幼叶为试验材料,对其基因组DNA进行S基因特异扩增、克隆、DNA序列测定及生物信息学分析等,结果表明：金珠果梨S基因型为S₃S₁₉。     

基于序列分析的13个中国梨品种S基因型鉴定(英文)

    为鉴定中国梨S-RNase基因及其S基因型,根据日本梨S-RNase基因保守区设计引物,对13个中国梨品种进行基因组PCR特异扩增,并对PCR产物克隆、测序、序列分析.结果鉴定出13个S等位基因,其中11个S基因与GenBank中已知的S1, S7, S12, S15, S16, S18, S19, S22, S27, S29, S34-RNases相同,另外2个则为新的S-RNase基因,命名为S37-RNase和S38-RNase,GenBank接受号分别为DQ839238、DQ839239.13个S等位基因中,在推导氨基酸水平上,S18与S27相似性最低,为58%,S7与S27,S12与S19,S15与S37及S15与S38间相似性最高,为94%.经分析,S19为中国梨中出现频率最高的等位基因,对其DNA序列进行限制性酶切位点分析,建立了一种快速、经济鉴定S19的方法,该方法无需测序而仅使用特异的限制性内切酶AflⅡ对PCR产物进行酶切消化.根据分子鉴定结果,13个中国梨品种S基因型被确定为:'冰糖'(S16S19), '六棱' (S16S19), '锦香'(S34S37), '鹅酥' (S15S38), '蜜梨'(S19S29), '甜橙子'(S7S12), '大青皮'(S19S34), '秋白' (S19S34), '紫酥' (S19S34), '花长把'(S19S22), '灌阳雪梨'(S18S27), '早蜜'(S19S29),'青面'(S1S18).     

中国砂梨7个自交不亲和新基因的分离与测序

S-RNase是配子体自交不亲和植物雌蕊的基因产物，它降解具有相同基因型的花粉mRNA或rRNA．导致植物的自交不亲和．借鉴日本梨S—RNase基因的分析方法．对中国砂梨5个品种的基因组DNA进行PCR—RFLP系统检测和DNA序列分析，从中发现了7个新的S—RNase等位基因，分别命名为S11-RNase、S12-RNase、S13-RNase、S14-RNase、S-15RNase、S16-RNase和S25-RNase基因，其部分序列已登录到GenBank．     

6个梨属砧木的S基因型鉴定

利用梨的自交不亲和基因(S - RNase)特异引物“FTQQYQ”和“anti - IIWPNV”,对6个梨砧木品种(山梨、S2、S5、S7、PDR54、极矮化种质)的基因组DNA进行S基因特异扩增,并对扩增片段进行回收、克隆、测序,使用生物信息学软件对各序列进行分析和同源性搜索比对,最终确定各品种的S基因型.鉴定结果:山梨为S12 Sx,S2为S1S17,S5为S17S31,S7为S1S17,PDR54为S4S8S17,极矮化种质为S1S17.     

5个中国砂梨品种S基因型的确定

果树雌蕊自交不亲和基因（S基因）产物能降解具有相同S基因型的花粉管核糖核酸，导致自然授粉结实率低，果实品质差。确定不同梨品种S基因型，为配置授粉树和杂交育种提供重要科学依据，并为遗传改良梨品种奠定基础。实验以5个砂梨Pyrus pyrifolia品种基因组脱氧核糖核酸为实验材料，根据S基因一级结构特征，设计合成特异引物，采用PCR-RFLP系统检测和TA克隆测序等方法，分离鉴定了这些品种扩增片段大小差异很小的2条5基因，确定了它们的S基因型，分别为晶玉Pyrus pyrifolia‘Jingyu’S4S24，金水2号P．pyrifolia‘Jinshui No．2’S3S21，新雅P．pyrifolia‘Xinya’S4S24，西子绿P．pyrifolia‘Xizilv’S4S13，青魁P．pyrifolia‘Qingkui’S1S13，并且对各品种测序结果进行了初步的生物信息学分析。图4表1参27     

新疆地方梨品种S基因型的鉴定

【目的】鉴定与研究9个新疆地方梨品种S基因型,为库尔勒香梨授粉品种的筛选及其遗传改良提供理论依据。【方法】设计特异性引物对9 个新疆地方梨品种的基因组DNA 进行PCR扩增,片段回收、克隆、测序,使用生物信息学软件对各序列进行分析。【结果】褐色句句梨、轮台句句梨、霍城冬黄梨、八月梨、库尔勒黄酸梨、句句梨、奎克阿木特1号等7个品种的S基因型分别是:S28S4、S28S4、S28S1、S28S4、S22S35、S28S4、S36S34S22;可特阿木特和棋盘梨各鉴定出一条基因,S基因型分别是 S8Sx和 S28Sx。【结论】确定了7个新疆地方梨品种S基因型,可特阿木特和棋盘梨中各有 1条 S 基因没有被鉴别出。丰富了我国梨资源的S基因型信息,为库尔勒香梨的丰产栽培和遗传改良提供了依据。     

11个中国杏品种S-RNase基因的检测与序列分析

以11个未知基因型的中国杏品种为试材,根据李属植物S-RNase基因保守区设计2对引物组合检测各品种S-RNase基因,共获得22条等位扩增片段,电泳检测表明所有品种的扩增条带集中在300~1100bp的范围内,且表现出一定的长度多态性。序列分析进一步确定22个S-RNase基因为10个不同的等位基因,其中6个为首次发现,根据Gen-Bank中已登陆的杏S-RNase基因的顺序,分别命名为S19、S20、S23、S24、S25、S26,序列登陆号为:EF185300、EF185301、EU037262、EU037263、EU037264、EU037265。推导氨基酸序列的同源分析表明,杏的S-RNase与李属植物的S-RNase表现较高的同源性,为59.3%~100%;与苹果和梨的S-RNase同源性较低,为19.6%~31.6%。试验确定11个中国杏品种资源的自交不亲和基因型分别为:‘大果杏’S19/S20,‘张公园’S24/S25,‘二红’S9/S11,‘黄口外’S11/S26,‘植丸子’S11/S17,‘宇宙红’、‘大丰’S17/S23,‘超仁’、‘虹桥’S8/S11,‘冀光’、‘中华大杏梅’S8/S9;部分品种的田间杂交授粉座果与花粉管荧光显微镜观察证实了所鉴定基因型的可靠性。     

雪花梨S16-RNase基因全长cDNA克隆及序列分析（英文）

    通过逆转录PCR(RT-PCR及快速扩增cDNA末端(RACE)技术从中国白梨品种'雪花'梨中克隆到S16-RNase基因的全长cDNA序列(GenBank接受号为DQ991388)该cDNA克隆总长1101 bp,包含1个完整的开放阅读框,编码228个氨基酸S16-RNase表现出梨S-RNase基因的基本结构特征,即其具有5个保守区(C1,C2,C3,RC4及C5)和1个高变区在推导氨基酸水平上,S16-RNase与梨其他S-RNase基因的相似性为63%至74%,但与苹果S9-RNase的相似性高达95%通过多序列比对构建进化树,分析梨S16-RNase与蔷薇科植物其他S-RNase基因的遗传进化关系结果表明,S16-RNase与苹果亚科S-RNase基因形成一个亚科特异而非种特异的S-RNase基因类群;且不同S-RNase基因间存在属内种间遗传距离远于属间种问遗传距离现象     

‘翠冠’梨2个后代品种S基因型鉴定及杂交亲和性强度观察

以‘西子绿’ב翠冠’梨组合的2个F1代品种‘初夏绿’与‘翠玉’为材料,利用S基因PCR-RFLP(聚合酶链反应-限制性片段长度多态性)检测技术与PCR产物转质粒测序技术鉴定其基因型,并综合应用花粉原位萌发动态的荧光显微观察与田间授粉试验研究其杂交亲和性强度。结果表明:‘初夏绿’与‘翠玉’的S基因型皆为S3S4;‘初夏绿’和‘翠玉’的自交不亲和强度中等,二者相互间授粉不完全亲和,而与‘翠冠’间的相互授粉均表现为完全亲和。     

新疆扁桃品种自交不亲和S-Rnases基因型的分析鉴定

[目的]利用特异性PCR扩增、DNA测序和生物信息学方法鉴定新疆扁桃品种的S-Rnases基因型,对新疆扁桃授粉品种配置、人工授粉、遗传改良以及栽培利用都具有重要的理论意义和实践价值.[方法]以新疆24个栽培扁桃品种的叶片为试材,选用目前蔷薇科通用的引物组合对扁桃叶片基因组DNA进行自交不亲和S-RNases基因特异性PCR扩增,克隆测序结果比对分析,综合进行S-Rnases基因型的鉴定.[结果]利用引物组合AmyC5R+AS1Ⅱ对24个新疆栽培扁桃品种的基因组DNA进行S-Rnases基因特异性PCR,共扩增出32条清晰可辨的片段,克隆测序后,通过DNAMAN多重序列比对,发现共包括11个核苷酸序列,大小分别为1 688 bp(Sn1)、1 404 bp(S19)、1 330 bp(S61)、1 222 bp(S24)、1 141 bp(S25)、1 087 bp(S17)、979 bp(S10)、785 bp(S63)、777 bp(S6)、690 bp(S50)、602 bp(S15).[结论]鉴定出了新疆扁桃品种的10个S-Rnases基因型,分别为阿买提(S15S17S63)、红宝石(S15S17)、莎舟(S15S17)、鹰嘴(S10 S24)、矮丰(Sn1S25)、扁石头(Sn1S25)、桃扁桃(S6Sn1)、开心果(S6S61)、双果(S63Sn1)、纸皮(S50S61).     

犬冠状病毒的分离鉴定及其S基因的克隆

从疑似犬冠状病毒(CCV)症状病犬粪便中分离出一株病毒,合成通用引物(2Bp,4Bm)和CCV特异性引物(CCVF2,CCVR2)进行RT-PCR反应及限制性内切酶BstXⅠ酶切鉴定,并将纯化的PCR产物成功地克隆到pGEM-T-easy载体中。RT-PCR反应结果,BstXⅠ酶切鉴定结果以及重组质粒PCR鉴定结果均得到预计扩增片段。重组质粒测序结果与GenBank的CCV序列进行比对,与之相符,表明本次实验分离到的病毒为CCV。     

9个欧洲李品种自交不亲和S-RNase 基因的克隆及序列分析

【目的】鉴定9个欧洲李品种自交不亲和S-RNase基因型,为提高生产效率和高效育种提供理论依据。【方法】利用2对蔷薇科通用引物对9个欧洲李品种的叶片基因组DNA进行特异性PCR扩增,片段回收,将克隆测序的结果在GenBank数据库中进行同源性比对并分析序列。【结果】9个欧洲李品种均扩增出2条带,鉴定出9个样品中的8个欧洲李品种的S基因型,其中理查德早生和斯泰勒的S基因型相同为S1S9,法兰西和Silvia的S基因型相同为S1S5,乌孜干1号、总统、Decbrowice和女神的S基因型分别为S1S11、S6SSJ、S1SSJ、SSAS11,塔城酸梅仅鉴定出具有一条S1-RNase等位基因,未能确定出其S基因型。基因频率分析发现S1-RNase基因出现频率最高,S6-RNase和SSA-RNase基因频率最低。欧洲李SSA、S6、S9、SSJ和S5亲缘关系较近,参试李亚科树种的S-RNase基因不能单独聚成一个亚类,而是彼此交错分布在李亚科各个分支中。【结论】欧洲李的S基因型是由2种不同的S等位基因组成,鉴定的9个样品中,有8个欧洲李品种得到完整的S基因型,其中S1-RNase基因出现频率...     

自交亲和与自交不亲和日本梨中S4基因的研究进展

综述了近20年日本梨中与自交亲和和自交不亲和有关的S4基因的研究进展。这些结果包括:“二十世纪”(基因型为S2S4)为自交不亲和品种,其突变品种“奥嗄二十世纪”(基因型为S2S4SM,SM=stylarpartmutant;花柱部分突变)为自交亲和型。“奥嗄二十世纪”自交亲和的原因有三点:(1)S4SM基因被删除或者是低水平表达。(2)S4SM基因仅在柱头表达。(3)S4SM基因表达较迟。这主要是由于“二十世纪”S基因座上的S4等位基因发生了高度突变成为S4SM基因或者S4等位基因被删除,导致其基因产物花柱中的S4-RNase受到高度抑制或缺乏的缘故。S4基因由997bp组成,其中85~768bp为684bp的阅读框,925~931bp和943~950bp为多聚腺苷酸信号。S4基因的表达产物为S4蛋白,S4蛋白由228个氨基酸残基组成,其中N端的27个氨基酸残基为信号肽,成熟的S4蛋白由201个氨基酸残基组成。S4蛋白的生理功能是抑制花粉的萌发和花粉管的伸长。     

樱桃自交不亲和S9-单元型特异的F-box基因克隆及其表达分析

【目的】克隆李属甜樱桃自交不亲和性花粉S-决定子基因，为今后果树配子体自交不亲和性机理研究奠定理论基础。【方法】根据GenBank登录的16个S-locus F-box同源基因保守区设计兼并引物，利用RT-PCR、RACE等手段，从甜樱桃品种红灯花粉cDNA中克隆到两个编码376-氨基酸多肽的全长基因。【结果】GenBank Blast分析显示,克隆的两个基因中一个基因编码的蛋白产物与数据库甜樱桃自交不亲和性S3-单元型特异的PaSFB3（AB096857）编码的氨基酸序列完全一致。另一个基因编码一新的PaSFB同源序列，其推测的氨基酸序列N-端同SFB3一样具有明显的F-box基序，与PaSFB1～6的一致性为76%～82%。研究显示该基因在花粉组织中特异性表达，并表现出S9-单元型特异的连锁信号。【结论】新基因为甜樱桃自交不亲和性花粉S-决定子候选基因PaSFB家族中一新成员，命名为PaSFB9 （GenBank登录号：DQ422809），红灯自交不亲和基因型确定为S3S9。     

猪源绿脓杆菌的分离鉴定及16S rRNA基因同源性分析

从解剖病变为心包炎、纤维素性肺炎、肺脓肿的病死仔猪体内分离到1株细菌,通过形态特征观察、生化试验,将分离菌株初步鉴定为绿脓杆菌。动物致病性试验结果显示,分离菌株对小鼠具有很强的致病性。药敏试验结果显示,分离菌株对氧氟沙星、恩诺沙星高度敏感,对头孢噻肟、庆大霉素中度敏感,对青霉素、氟苯尼考、氨苄西林、阿莫西林、强力霉素、卡那霉素等耐药。将分离菌株的16S rRNA基因序列与Gen Bank中发表的绿脓杆菌序列进行Blast比对,结果表明,分离菌株与绿脓杆菌不同菌株的同源性高达99%以上,进一步确定分离菌株为绿脓杆菌。基于16S rRNA基因序列,使用MEGA 5.05软件,构建系统进化树,结果表明,分离菌株与病人痰液和腹泻婴儿分离菌株的同源性最高,与未加工水果分离菌株同源性最低。     

马源蜡样芽孢杆菌的分离鉴定及毒力基因检测

为鉴定从内蒙古通辽市某马术俱乐部发病及死亡赛马体内分离出的一株病原菌,本研究对分离菌株进行革兰氏染色镜检、动物致病性试验、全自动微生物分析系统检测、16S rRNA基因扩增、系统进化树分析及部分毒力基因PCR检测。结果显示:分离株生化特性符合蜡样芽孢杆菌的特性;其对克林霉素、庆大霉素等药物敏感,对头孢西丁、环丙沙星等药物中度敏感,对氨曲南、头孢唑林等药物耐药;16S rRNA基因序列与GenBank中已登录的蜡样芽孢杆菌序列同源性为100%;系统进化树分析表明,分离株与蜡样芽孢杆菌等亲缘关系最近;毒力基因PCR检测结果显示,8种潜在的毒力基因entFM、cytK、hblA、hblC、hblD、nheA、nheB、nheC均呈阳性。试验结果表明,该分离菌株为具有严重致病性的蜡样芽孢杆菌。