半滑舌鳎Dmrt3基因cDNA片段的克隆与表达分析

同源克隆了半滑舌鳎Dmrt3基因的部分cDNA片段,片段长度为228 bp,NJ系统发育树显示,半滑舌鳎Dmrt3基因cDNA片段与红鳍东方鲀、青鳉以及斑马鱼的Dmrt3基因cDNA片段同源性最高,首先聚为一支。实时定量分析了Dmrt3基因在半滑舌鳎雌性和雄性个体的各组织中的表达情况,以及在高温处理和甲基睾酮处理组的雌性、雄性和伪雄鱼的性腺组织中的表达。Dmrt3基因在雌性和雄性的脑、垂体、性腺、肝脏、脾脏、心脏、肾脏7个组织中都有表达,但是表达量有差异,在精巢中的相对表达量高,Dmrt3基因在精巢的表达与其它组织中的表达差异极显著(P<0.01),而在卵巢中的表达很微弱,结果预示Dmrt3基因可能在雄性的性腺发育过程中起着重要的作用。高温处理组的雌性、雄性和伪雄鱼的性腺组织之间Dmrt3的表达无显著差异(P>0.05),但都极显著低于对照组的雄鱼(P<0.01)。高温处理组的伪雄鱼与对照组雌鱼性腺中Dmrt3的表达表达无显著差异(P>0.05)。甲基睾酮处理组的雄鱼和伪雄鱼性腺中Dmrt3的表达都显著高于对照组雄性(P<0.01)。从孵化后43 d到5月龄,Dmrt3的相对表达量很低,7月龄时表达量显著升高,9月龄时达到最高峰,12月龄时表达量下降,这也预示Dmrt3基因在半滑舌鳎性腺的发育过程中起重要作用,可能是促进生殖细胞发育的重要转录因子。     

海蜇(Rhopilema esculentum)Notch基因的cDNA克隆和表达

基于转录组454 GS FLX测序结果,利用RACE和RT-PCR技术克隆了海蜇(Rhopilema esculentum) Notch基因的cDNA全长,并分析了其mRNA在海蜇不同发育阶段的表达差异,以探讨Notch基因对海蜇无性生殖的影响.结果显示,海蜇Notch基因的cDNA全长为6768 bp,包括90 bp的5'非编码区、6066 bp的开放阅读框及612 bp包含AATAAA加尾信号的3'非翻译区.SMART分析表明,海蜇Notch为分泌蛋白,其信号肽由21个氨基酸组成.成熟肽由2000个氨基酸组成,包括37个结构域、26个表皮生长因子样结构域、3个富含半胱氨酸的Notch/Lin-12(NL)结构域、1个NOD结构域、1个NODP结构域、1个跨膜结构域和6个锚蛋白结构域ANK,并含有25个N-糖基化位点.同源分析表明,海蜇Notch与来自刺胞动物门的海葵(Nematostella vectensis)的Notch相似性为39％,与无脊椎动物和脊椎动物的氨基酸相似度分别为35％-37％和34％-38％.RT-PCR分析表明,Notch基因在海蜇无性繁殖的4个发育时期均有表达,螅状体阶段的表达量最高,横裂体阶段表达量最低,螅状体的表达量是横裂体的1.85倍.这些研究结果为进一步研究Notch信号通路在海蜇无性繁殖中的调控作用奠定了基础.     

真蛸热休克蛋白90基因(HSP90)的克隆及表达

为深入了解真蛸热应激响应机制,实验以真蛸的应激蛋白为研究对象,借助同源扩增和cDNA末端快速扩增(rapid amplification of cDNA ends,RACE)技术获得真蛸热休克蛋白90(HSP90)的cDNA全序列(2 709 bp),它包含119 bp的5’非编码区(untranslated regions,UTR)、454 bp的3’UTR和2 136 bp的开放阅读框(opening reading frame,ORF),ORF共编码711个氨基酸,推算其分子量为81.5 ku,理论等电点为5.09。同源分析显示,所推导的氨基酸序列高度保守,并且含有HSP90家族特有的5个保守信号序列区域。实时荧光定量PCR分析表明,该基因在所有选取的组织中均有表达,肝组织中表达量最高。     

半滑舌鳎Dmrt4基因DNA全序列的克隆与表达分析

克隆了半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)Dmrt4基因DNA全序列,得到的序列长度为2271 bp,包含1个内含子,2个外显子,与其他鱼类的同源性在90%以上.Dmrt4基因在雌性和雄性半滑舌鳎的7个组织中都有表达,有差异表达的组织是脑、垂体和性腺,雄性的表达显著高于雌性(P<0.05).高温处理组的伪雄鱼中Dmrt4基因的表达与对照组的雌鱼没有显著差异(P>0.05),但是甲基睾酮处理组的雄鱼和伪雄鱼的表达显著高于对照组的雌鱼和雄鱼(P<0.05).Dmrt4基因的表达在胚胎发育过程中呈现先升高后降低的趋势,在原肠期表达量最高,显著高于其他几个时期(P<0.05),从尾芽形成期开始恢复到多细胞期的表达水平,之后几个时期 Dmrt4基因的表达无显著变化(P>0.05),一直到出膜前保持恒定.研究表明, Dmrt4基因是雄性中优势表达的基因,并且受雄性基激素调节,但并不是性反转的必要因素.这一研究为半滑舌鳎全雌群体的建立提供了分子水平的研究基础.     

大鲵皮肤cDNA文库ESTs分析及Dynll 2基因的分离与表达

以本实验室构建的大鲵皮肤cDNA文库为材料,通过文库质量检测、随机测序、ESTs拼接、COG软件进行基因注释等对文库进行了分析,并从中分离获得了大鲵胞质动力蛋白轻链2(dynein light chain,LC8-type 2,Dynll 2)基因的cDNA序列,对Dynll 2基因进行了生物信息学分析及组织表达研究。结果表明,本实验室构建的大鲵cDNA文库初级库容为1.50×10⁶ cfu,文库重组率为94.8%,插入片段平均长度约为1 kb。400个随机克隆测序共获得343个有效ESTs,其中214条ESTs序列E值＜10^-6,经COG软件归为9大类,其中与分泌蛋白、细胞代谢、细胞骨架以及信号转导相关的基因表达量最高,分别为31.3%、14.0%、13.0%和12.6%。表明大鲵皮肤分泌活动强烈,代谢旺盛,这和大鲵皮肤发挥免疫、呼吸以及渗透压平衡等生理功能相一致。获得的大鲵Dynll 2基因全长为682 bp,其中5′-UTR为57 bp,3′-UTR为313 bp,生物信息学分析表明,该基因编码104个氨基酸,分子量为12.03 ku,等电点pI值为7.05。Dynll 2蛋白在88~104处有由里向外和由外向里的2个跨膜螺旋区,且二级结构以α—螺旋为主;在69~87处有典型的“ZnFC2H2”结构模体;经比较,其三级结构与鼠Dynll 2蛋白相似。Dynll 2蛋白的进化分析表明,大鲵与无尾两栖类相比,更接近陆生动物。荧光定量实验表明,大鲵Dynll 2基因在肌肉中高表达,在其他组织中低度表达。     

三疣梭子蟹GST基因的cDNA克隆及表达分析

取健康三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)‘黄选1号’80日龄幼蟹,体重(32.66±6.27)g。通过RT-PCR及Smart-TM Race技术,克隆了三疣梭子蟹谷胱甘肽S-转移酶(glutathiones-transferase,简称GST)基因c DNA全长序列(Gen Bank登录号:KF781517)。GST基因全长1 010 bp,编码一个由216个氨基酸组成的多肽,预测理论等电点PI为5.294,分子量为24.59 k D。氨基酸序列中含有GST基因家族特有GST-N结构域和GST-C结构域。同源性及系统进化分析表明,三疣梭子蟹GST基因与中华绒螯蟹(Eriocheir sinesis)和脊尾白虾(Exopalaemon carinicauda)的同源性分别为78%和63%。实时荧光定量PCR结果表明,GST基因在肝胰腺、鳃、肌肉、血淋巴、心脏和眼柄中均有分布,在肝胰腺中表达量最高(P0.05),其次是鳃(P0.05),在心脏中表达最少。三疣梭子蟹肌肉注射低、中、高3个剂量组的磺胺嘧啶后,GST基因表达较对照组都有表达,均呈现先升高后降低再升高的趋势。同时,随着药物浓度的增加,低、中、高3个剂量组峰值出现的时间越晚,分别为6 h、24 h和48 h。本实验结果表明,磺胺嘧啶可以诱导三疣梭子蟹GST基因表达,GST基因可能参与三疣梭子蟹的药物代谢反应。     

条斑紫菜HSP90基因的克隆与表达分析

为了研究HSP90在条斑紫菜胁迫耐受中的作用,克隆了条斑紫菜HSP90基因(命名为PyHSP90),采用定量RT-PCR研究了其表达规律。PyHSP90基因包含一个长2274nt的完整开放阅读框,编码757个氨基酸。PyHSP90蛋白定位于细胞质中,具有HSP90蛋白家族的特征序列和保守结构域,与多种生物的HSP90具有较高的序列一致性。在进化树上条斑紫菜等红藻的HSP90与隐藻的亲缘关系最近,与绿藻和陆生植物亲缘关系较远。低温和高温胁迫都能显著性地诱导条斑紫菜叶状体PyHSP90基因的表达,而且表达量与胁迫程度成正相关;低盐胁迫下PyHSP90基因表达上调;而失水胁迫下PyHSP90基因表达下调。     

半滑舌鳎促滤泡激素基因全长cDNA的克隆与组织表达分析

从半滑舌鳎Cynoglossus semilaevis Günther脑垂体中提取总RNA,利用RT-PCR和RACE技术首次克隆得到半滑舌鳎促滤泡激素（FSH）基因全长cDNA序列。半滑舌鳎FSHcDNA全长为541bp,开放阅读框为393bp,编码130个氨基酸（GenBank序列登录号：JQ277933）。发现一个N-糖基化位点：24～27NTT。与其他脊椎动物的FSH成熟肽氨基酸序列同源性比较表明,半滑舌鳎FSH与鲽形目和鲈形目鱼类FSH同源性为42％～49％,与鲤形目和高等脊椎动物FSH同源性为27％～319/5。用MEGA4．0软件构建了NJ树,获得的进化树表明,半滑舌鳎FSH与其他鱼类FSH聚类,亲缘关系较近。实时荧光定量组织表达分析表明,FSHmRNA除在垂体中大量表达外,其他组织也有表达,尤以脑、性腺表达量较高。半滑舌鳎FSHmRNA在垂体以外组织中的广泛表达,暗示FSH可能具有广泛的生理功能。     

三角帆蚌钙网蛋白基因cDNA的分子特征与表达分析

为研究淡水珍珠形成相关基因及调控机理,以三角帆蚌为研究对象,借助cDNA末端快速扩增(RACE)技术获得了三角帆蚌的钙网蛋白基因(calreticulin,HcCRT) cDNA序列,该序列长1 437 bp,包含231 bp的5'非编码区(untranslated region,UTR)和615 bp 3'UTR以及591bp的开放阅读框(ORF),共编码196个氨基酸残基,包含一段由21个氨基酸组成的信号肽和一段由175个氨基酸的成熟肽,分子量约为22.4 ku,理论等电点5.01.氨基酸序列分析表明,该序列不存在跨膜结构,疏水性分析显示该蛋白整体为亲水性蛋白.氨基酸列比对分析显示,HcCRT具有保守的钙网蛋白家族结构,具有2个保守的钙网蛋白家族标签序列:KHEQNIDCGGGYLKVF和IMFGPDICG,与其他已知物种的CRT具有较高保守性,其中与斑马鱼的相似度为77％,与长牡蛎和马氏珠母贝的相似度为70％.对三角帆蚌HcCRT蛋白序列的二级结构和三级结构进行预测分析,显示该蛋白同时含螺旋和折叠.实时荧光定量PCR分析结果显示,HcCRT在外套膜、血液、鳃、斧足、肝脏、肾脏、肠和闭壳肌等8个组织中均有表达,其中在外套膜中表达量最高,血液次之,在其他组织的表达量极少.初步推测HcCRT参与了三角帆蚌珍珠形成的生物矿化过程.     

大鲵虹彩病毒TaqMan实时荧光定量PCR检测方法的建立

利用PCR技术扩增出大鲵虹彩病毒(giant salamander iridovirus, GSIV)主要衣壳蛋白(MCP)编码区长度为1 392 bp 的片段, 克隆到 pMD19-T载体上, 构建重组质粒 pMD19-T-MCP。经PCR鉴定确认正确后, 以10倍梯度稀释 pMD19-T-MCP重组质粒, 作为标准模板进行 TaqMan实时荧光定量PCR扩增, 制作标准曲线, 建立了大鲵虹彩病毒的 TaqMan实时荧光定量PCR检测方法。制作的标准曲线有极好的线性关系, 且线性范围宽, 相关系数为0.990 19。组内重复试验的CT值标准偏差为0.52%。检测结果显示, 该方法对大鲵虹彩病毒的检测有高度的特异性, 与锦鲤疱疹病毒、弗氏柠檬酸杆菌、嗜水气单胞菌以及鲤上皮瘤细胞基因组DNA之间均无交叉反应, 特异性好, 检测总DNA灵敏度为10个病毒核酸分子拷贝数, 约1.1×10-3 pg/μL病毒核酸, 较之常规PCR的敏感度高出约1 000倍。研究建立的大鲵虹彩病毒TaqMan实时荧光定量PCR方法灵敏度高、特异性强, 对大鲵虹彩病毒病的快速诊断与病毒病原定量检测有重要意义。     

大鲵幼体蛋白质的需求量

为评定大鲵幼体对饲料蛋白质的需求量,以鱼粉为主要蛋白源配制6种蛋白质水平(干样基础)的实验饲料:D1(43.7%)、D2(47.1%)、D3(51.3%)、D4(55.7%)、D5(59.9%)和D6(64.4%),饲喂初始体质量为(20.99±0.15) g的大鲵幼体92 d。结果显示,①饲料蛋白质水平对大鲵增重率有显著影响,在D4组达到最大值,较D1组增加了276.4%,且全鲵蛋白质沉积率和肌肉RNA、RNA/DNA值、胃蛋白酶、H⁺-K⁺-ATPase、胰蛋白酶、脂肪酶和Na⁺-K⁺-ATPase、肝脏超氧化物歧化酶(SOD)均在D4组达到最佳,而肝脏和肠道丙二醛(MDA)在该组均达到最低;②随饲料蛋白质水平增加,肌肉粗蛋白线性增加,全鲵脂肪线性下降,全鲵水分和粗灰分在各组间差异不显著,全鲵粗蛋白先增加后趋于稳定,在D4组达到最大;③大鲵皮肤胶原蛋白含量在D4组达到最高,较D1组增加了27.83%。研究表明,以增重率、肌肉RNA/DNA值、蛋白质沉积率和皮肤胶原蛋白含量为评价指标,通过二次回归...     

淇河鲫R-spondin1基因cDNA克隆和表达

为探索R-spondin1(Rspo1)基因在雌核发育三倍体鱼淇河鲫性别决定与分化过程中的作用,本研究利用RACE技术克隆Rspo1基因cDNA序列,同时分析它的时空表达模式,并检测芳香化酶抑制剂Letrozole及高温养殖诱导性逆转下它在性腺中的表达情况。将扩增的PCR产物经亚克隆测序、拼接后获得淇河鲫Rspo1 cDNA序列,长1 243 bp(MH243761),包含5′非编码区318 bp,3′非编码区127 bp和开放读码框798 bp,共编码265个氨基酸残基。氨基酸序列比对及系统进化分析结果显示,淇河鲫Rspo1与其他鲤科鱼类同源性较高,与哺乳类、爬行类等脊椎动物同源性相对较低;组织分布检测结果显示,Rspo1基因在淇河鲫各个组织中均有表达,其中肌肉组织表达量最高,卵巢次之,而在脾脏、肾脏、心脏组织中表达量较低;在胚胎发育过程中Rspo1的表达量在未受精卵与受精卵中无差异,随着胚胎发育而降低,神经胚期最低,从尾芽期至出膜期又逐步升高。胚后阶段,Rspo1在性腺中的表达量从淇河鲫性别决定与分化关键时期(孵化后20 d)开始上调。Letrozole处理或高温养殖引起的性逆转中,Rspo1在性腺中表达量升高。研究表明,淇河鲫Rspo1作为一个母源性因子可能在卵巢分化与维持中起到一定作用,同时它可能也参与精子发生过程。     

食蚊鱼CYP19a基因的克隆与序列分析

硬骨鱼类CYP19基因与生物的性别分化和激素调节相关,因此可开发用来探究环境激素污染与基因表达的关系。本研究首次克隆和分析了食蚊鱼CYP19a cDNA的全系列,为将CYP19基因作为监测环境激素生物标志物的研究提供了全面的实验数据。根据CYP19a基因c DNA保守区域设计引物,扩增保守区域并测序。采用RACE法扩增食蚊鱼CYP19a基因c DNA序列全长,对其蛋白序列进行同源性分析,并将序列应用于CYP19a mRNA转录水平的RT-PCR法检测中。成功克隆食蚊鱼CYP19a基因全长,获得CYP19a基因总长为2020 bp,ORF为238~1791 bp,共编码518个氨基酸,对其编码的蛋白质进行有关信号肽、跨膜螺旋、亲水性/疏水性、一级结构、二级结构和三级结构分析,与其他硬骨鱼类底鰆、青鰆、平鲷、鲫、鲤和斑马鱼的性腺CYP19a基因作同源性比较,其基因相似度分别为93%、84%、84%、71%、71%和66%。用MEGA6.0软件对19个物种的CYP19a基因进行聚类分析,食蚊鱼CYP19a基因与底鰆、青鰆同源性最高,说明芳香化酶在进化上相对保守。确定从食蚊鱼性腺所克隆的CYP19a基因是芳香化酶基因,证明食蚊鱼的芳香化酶是由CYP19a和CYP19b两种基因编码的。食蚊鱼卵巢芳香化酶具有3个高度保守的片段,并具有催化活性。     

中国明对虾caspase2基因克隆及其在抗白斑综合征病毒中的表达分析

采用RACE技术克隆获得中国明对虾caspase2基因cDNA序列全长,并对该序列进行分析。结果显示,中国明对虾caspase2基因全长为1517 bp,开放阅读框长924 bp,5'非编码区长78 bp,3'非编码区长515 bp,命名为FcCasp2。推测该基因编码307个氨基酸,预测分子量为34.21 ku,理论等电点为7.62。同源性和系统进化分析发现,FcCasp2基因与凡纳滨对虾caspase2和斑节对虾caspase的相似性分别为88%和80%,与其他节肢动物caspase家族基因聚为一类。荧光定量RT-PCR结果显示,FcCasp2基因在肝胰腺中的相对表达量最高,在肌肉中表达量最低。WSSV感染后该基因在中国明对虾肌肉、肝胰腺和鳃丝中的表达量有不同的时空表达趋势,表明FcCasp2基因可能参与中国明对虾生物胁迫的应答反应。     

马氏珠母贝基质金属蛋白酶基因MMP-17的克隆及表达分析

基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases,MMP)是一种能够降解细胞外基质的蛋白水解酶。MMP-17是一种膜型基质金属蛋白酶,通过糖基磷脂酰肌醇连接于细胞表面,参与调控有机体的内环境稳定、宿主防御等多种生理过程。为研究MMP-17在马氏珠母贝免疫反应中的作用,实验运用RACE技术,克隆得到马氏珠母贝MMP-17(Pinctada martensii MMP,Pm-MMP-17)基因cDNA 全长序列,并对其序列特征及功能进行初步分析。结果显示,Pm-MMP-17基因cDNA全长2 794 bp,开放阅读框(ORF)为1 923 bp,编码640个氨基酸,5'UTR长156 bp,3'UTR长715 bp,分子量约为73.11 ku,等电点为8.98;多序列比对和系统进化树分析表明,Pm-MMP-17与其他物种的MMP具有较高的保守性,与长牡蛎的MMP-17相似性高达82%;功能结构域分析表明,Pm-MMP-17有5个高度保守的结构区域:N-末端的信号肽、前导区、催化区、铰链区和C-末端的类血红素结合蛋白区;荧光定量数据分析表明,Pm-MMP-17基因在马氏珠母贝的闭壳肌、珍珠囊、足、外套膜、血淋巴、肝胰腺、性腺、鳃等8个组织中均有表达,在血液中的表达量最高,闭壳肌和鳃次之;脂多糖(LPS)刺激后,Pm-MMP-17基因表达水平上调,12 h后达到最大值,之后又逐渐下调并恢复到正常水平。研究表明,Pm-MMP-17基因可能在马氏珠母贝的免疫反应中起着重要作用。     

日本沼虾cytMnSOD和mtMnSOD基因全长cDNA克隆及表达

利用RACE技术从日本沼虾肝胰腺中克隆了cytMnSOD和mtMnSOD基因cDNA全长序列。cytMnSOD基因cDNA全长1 233 bp,开放阅读框为858 bp,编码286个氨基酸,N端含有60个氨基酸残基组成的延伸区;mtMnSOD基因cDNA全长1 113 bp,开放阅读框为654 bp,编码218个氨基酸,N端含有20个氨基酸残基组成的信号肽;cytMnSOD和mtMnSOD预测蛋白分子量及等电点分别为31.33、24.05 ku和5.62、7.12。日本沼虾cytMnSOD推导的氨基酸序列与其mtMnSOD的相似性为40%,二者均含有MnSOD的特征肽段(DVWEHAYY)、4个Mn2+结合位点和2个N-糖基化位点。Real-time PCR结果表明,cytMnSOD和mtMnSOD在日本沼虾肝胰腺、肌肉、血细胞、大颚器官、卵巢和鳃等组织均有表达,其中肝胰腺表达量最高;肝胰腺cytMnSOD和mtMnSOD基因的表达量在蜕皮间期最高,蜕皮后期和蜕皮前期较低。嗜水气单胞菌刺激后3 h,肝胰腺cytMnSOD和mtMnSOD的表达量显著增加,推测MnSOD是参与机体免疫防御反应的一种重要分子。     

拟穴青蟹卵泡抑素相关蛋白基因的克隆和表达分析

卵泡抑素相关蛋白(follistatin related protein,FRP)是一种细胞外基质糖蛋白,该蛋白参与细胞增殖、迁移、组织重塑、胚胎发育、细胞间相互作用等多种生理过程。迄今甲壳动物FRP的研究尚未见诸报道。实验采用RACE技术首次克隆了拟穴青蟹FRP基因部分cDNA序列。该序列长度1 948 bp,FRP肽段含有484个氨基酸残基,包括KAZAL-FS结构域、EFh结构域和两个Ig结构域。系统进化树显示拟穴青蟹FRP基因的分子进化地位与其生物学分类地位一致。半定量PCR及荧光定量PCR结果表明,FRP基因在拟穴青蟹的胸神经团、脑和卵巢中表达。FRP基因在卵巢发育各期的表达量各不相同,卵巢未发育期最高,据此我们推测FRP具有抑制卵巢发育的作用。