葡萄炭疽病菌T-DNA插入突变体的表型及致病性变异分析

胶孢炭疽菌Colletotrichum gloeosporioides引起的葡萄炭疽病是葡萄生产中的一种重要病害。本研究对从2 100个T-DNA插入突变体库中挑选的PDA培养特征变异较大的11株突变体进行表型和致病性分析,旨在为葡萄炭疽病菌产孢与致病基因网络调控研究奠定基础。结果表明,突变体M112、M247、M1288、M1325、M1386和M1430不能产生分生孢子,其余的5株突变体产孢量降低;突变体M247、M1288和M1325丧失了致病性;突变体M112、C1094、M1386和M2013突变体致病力增强。此外,突变体C1094孢子萌发率明显降低,其余4株产孢突变体的孢子萌发率与野生型菌株WS15无明显差异。     

香蕉枯萎病菌Dicer-like基因的功能分析

香蕉枯萎病病原菌尖孢镰刀菌古巴专化型（Fusarium oxysporum f. sp. cubense）4号生理小种（Foc4）含有两个进化上高度保守的Dicer-like基因FocDCL1和FocDCL2。为了探究该基因的功能及其在RNAi中的作用机制，利用同源重组的方法获得ΔFocDCL1、ΔFocDCL2和ΔFocDCL1/2基因敲除突变体。表型分析显示，与Foc4野生型相比，突变体菌丝的营养生长无显著差异，但产孢量下降；ΔFocDCL2突变体在非生物胁迫刚果红处理后菌落明显变小且气生菌丝增多；ΔFocDCL2和ΔFocDCL1/2的致病力下降。miRNA深度测序数据显示，与Foc4野生型相比，ΔFocDCL1、ΔFocDCL2和ΔFocDCL1/2敲除突变体的miRNA长度分布和5′–端首位碱基出现频率都发生了改变，都能产生自身特异miRNA。DCL功能存在交叉和冗余，miRNA可以通过依赖独立的、交叉的或者联合的DCL发生；此外，鉴定到不依赖DCL形成的miRNA。这些结果表明FocDCL在产孢量、非生物胁迫、致病力以及小RNA发生中发挥作用。     

香蕉枯萎病菌4号生理小种β2-微管蛋白基因敲除与表型分析

【目的】克隆并鉴定香蕉枯萎病菌(Foc4)β2-微管蛋白(β2-tub)基因,阐明β2-tub在多菌灵的抗药性及在病原菌致病过程中发挥的作用。【方法】采用PCR技术克隆了β2-tub的序列全长,并对其进行生物信息学分析。应用Splitmarker同源重组技术获得Foc4的β2-tub基因敲除突变体,并对其突变体的生物学表型、致病力及其对多菌灵的敏感性进行测定。【结果】生物信息学分析表明,Foc4β2-tub基因全长为1 694 bp,cDNA编码区全长1 347 bp,由4个内含子和5个外显子组成,编码蛋白含448个氨基酸。Foc4对多菌灵表现为敏感(EC50=0.51μg·mL~(-1)),与Foc4相比,β2-tub基因敲除突变体对多菌灵的敏感性(EC50=0.36μg·mL~(-1))表现显著增强,差异显著(p 0.05)。与Foc4相比,β2-tub基因敲除突变体的生物学表型没有变化,对巴西蕉苗的致病力明显减弱。【结论】β2-tub基因具有高度保守性,β2-tub基因敲除突变体对细胞壁选择性压力、氧化压力和渗透压力均没有影响,但致病力下降,同时β2-tub基因的变化会引起Foc4对多菌灵抗性的改变。     

番茄组蛋白变体H2A.Z基因双突变体的获得及其功能研究

以番茄自交系1479为材料,利用基因编辑技术创制番茄组蛋白变体H2A.Z基因双突变体hta11hta9。测序结果表明番茄H2A.Z基因被敲除。发芽试验结果表明组蛋白基因H2A.Z双突变体hta11hta9种子萌发受到严重影响。在相对低温（17 ℃）下,H2A.Z基因双突变体生长明显比野生型迟缓。     

苹果树腐烂病菌果胶裂解酶基因Vmpl4的致病功能研究

【目的】通过研究苹果树腐烂病菌果胶裂解酶(pectate lyase,PL)基因Vmpl4敲除突变体的致病力、对果胶的利用和基因敲除后家族内其他基因的表达水平变化,探明Vmpl4在致病过程中的作用。【方法】采用q RT-PCR技术检测Vmpl4在野生菌株03-8与寄主互作过程中的表达水平及Vmpl4敲除后PL家族内其他基因的表达水平,通过Doublejoint PCR构建基因敲除载体,并通过PEG介导原生质体遗传转化获取转化子、PCR及Southern blot验证基因敲除突变体。利用苹果叶片和枝条离体接种方法检测突变体致病力;接种至PDA及果胶培养基,观察突变体的营养生长和对果胶的利用情况。【结果】Vmpl4在病菌侵染过程中上调表达高达10.20倍;通过验证得到1个基因敲除突变体,其在叶片和枝条上的致病力均显著降低,在果胶培养基上生长速率也明显降低,Vmpl4敲除后家族内4个基因在病菌侵染过程中表达水平显著上调。【结论】果胶裂解酶基因Vmpl4通过降解果胶参与致病过程,PL家族内其他基因与Vmpl4在病菌致病性方面共同发挥作用。     

一个矮牵牛花器官发育突变体aps的表型鉴定及遗传分析

在利用矮牵牛W138株系构建突变体库的过程中,获得了一种花器官发育突变体,该突变体主要表现为花萼和花瓣发育异常,命名为aps(abnormal petals and sepals)。与正常W138植株相比,aps突变体最明显的表型是花冠开裂,通常为3裂,同时5个花萼中有2个出现部分瓣化。扫描电镜观察结果显示,突变体瓣化花萼的表皮细胞表现为正常花瓣的细胞形态。通过突变体自交、与正常姊妹株和矮牵牛W115株系杂交以及F1自交和回交等遗传分析发现,aps突变性状为单基因控制的隐性性状。q PCR分析结果表明,在突变体花萼中,3个B类基因(FBP1、PMADS1和PMADS2)和部分E类基因(FBP2、FBP4和FBP5)出现异位表达或表达量显著升高,而所有A类基因(FBP26、FBP29、PFG、AP2A、AP2B和AP2C)的表达量均明显下降,E类基因FBP9和FBP23的表达量也下调;突变体花瓣中,A类基因除FBP29不表达外,其他所有基因的表达量均显著增加,B类基因FBP1和PMADS2,E类基因FBP2、FBP5、FBP23和PMADS12的表达量上调;C类和D类基因的表达在突变体花萼和花瓣中没有明显变化,但在雄蕊和花柱中C类基因表达量明显下降,D类基因FBP7在子房中显著下调。aps突变体为研究矮牵牛花器官发育的调控机制及相关基因之间的调控关系提供了良好的材料。     

基于RNAi和蛋白质组学研究胶孢炭疽菌CgCDC2基因的功能

【目的】CDC2是调控细胞周期的主要因子之一,对植物病原菌的生长发育有着重要作用,但目前还未有胶孢炭疽菌CDC2蛋白生物学功能方面的研究。本试验的目的是获得胶孢炭疽菌(Colletotrichum gloeosporioides)CgCDC2的RNAi突变体菌株,并分析CgCDC2基因的功能。【方法】利用RNAi技术和PEG介导法获得CgCDC2的RNAi突变体菌株,通过表型分析、TMT蛋白质组学分析和酶活性测定来确定该基因的生物学功能。【结果】通过PCR扩增获得CgCDC2基因,编码一个326个氨基酸的蛋白,其RNAi突变体菌株与野生型相比,生长速率减缓、分生孢子产量显著下降、对H_2O_2敏感性增强,PG、PL蛋白质含量、基因相对表达量和酶活性均显著降低,致病力减弱。【结论】CgCDC2参与调控胶孢炭疽菌的生长,分生孢子产量,氧化应激反应以及PG、PL的酶活性,从而降低病原菌的致病力。     

杧果炭疽病菌谷氨酸转运蛋白基因Cgglt1功能分析

【目的】探明谷氨酸转运蛋白基因Cgglt1与杧果炭疽病菌(Colletotrichum gloeosporioides)致病力的关系,以便为该病害发生机制的研究提供理论依据。【方法】利用In-Fusion~?HD Cloning Kit技术构建Cgglt1敲除载体,转化杧果炭疽病菌原生质体,对获得的敲除突变体进行表型分析。【结果】获得敲除载体p Cgglt1GH1和敲除突变体△Cgglt1,表型测定显示,与野生型相比,突变体△Cgglt1菌落颜色变浅、生长速率略下降、产孢量显著下降、孢子萌发加快但不能形成附着胞,对pH的适应性有所改变,对杧果叶片的致病力显著下降。【结论】Cgglt1基因调控C.gloeosporioide菌落生长、产孢量、孢子萌发率、附着胞的形成、对pH的敏感性及对杧果叶片的致病力。     

茄子叶色黄化突变体的特征及遗传分析

以茄子叶色黄化突变体‘chl861-2’及其叶色正常近等基因系‘0643-1’为试材，研究其生长变化趋势、主要农艺性状、叶绿素含量变化和光合特性。该突变体具有叶绿素缺失突变特征，从子叶期开始表现出叶色黄化现象，子叶浅黄色，整个生育期真叶黄色。突变体植株生长缓慢，矮小，生育期延长，生长势和果实显著小于野生型，单果质量只有野生型的71.58%；在苗期、门茄开花期、四门斗开花结果期总叶绿素、叶绿素a、叶绿素b的含量比野生型亲本显著降低；在苗期、门茄开花期净光合速率（Pn）显著低于野生型，气孔导度（Gs）和蒸腾速率（Tr）低于野生型，胞间CO2浓度（Ci）高于野生型。以突变体与3个正常叶色自交系为亲本构建6世代群体，对突变体叶色黄化性状遗传规律进行分析，结果表明叶色黄化性状为隐性核单基因控制，将该基因命名为Smchl-1。     

大白菜叶色突变体的HRM鉴定及其叶绿素荧光参数分析

将大白菜经甲基磺酸乙酯（EMS）诱变种子获得的42株叶色突变体按照生殖时期叶片颜色和叶绿素含量分为9种类型：深绿色、灰绿色、绿色、浅绿色、白绿色、白浅绿色、黄绿色、黄浅绿色、黄色;利用高分辨率熔解曲线（high resolution melting,HRM）技术对叶绿素荧光基因HCF164突变进行了筛选并结合叶绿素荧光参数测定,获得了1株黄绿色高光合效率突变体A29,1株黄绿色光合结构损伤突变体A35和1株浅绿色光合电子传递受阻突变体A21;对另外7个叶色相关基因的突变进行了HRM鉴定,表明叶绿素相关基因ATRCCR、CLH2、PORA突变可能是造成18个突变体叶色变化的主要原因,黄叶特异基因家族YLS突变与叶色变化也有关系。     

羽衣甘蓝中一个突变型肉桂酸- 4 - 羟化酶基因的克隆及分析

 以羽衣甘蓝为材料, 克隆了全长2 431 bp的肉桂酸- 4 - 羟化酶基因BoC4H。它有两个内含子, mRNA为1 715 bp, 编码一个481个氨基酸的推导蛋白, 与其它植物C4H有广泛同源性。它含有细胞色素P450保守域和特征基序, 如血红素结合域、E - R - R三联体、含T的结合槽基序、酶正确定向必需的铰链基序。BoC4H具有C4H /CYP73A5的大部分特征性底物结合位点基序( SRSs) 和酶活性位点残基,但与拟南芥等植物C4H相比其编码区3′发生了C₂₂₄₂单碱基缺失和相应移码, 导致其蛋白C - 末端缺失/变异了36个残基, SRS6基序和其上的活性位点残基也相应缺失, 因此BoC4H可能无功能或活性低。BoC4H为膜蛋白, 可能定位于内质网, 其二级结构主要为α - 螺旋和随机卷曲。Swiss-Model不能预测出其三级结构。甘蓝中存在一个至少由5个成员构成的C4H基因家族。     

大白菜耐热性QTL定位与分析

 应用352个标记位点的大白菜AFLP和RAPD图谱，采用复合区间作图的方法对控制大白菜耐热性的数量性状基因位点(QTL)进行定位和遗传效应研究。用苗期热害指数进行耐热性表型鉴定，共检测到5个耐热性Q几位点，分布于3个连锁群上。ht-1、ht-3和ht-5表现为增效加性效应，ht-2和舡4表现为减效加性效应。ht一2对大白菜耐热性的遗传贡献率最大，其次是ht-5。发现了与5个 I8紧密连锁的侧连分子标记，它们与Q几间的距离为0．1 2．4 cM。这为大白菜耐热性分子标记辅助选择提供了理论基础。关键词：中图分类号：     

牡丹ACC氧化酶基因cDNA克隆及全序列分析

 以牡丹品种‘洛阳红’（Paeonia suffruticosa 'Luoyang Hong'）花瓣为材料,用CTAB法提取总RNA,根据已报道的ACC氧化酶（1-aminocyclopropane-1-carboxylic acid oxidase,ACO）保守氨基酸序列设计简并引物,通过RT-PCR扩增得到1条821 bp的牡丹ACO基因同源片段。利用该已知中间序列,通过快速扩增cDNA末端技术(Race)及序列拼接,最终得到该基因cDNA全长序列,命名为Ps-ACO1,GenBank登录号为DQ337251。分析结果表明,Ps-ACO1 cDNA全长1 221 bp,包含一个939 bp的开放读码框,5'非翻译区长65 bp,3'非翻译区长117 bp,编码产物为含有312个氨基酸残基的蛋白质。氨基酸序列与烟草、苹果、桃等植物的ACO同源性都达80%以上。     

银耳芽孢内源gpd启动子的克隆与功能鉴定

利用反向长距离PCR技术从银耳(Tremellafuciformis)芽孢gpd基因出发克隆上游gpd启动子序列,将预测的gpd启动子片段与多功能纤维素基因(mfc)连接构建表达载体,与潮霉素抗性质粒pBgGl-hph共转化银耳芽孢,对拟共转化子进行酶活发酵试验。结果表明:4轮反向长距离PCR克隆得到了1761bp的上游序列,经预测启动子落在上游1000bp左右区域内,包含两个高分值的起始转录位点,将gpd启动子分成gpd-Tre1(885bp)、gpd-Tre2(708bp)、gpd-Tre3(466bp)3段区域,分别与多功能纤维素基因(mfc)构建表达载体pgTre1-mfc、pgTre2-mfc和pgTre3-mfc。拟共转化子酶活发酵试验结果发现3个表达载体的转化子均能检测到多功能纤维素酶活,转化子T1-2包含gpd-Tre1启动子大片段,整体酶活最高,CMC酶活为14.12U/mL,比出发菌株Tr01提高34.3%,比工程菌株yLes3提高25.7%,木聚糖酶活为34.8U/mL,比Tr01酶活提高26.3%,略低于yLes3。3个启动子片段均具有表达活性,相比之下885bp的大片段gpd启动子表达活性更高。     

菜薹花芽分化及BrcuFLC基因的克隆与表达

通过制作石蜡切片研究了菜薹(Brassica campestris L. ssp. chinensis (L.) Makino var. utilis Tsen et Lee)早熟品种‘油青49’和晚熟品种‘油青甜菜心80天’的花芽分化过程,结果表明,当展开2~3片真叶时花芽分化开始启动。用已报道的拟南芥Flowering locus C (FLC) 基因和FRIGIDA (FRI) 基因的保守区域设计引物,通过RT-PCR的方法从两个菜薹品种中均克隆得到了两个决定开花的关键基因,并命名为BrcuFLC (GenBank登录号为EF138603)和BrcuFRI (GenBank登录号为EU700362)。半定量式RT-PCR表达分析表明, BrcuFLC基因在早、晚熟菜薹品种的不同发育时期表达存在差异,表达量随真叶数增加而逐步减少,但在晚熟品种中BrcuFLC表达量降低幅度小;BrcuFRI则在早、晚熟品种的所有阶段表达都较低。BrcuFLC在菜薹不同部位表达的情况不同,在茎、叶中的表达强,花次之,根中表达较弱;而BrcuFRI在早、晚熟品种根中的表达量明显高于其它3个部位。     

大白菜紫心性状遗传规律分析及其基因初步定位

以大白菜[Brassica rapa(Lour.)ssp.pekinensis]紫心纯系‘14S839’和橙色纯系‘14S162’为亲本,构建F_2群体,对大白菜紫色基因(BrPur)进行遗传连锁分析。性状分离调查结果显示,在F_2群体中紫心与非紫心单株符合3︰1分离比例,说明大白菜紫心性状的有、无符合单基因显性遗传模式,紫心性状是一种显性性状。采用改良的BSA方法对紫色基因BrPur进行定位,经过对白菜全基因组297个SSR标记的筛选,得到了BrPur的两个侧翼标记A710和A714,同时结合白菜基因组信息,将BrPur定位于大白菜A07连锁群上。结合前人关于花青素代谢相关基因的研究报道,通过分析Br4CL3和Bra004214的序列、开发新的标记,得到了两个特异共显性标记CL-12和B214-87。利用F_2群体扩增验证筛选到的所有标记,结果表明,经Join Map 4.0作图得到的遗传连锁图与非紫色交换单株"基因型矩阵"显示的结果完全一致,标记CL-12和B214-87位于BrPur两侧,遗传距离分别是3.1 cM和3.5 cM。     

甜瓜重组自交系群体SSR遗传图谱构建及纯雌性基因定位

 以甜瓜（Cucumis melo L.）纯雌株厚皮甜瓜品系WI998为母本,雌雄异花同株薄皮甜瓜品系3-2-2为父本杂交,通过单粒传得到了含有185个F6︰7家系的重组自交系分离群体,构建SSR分子遗传图谱。1 219对SSR引物在亲本间有多态性的为215对,多态率17.6%,构建的图谱共包含210个SSR标记,分属18个连锁群,覆盖基因组长度为937.1 cM,标记间平均距离为4.4 cM。将与性别表达密切相关的纯雌性基因（g）定位到了第1连锁群上,其两侧标记为NR3和MU8294_1,与g基因的遗传间距分别为1.2 cM和2.6 cM。     

甘蓝LFY基因的克隆及序列分析

以甘蓝ZQ启动抽薹的茎尖为材料,分别提取DNA和RNA,以两对引物扩增并序列拼接得到甘蓝LFYZQ基因DNA序列和cDNA完整编码区,长度分别为2 560、1 239 bp,与花椰菜、拟南芥、芥菜和萝卜同源性分别达到91 %、87 %、86 %、87 %。该基因含有3个外显子（452、394、393 bp）和2个内含子（514、807 bp）,共编码412个氨基酸,内含子剪接位点均符合经典GT-AG法则。将LFYZQ与网上公布的12种十字花科植物LFY氨基酸序列按分子进化分成两类：甘蓝LFYZQ与花椰菜以及Jonopsidium属植物Jonopsidium acaule这3个分为一类;其余10种植物分为第二大类。LFYZQ蛋白分子量为46 kD,是一个不稳定的疏水蛋白,存在N-十四（烷）酰化位点、蛋白激酶C磷酸化位点、酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点、酰胺化位点共4种活性位点。     

黄瓜营养体苦味基因Bi的定位

以黄瓜（Cucumis sativus L.）营养体无苦味的材料9110Gt（bibi）与有苦味的材料9930（BiBi）为亲本,对以两亲本构建的148个株系的RILs群体进行SSR标记的遗传连锁分析,对Bi基因进行初步定位,两侧翼标记SSR19672和SSR00004与Bi基因的连锁距离分别为4.4和3.4 cM。利用两侧翼标记筛选以相同亲本构建的1 815株的F2群体中的重组单株,结合黄瓜基因组测序的结果及生物信息学的知识,在标记区域内开发了31对SSR标记,最终将Bi基因定位在黄瓜的第6染色体上,最近的两侧翼标记SSR02309和SSR00004与苦味基因分别相距1.7和2.2 cM。     

反向PCR分离侧翼序列技术研究进展

反向PCR(inverse PCR,IPCR)是第一个依赖于PCR反应扩增旁侧序列的实验技术。IPCR可以在一个反应过程中,同时扩增已知序列两端的旁侧序列,省时简便,结合LR-PCR,RACE,SMART等技术,应用范围日益广泛;但IPCR也存在一些缺点,酶切、自连过程受到很多不确定因素的影响。现总结20 a来利用该技术克隆旁侧序列的研究成果,并提出优化的反应体系,以期对此项技术有更加系统的认识。