牦牛心脏脂肪酸结合蛋白(H-FABP)基因的克隆及序列分析

【目的】对牦牛H-FABP基因进行克隆和序列分析，以期为进一步开展牦牛该基因与其肉质性状的相关分析，进行分子标记辅助选择以及基因定位、表达等研究提供理论基础。【方法】用特定引物对牦牛H-FABP基因进行PCR扩增并进行T-A克隆和测序，在此基础上使用RepeatMasker、DNAMAN4.0、BioEdit4.8.10、Clustal W1.81等生物信息学软件进行序列分析。【结果】牦牛H-FABP基因(已在NCBI上登录，登录号为DQ026674)由4个外显子和3个内含子组成，CDS序列全长为402 bp，前体氨基酸数为133个。4个外显子大小分别为73 bp、173 bp、102 bp和54 bp；3个内含子大小分别为3 460 bp、1 892 bp和1 495 bp；外显子与内含子的连接区序列遵循通常的基因组成规律。外显子和内含子个数与普通牛、绵羊、山羊、猪、人、大鼠、小鼠、鸡、斑马鱼各物种相同。牦牛H-FABP基因序列中，重复序列所占比率为13.07%。内含子Ⅰ含有5个重复元件，包括1个SINE/Artiodactyls元件、1个SINE/MIR3元件、1个SINE/Bov-tA1元件和2个SINE/MIR元件；内含子Ⅱ无重复元件；内含子Ⅲ有3个重复元件，其中SINE/MIR元件、LINE/L2元件、SINE/Artiodactyls元件各1个。SINEs短重复序列所占比率为11.85%，哺乳动物分散性重复序列MIRs比率为6.44%。LINEs所占比率为1.22%，小于SINEs元件。其中，LINE1、BovB/Art2、L3/CR1重复元件以及LTR类反转录元件和DNA转座子元件在牦牛该基因区域中不存在。不同物种间在该基因编码区核苷酸序列和氨基酸序列上有较高的保守性。牦牛与普通牛、绵羊、山羊、猪、人、大鼠、小鼠、鸡、斑马鱼各物种在H-FABP基因编码区核苷酸序列上同源性大小分别为99.8%、97.8%、97.0%、92.8%、88.8%、83.3%、83.1%、76.4%、68.7%；相应的氨基酸序列间同源性大小为100%、96.9%、96.9%、92.4%、88.7%、85.7%、85.7%、77.4%、69.9%。【结论】牦牛H-FABP基因由4个外显子和3个内含子组成，其中外显子I、外显子Ⅱ、 外显子Ⅲ 和外显子Ⅳ大小分别为73 bp、173 bp、102 bp和54 bp，内含子I、内含子Ⅱ和内含子Ⅲ大小分别为3 460 bp、1 892 bp和1 495 bp。牦牛该基因区域含有较为丰富的重复序列元件且外显子与内含子的连接区序列遵循通常的基因组成规律。牦牛与普通牛、绵羊、山羊、猪、人、大鼠、小鼠、鸡、斑马鱼9个物种在H-FABP基因编码区核苷酸及氨基酸序列上具有较高的保守性。     

甘南牦牛H-FABP基因CDS区多态性及生物信息学分析

应用PCR产物混合样本DNA池法检测甘南牦牛心脏型脂肪酸结合蛋白(H-FABP)基因CDS区多态性,并应用生物信息学方法分析甘南牦牛H-FABP蛋白质特性.结果表明:甘南牦牛H-FABP基因CDS区序列与九龙牦牛相同,而与普通牛对比在第3外显子存在*76G>A的同义突变;甘南牦牛H-FABP氨基酸序列没有明显的疏水性区域,也未形成跨膜螺旋区及信号肽,推测其主要在细胞质中发挥生物学作用;甘南牦牛H-FABP基因编码产物二级结构是以α-螺旋和β-折叠为主的mixed型;氨基酸序列与普通牛、山羊、马、人、小鼠、大鼠、鸡、草雀及绿鸭9个物种间同源性较高,与其实际亲缘关系远近一致.     

绵羊Leptin基因的进化分析

[目的]为绵羊与其他动物的分子系统进化分析奠定基础。[方法]对绵羊Leptin基因的第23、外显子进行PCR扩增和测序,将测序结果与GenBank中绵羊和7个其他物种中相应序列进行比对,并构建绵羊与其他物种的分子系统进化树。[结果]不同物种的Leptin基因的核苷酸序列有较高的保守性。绵羊与山羊、水牛、奶牛、猪、人、家鼠、鸡的同源性分别为99.5%、98.0%、97.3%、93.4%、88.4%、83.9%、82.4%。系统发生树将这些物种总体上分成2支,家鼠与鸡聚为一支;而绵羊与山羊、水牛、猪和人为另一支。绵羊与山羊亲缘关系最近,而与水牛、奶牛、猪、人、家鼠、鸡亲缘关系渐远。[结论]Leptin基因适于进行物种起源、演化、分类以及系统发生关系的研究。     

麦洼牦牛H-FABP和MC4R基因的克隆及生物信息学分析

为探究H-FABP、MC4R基因在麦洼牦牛中的结构和功能,克隆测序麦洼牦牛H-FABP、MC4R基因的编码区全序列,并利用生物信息学软件分析其编码区序列、蛋白质结构、功能及进化关系。结果表明,麦洼牦牛的H-FABP基因全长440bp,其中编码区为401bp,编码133个氨基酸;MC4R基因全长1 434bp,其中编码区999bp,编码332个氨基酸。麦洼牦牛H-FABP和MC4R基因核苷酸序列与普通牛、绵羊、猪、人和小鼠的核苷酸比较,其一致性分别为83%~99%、85%~99%,其中与普通牛的最高(99%、99%),其次是绵羊(96%、95%),与小鼠的最低;说明在不同物种中,这2个基因属于直系同源的基因。H-FABP和MC4R蛋白均为疏水性结构蛋白。     

山羊神经肽Y基因外显子克隆及序列分析

采用PCR-SSCP 技术检测神经肽Y(neuropeptide Y,NPY)基因全部3个外显子在高繁殖力山羊品种(济宁青山羊)、中等繁殖力山羊品种(波尔山羊)和低繁殖力山羊品种(内蒙古绒山羊和安哥拉山羊)中的单核苷酸多态性,分析该基因对济宁青山羊高繁殖力的影响;并对济宁青山羊NPY基因3个外显子进行克隆测序,推导出编码的氨基酸序列,同时将济宁青山羊核苷酸和氨基酸序列与绵羊、牛、人、大鼠、小鼠和鸡6个物种的序列进行比较.结果表明,在4个山羊品种中未检测到NPY基因3个外显子的多态性;这7个物种的核苷酸和氨基酸序列的同源性分别为71.6%～99.7%和81.4%～100%;与牛、人等6物种相比,济宁青山羊NPY基因氨基酸序列38位存在特有突变(E38D).可见,物种间NPY基因保守性强,NPY基因可能不是影响山羊高繁殖力的主效基因.     

山羊抑制素α前体基因5'侧翼区及外显子的克隆与序列分析

[目的]弄清INHα前体基因与山羊繁殖季节性的关系,并研究INHα前体基因进化的保守性。[方法]对常年发情的山羊品种海门山羊和季节性发情的山羊品种安徽白山羊共20只母羊的抑制素0【前体基因（INHα）5’侧翼区和外显子进行了克隆和序列比较分析。[结果]与安徽白山羊相比,海门山羊INHα前体基因存在3个SNP,不存在氨基酸改变,核苷酸同源性为99．7％,氨基酸同源性为100％。在山羊、牛、猪、人、鸡、马、大鼠、狗之间INHα前体基因的核苷酸序列同源性为12．7％-96．5％。[结论]INHα前体基因在物种内趋于高度保守,任何核苷酸和氨基酸的改变都可能直接影响整个基因编码和基因调控能力的改变。     

山羊胰岛素样生长因子Ⅰ基因多态性及序列分析

采用PCR-SSCP技术检测胰岛素样生长因子Ⅰ(insulin like growth factorⅠ,IGF-Ⅰ)基因外显子在性早熟、高繁殖力品种(济宁青山羊)和性晚熟、中等繁殖力(波尔山羊)以及性晚熟、低繁殖力品种(安哥拉山羊和内蒙古绒山羊)中的单核苷酸多态性,分析该基因对济宁青山羊性早熟和高繁殖力的影响;并对济宁青山羊IGF-Ⅰ基因扩增片段进行克隆测序,拼接出山羊IGF-Ⅰ基因4个外显子序列,将济宁青山羊IGF-Ⅰ基因外显子核苷酸序列和推导的氨基酸序列与绵羊、牛、人、大鼠、小鼠和鸡6个物种的序列进行比较。结果表明,IGF-Ⅰ基因4个外显子在所检测的4个山羊品种中均不存在多态性;这7个物种的核苷酸和氨基酸序列同源性分别为79.6%~99.3%和77.8%~99.4%;与牛、人等6物种相比,济宁青山羊IGF-Ⅰ基因氨基酸序列不存在特有变化。可见,物种间IGF-Ⅰ基因保守性强,IGF-Ⅰ基因可能不是影响济宁青山羊性早熟和高繁殖力的主效基因。     

中国4个牛种MSTN基因外显子2多态性分析与其系统发生关系研究

[目的]解决牛亚科动物近缘物种的分类归属问题,了解牛亚科各种群遗传多样性。[方法]采用酚-氯仿抽提法从4个中国牛种中提取基因组DNA,对MSTN基因进行PCR扩增和测序,构建系统发育树,探讨4个牛种间MSTN基因外显子2的系统发生关系。[结果]MSTN基因外显子2编码区为372 bp。蒙古牛、牦牛和独龙牛的MSTN基因外显子2具有丰富的多态性。在所测66个样本中存在3个核苷酸多态位点,定义了6种单倍型。雷琼牛、蒙古牛、独龙牛与巴州牦牛享有共同的单倍型。巴州牦牛独自聚成一支,而雷琼牛与一部分独龙牛、大部分蒙古牛和引用瘤牛聚成一支。[结论]蒙古牛、雷琼牛、独龙牛种间存在着基因交流。牦牛与普通牛、瘤牛的分化较明显,比瘤牛与普通牛的亲缘关系要远。     

雷州黑鸭PID1基因部分序列的克隆与蛋白功能分析

[目的]了解雷州黑鸭磷酸酪氨酸互作结构域1(phosphotyrosine interaction domain containing 1,PID l)基因的序列结构特征及其蛋白的功能,为利用其改善雷州黑鸭肉品质与提高肉风味提供分子理论依据.[方法]采用RT-PCR方法克隆雷州黑鸭PID1基因部分序列,测序后比对其同源性,构建系统发育树,并预测其蛋白结构与功能.[结果]该核苷酸序列长度为369 bp,编码80个氨基酸,且大多为疏水性氨基酸.与人、牛、鸡等物种进行同源性比对,发现雷州黑鸭PID1基因序列与鸡具有高度同源性,同源性高达94％,且雷州黑鸭与鸡聚于同一系统发育支.蛋白质结构预测表明,该蛋白无跨膜结构与信号肽,氨基酸序列呈疏水性,位于细胞质中.[结论]雷州黑鸭的PID1基因与鸡的亲缘关系最近,其蛋白主要功能是在细胞质中参与肌内脂肪沉积的调控.     

藏绵羊生长激素(GH)基因的克隆及序列分析

【目的】对藏绵羊生长激素(GH)基因进行了克隆和序列分析,以期为进一步开展藏绵羊GH基因与其生长发育性状的相关分析以及基因定位、表达调控等研究提供理论基础。【方法】用特定引物对藏绵羊GH基因进行PCR扩增、克隆和测序,使用DNAMAN4.0、BioEdit 7.0.0、DnaSP 4.10.1等生物信息学软件进行序列分析和比较基因组学研究。【结果】藏绵羊GH基因(GenBank登录号EF077162)由5个外显子和4个内含子组成,完整编码序列(Complete coding sequence,CDS)全长为654 bp。5个外显子大小分别为13,161,117,162和201 bp;4个内含子大小分别为246,227,229和275 bp;内含子与外显子的连接区序列遵循基因组成规则。信号肽由26个氨基酸组成,成熟肽由191个氨基酸组成。藏绵羊与已报道的其他绵羊GH基因编码区核苷酸序列及推导的氨基酸序列同源性均为99.0%~100%;而与山羊、普通牛、瘤牛、大额牛、牦牛、水牛各物种在GH基因编码区核苷酸序列上同源性分别为98.4%,98.0%,97.7%,97.5%,97.5%,98.1%;相应的氨基酸序列间同源性分别为100%,99.0%,99.0%,98.1%,98.6%,98.1%。【结论】成功地克隆了藏绵羊GH基因;牛科物种内,藏绵羊与已报道的其他绵羊以及与山羊、普通牛、瘤牛、大额牛、牦牛、水牛等物种在GH基因编码区核苷酸序列和推导的氨基酸序列上均具有较高的保守性。     

渤海黑牛BOLA-DQA2基因SNPs多态性与生长性状的关联性分析

本试验采用PCR-SSCP方法对渤海黑牛BOLA-DQA2基因的编码区进行分析,研究渤海黑牛BOLA-DQA2基因多态性与生产性状的关系。研究表明,外显子1和外显子5处没有发现多态性位点,外显子2处发现两个多态位点产生4种基因型,外显子3处发现1个多态位点产生3种基因型,外显子4处发现1个多态位点产生3种基因型。外显子2中基因型AA所对应的个体头长、额宽、体高、十字部高显著高于基因型BB、AB、BC(P<0.05),其它生长性状均无显著差异。外显子3、外显子4中生产性状在AA、BB、AB这3种基因型上均无显著差异。DQA2外显子2中等位基因A对渤海黑牛的生产性状起关键作用,可以为渤海黑牛品种选育提供一定的参考。     

猪H-FABP基因intron3全序列测定

[目的]为将H-FABP基因应用于猪育种过程中的标记辅助选择提供基础资料。[方法]根据GenBank数据库上公开发表的相关的猪H-FABP基因序列设计特异性扩增引物,对H-FABP基因内含子3的PCR产物纯化后直接进行测序。[结果]成功扩增出猪H-FABP基因intron 3的全序列,全长为1 350 bp,已向GenBank数据库提交,检索号为DQ 002993。[结论]该研究为确定影响肌内脂肪沉积的主效基因奠定了理论基础。     

皖南黑猪H-FABP基因5'-上游区和第二内含子的多态性分析及克隆测序

对皖南黑猪心脏脂肪酸结合蛋白(H-FABP)基因5’-上游区和第二内含子的多态性进行分析及克隆测序,为开展皖南黑猪肉质性状分子育种奠定理论基础。采用PCR-RFLP(HinfⅠ、HaeⅢ、MspⅠ3种限制性内切酶)分子标记技术,分析了184头皖南黑猪H-FABP基因5’-上游区和第二内含子区的遗传变异情况,并对该基因的多态片段进行克隆和测序分析。结果显示:(1)在5’-上游区,HinfⅠ位点上存在多态性,等位基因H的基因频率为0.62,表现为中度多态(PIC=0.359 6);在第二内含子区,HaeⅢ位点上存在多态性,等位基因D的基因频率为0.92,表现为低度多态(PIC=0.130 7);而MspⅠ位点上尚未检测到多态,基因型均为AA型;HinfⅠ*位点上也存在多态性,等位基因B的基因频率为0.78,表现为中度多态(PIC=0.282 4);(2)χ2检验表明,除5’-上游区HinfⅠ多态位点外,其他3个位点均达到Hardy-Weinberg平衡状态(P0.05);(3)对H-FABP基因3个多态片段进行克隆测序分析发现,HinfⅠ-RFLP是由于1 324 bp处存在T→C的突变引起,HaeⅢ-RFLP是由于1811bp处存在C→G的突变引起,HinfⅠ*-RFLP是由于1 970 bp处存在C→T的突变引起。本试验确证了皖南黑猪H-FABP基因5’-上游区的多态位点并在第二内含子区检测到了HaeⅢ和Hinf*Ⅰ多态位点,这可为进一步分析H-FABP基因不同基因型与IMF含量的关系,以及确定影响IMF沉积的主效基因提供一定的数据基础。     

海南猪杂交效果及海南猪H-FABP基因和MyoG基因5′上游区域的遗传变异研究

测定了海南猪、海南猪母猪与杜洛克公猪杂交后代的胴体性状、肉质性状,并对脂肪酸结合蛋白(H-FABP)和肌细胞生成素(MyoG)基因的5′上游区域的遗传变异进行了分析。结果表明:杂交黑猪与其母本海南猪相比,活体重、胴体重、屠宰率、胴体长、瘦肉率均有提高,且差异显著(P0.05),表现出较好的杂种优势;骨率、皮率降低,脂肪沉积性能提高,而眼肌面积、皮厚变化不大。另外,海南猪与杂交黑猪肉质均符合优良肉质标准,杂交黑猪肉在滴水损失、大理石纹、水分、粗蛋白含量等方面优于海南猪,表现出较好的杂种优势。海南猪H-FABP基因5′上游区域和MyoG基因5′上游区域遗传变异的基因型和等位基因频率,为海南猪优良肉质性状的形成提供了遗传学依据。     

牛Trf 2基因的cDNA克隆和生物信息学分析

[目的]探讨牛Trf2基因的生物学功能,为进一步研究该基因对牛精液品质的影响奠定基础。[方法]以牛睾丸组织为材料,根据GenBank中发表的人Trf2基因序列,结合生物信息学技术,设计并合成3对引物,采用RT-PCR方法克隆牛Trf2cDNA,并运用DNA-MAN软件及在线工具对所得到的序列进行生物信息学分析。采用牛肾脏、肝脏、睾丸、肺、瘤胃、子宫、小肠、心脏、脾脏、卵巢和脂肪组织共11个组织,以牛β-actin基因为内参基因,对牛Trf2基因的组织表达谱进行分析。[结果]牛Trf2基因cDNA长度为1701bp（Gen-Bank登录号EU140625）。包含由561个碱基组成的开放读码框（ORF）,该ORF包含1个UGA终止密码子,编码186个氨基酸;在进化关系上,牛首先和人、大鼠、狗聚成一类,然后与袋鼠聚成第1群,再与小鼠聚成第2群。Trf2蛋白舍有2个结构域TLF和SPT15。牛Trf2基因在各个组织中都有表达,在睾丸组织中表达最高。[结论]获得了牛Trf2基因的cDNA序列（GenBank登录号EU140625）;牛Trf2蛋白可能对牛精液品质有影响。     

兰州大尾羊心脏型脂肪酸结合蛋白（H-FABP） 基因克隆及其同源性比较

【目的】克隆兰州大尾羊心脏型肪酸结合蛋白（H-FABP）基因全长cDNA序列,为研究绵羊H-FABP生物学作用和生产应用提供理论依据。【方法】根据已知哺乳动物H-FABP基因 cDNA 序列,设计5''和3''特异引物,运用cDNA 末端快速扩增（RACE）技术获得兰州大尾羊H-FABP基因全长 cDNA 序列。【结果】 扩增获得兰州大尾羊5''端425 bp、3''端231 bp片段和 177 bp中间片段,拼接获得748 bp兰州大尾羊H-FABP基因全长cDNA 序列（GenBank登录号：JQ780322）。 兰州大尾羊H-FABP基因ORF长 402 bp,编码 133 个氨基酸。核苷酸序列分析显示兰州大尾羊H-FABP基因序列与大多数哺乳动物相似,但其第66位发生的碱基转换（T←→G）引起所编码的第22位天门冬氨酸（N）不同于其它所有物种的赖氨酸（K）。构建的基因进化树分析结果显示兰州大尾羊与山羊亲缘关系最近。预测兰州大尾羊H-FABP蛋白质的空间结构与山羊和牛H-FABP类似,由2个α螺旋和10个反向平行的β折叠组成,10 个折叠片围成一个桶状结构,疏水性残基位于桶内,用于结合脂肪酸。【结论】克隆了兰州大尾羊H-FABP基因,为进一步研究该基因的功能奠定了基础。     

中国荷斯坦牛IRAK2基因遗传多样性与乳腺炎的相关性研究

 【目的】研究中国荷斯坦牛白细胞介素1受体相关激酶2(IRAK2)基因上5个SNP位点的多态性与奶牛体细胞评分（SCS）的相关性,为奶牛抗乳腺炎育种提供理论基础。【方法】采用PCR-RFLP技术、CRS-PCR技术和DNA测序,对1 292头中国荷斯坦牛、129头鲁西黄牛、32头渤海黑牛IRAK2基因g.28879、g.28916、g.29212、g.40035和g.40120共5个SNP位点进行研究,通过SAS软件进行相关性分析并采用SHEsis软件进行单倍型分析。【结果】共构建出30种单倍型,发现71种单倍型组合;对个体数量大于8头的单倍型组合与SCS进行关联分析表明,H21H23(TTAGGCTCCC)单倍型组合SCS最低。各个位点基因型与SCS关联分析表明,28 879突变位点的CC基因型个体SCS显著低于CT基因型个体(P＜0.05),28 916突变位点的GG基因型个体SCS显著低于AG基因型个体(P＜0.05),而其它3个位点不同基因型之间与SCS没有显著差异(P＞0.05)。【结论】H21H23单倍型组合在SCS方面为有利单倍型组合,可作为选择抗乳腺炎奶牛个体的分子遗传标记。     

牛Dmrt7基因的cDNA克隆及遗传变异

[目的]探讨牛Dmrt7基因的生物学功能及群体遗传变异情况,为进一步研究该基因对牛精液品质的影响奠定基础。[方法]以牛睾丸组织为材料,根据GenBank上发表的小鼠的Dmrt7基因序列设计并合成2对引物,通过RT—PCR分别进行了扩增并运用DNA-MAN软件及在线工具对所得到的序列进行了生物信息学分析;同时,以牛肾脏、肝脏、睾丸、肺、脾脏、瘤胃、子宫、小肠、心脏、卵巢和肌肉共11个组织为材料,另外设计2对引物用于组织表达谱分析。利用PCR—SSCP技术和DNA测序对Dmrt7基因的多态性进行检测。[结果]获得了一个长为1616bp的cDNA片段（GenBank登录号为EF534775）,该cDNA包含由1113个碱基组成的开放读码框（ORF）,该ORF编码370个氨基酸;发现在第四内含子上有一个C／G突变,随后在277头本地牛品种和国外牛品种中进行群体多态性检测,发现G等住基因频率分布范围从0～0．4138;基因杂合度,有效等位基因数和多态信息含量分别为0～0．4851、1．0000～1．9423和0～0．3675。[结论]克隆了牛Dmrt7基因的cDNA序列并进行组织表达谱分析,该G等位基因在本地牛品种和外国牛品种中没有差异。