拟南芥ROP2与GGB蛋白互作的分析

为了阐明拟南芥ROP蛋白家族成员ROP2与蛋白异戊二烯化中I型香叶酰基的β亚基GGB的互作关系,本研究先后采用酵母双杂交和三杂交技术分析了两者之间的相互作用。结果表明,ROP2与GGB之间在酵母细胞中并没有发生相互作用。我们又采用双分子荧光互补(BiFC)技术在植物体内再次验证两者之间的相互作用。重新构建了一套带多克隆位点的常规BiFC重组表达载体,基于这套BiFC载体,进行了验证分析。结果表明,实验组在本氏烟草的表皮细胞中发现了黄色荧光信号,并且信号定位在细胞膜上,而阴性对照组未发现荧光信号,说明GGB蛋白与ROP2蛋白在植物体内存在相互作用,并且这种相互作用发生在细胞膜上。本研究结果为进一步揭示ROP2的生化调控机制奠定了前期基础。     

双分子荧光互补试验研究水稻NH1家族蛋白之间相互作用

NPR1(Non-expresser of pathogenesis related genes 1)是水杨酸(Salicilic acid,SA)介导的系统获得抗性(Systemic aquired resistance,SAR)的关键调控因子,在水稻中过量表达拟南芥NPR1和水稻NH1/OsNPR1(NPR1 ho...     

拟南芥G蛋白α亚基GPA1互作蛋白铜离子结合蛋白AtBCB的鉴定及功能分析

拟南芥G蛋白复合体(异源三聚体包括α、β、γ亚基)参与植物多个信号转导途径,G蛋白复合体通过膜上的G蛋白偶联受体(GPCR)接受胞外信号后通过3个亚基将信号传递给下游效应器。目前,有关植物G蛋白复合体的效应器及其信号传递途径的报道较少,寻找新的G蛋白的效应器有助于阐明G蛋白复合体相关的信号传导途径。本研究以拟南芥G蛋白α亚基GPA1为诱饵蛋白,利用泛素分离系统筛选拟南芥cDNA文库,获得一个与GPA1互作的铜离子结合蛋白AtBCB。荧光双分子杂交(BiFC)试验证明,GPA1与AtBCB的互作发生在细胞膜上。基因表达特性分析结果显示,GPA1和AtBCB受金属铝胁迫的诱导表达。进一步以野生型拟南芥(WT)、GPA1拟南芥突变体gpa1-4和AtBCB拟南芥突变体bcb为材料,研究该基因对植物耐金属铝胁迫的功能,结果显示,在无胁迫情况下,2个突变体和WT根部的丙二醛含量无显著差异;在100 µmol L^–1 Al³⁺处理下,gpa1-4突变体根部丙二醛含量显著(P<0.05)低于WT低;bcb根部丙二醛含量极显著(P<0.01)高于WT。对3个铝胁迫响应基因(苹果酸转运体基因AtALMT1、半类型ABC转运蛋白基因ALS1和ABC转运蛋白基因ALS3)的表达进行Real-time PCR分析,比较它们在突变体和野生型之间的表达差异,发现在有铝和无铝处理情况下,ALS1和ALS3的表达水平在突变体和WT间均无显著差异;在铝处理下,gpa1-4中AtALMT1的表达量极显著高于WT;在bcb中的表达量显著低于WT。以上结果表明,植物通过细胞膜上的G蛋白α亚基GPA1和铜离子结合蛋白AtBCB的相互作用调控下游基因AtALMT1的表达,参与植物对铝胁迫的响应,其中GPA1对铝胁迫耐受起负向作用,AtBCB对铝胁迫耐受起正向作用。     

DREB1C-GFP融合基因植物表达载体的构建

为了便于转基因植株的分子检测,利用重叠延伸PCR（gene splicing by overlap extension PCR,SOE PCR）方法克隆来自于水母的绿色荧光蛋白基因（GFP）和来自于拟南芥的目的基因DREB1C转录因子,并对其进行改造获得融合基因。通过酶切和连接,将融合基因构建到表达载体pCAMBIA1301上,获得了具有DERB1C和GFP基因的重组表达载体pDR1-GFP,酶切和测序结果表明,该融合基因与设计相符。     

抗小麦黄矮病相关蛋白激酶TiDPK1与BYDV外壳蛋白的互作

小麦黄矮病是由大麦黄矮病毒(Barley yellow dwarf virus, BYDV)引起的小麦重要病毒病。分离于小麦–中间偃麦草易位系的蛋白激酶编码基因TiDPK1, 是一个抗小麦黄矮病相关基因。本文报道利用酵母双杂交技术和双分子荧光互补技术对TiDPK1与BYDV外壳蛋白(coat protein, CP)互作的研究结果。酵母双杂交分析结果表明, TiDPK1能够与BYDV-GAV、-PAV株系的CP互作, 双分子荧光互补分析结果进一步表明, TiDPK1可与BYDV的CP互作、产生双分子荧光互补信号, 说明TiDPK1确可与BYDV CP相互作用, 该结果对了解TiDPK1在小麦抗BYDV反应机制具有一定意义。     

微生物效应蛋白在植物-微生物互作中作用的研究进展

微生物效应蛋白在植物与微生物的相互作用过程中发挥种间的信息交流功能,起到重要的桥梁作用。它通过抑制植物受体诱导的免疫、调控植物基因转录、酶激活或抑制等方式为微生物侵染植物提供便利。不同类型微生物效应蛋白发挥的功能不同,作用方式和分子机制也不尽相同,且研究状况存在一定的差异,本研究通过回顾近些年来微生物效应蛋白的研究结果,对其在细菌、真菌、卵菌等病原菌及有益共生菌侵染宿主过程中的作用和分子机制进行总结,为植物-微生物相互作用机制深入研究提供相关理论依据。     

含双边界序列植物双价表达载体的构建

转基因植物的安全性是基因工程改良作物的一个重要问题.构建含双边界序列（双T-DNA区）载体,将选择标记基因和目标外源基因分开在不同的T-DNA区,通过转基因植株有性杂交及后代分离,可在转基因后代中获得无选择标记的转基因安全植株.将2个外源基因置于同一载体上,可以提高其共转化的效率.本研究构建了1个中间载体pAHC17-PTA和1个含双边界序列的植物双价表达载体pDB13PS.pAHC17-PTA含有由Ubiquitin启动子引导的具有抗虫效果的半夏凝集素基因（PTA）.pDB13PS含2个独立的T-DNA区,在其中一个T-DNA区,含两个目的基因的完整的表达盒,一个是由Ubiquitin启动子引导的半夏凝集素基因（PTA）,另一个是由水稻胚乳特异表达启动子（Glutelin-B1 promoter）驱动的马铃薯高赖氨酸蛋白基因的cDNA（SB401）.pDB13PS的成功构建,为提高PTA和SB401的共转化效率和获得无选择标记的转基因后代植株奠定了基础.     

绿色荧光蛋白及其在植物分子生物学中的应用

绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)是源于海洋生物多管水母属(Aequoria Victoria)的一种发光蛋白,能够自身催化形成生色团并在蓝光或紫外光激发下发出绿色荧光,能在活细胞内稳定表达。GFP的荧光反应不需要任何底物及辅助因子,使表达检测非常简单。同时,GFP在细胞中呈自主表达,没有细胞种类、位置和种属的特异性。GFP对受体细胞无毒性,对目的基因没有影响。因而可以很方便的对活体进行观察,来研究GFP基因的表达。由于GFP对光漂白、氧化剂、还原剂、酸、碱以及其它许多化学试剂具有极强的稳定性,因此,GFP作为报告基因可用来监测转基因的表达、信号转导、蛋白运输与定位等。本文对GFP基础理论研究及在植物分子生物学中的应用作了综述。     

月季酵母双杂交cDNA文库的构建及RhRD22互作蛋白的筛选

月季(Rosahy brida)是全球重要的观赏植物,其生长发育和生产质量严重受到干旱胁迫的制约.在已有月季转录组数据的基础上,干旱胁迫可以诱导干旱响应基因RD22(dehydration-responsive gene RD22)的表达.为了进一步探究RhRD22参与干旱胁迫的分子机制,本研究利用改良的SMART(S...     

GbTCP10基因植物表达载体的构建及拟南芥转化

TCP转录因子广泛参与植物细胞生长和增殖调控,本研究构建海岛棉GbTCP10基因沉默和过量表达植物表达载体。以GbTCP10基因pGEM-T Easy-GbTCP10质粒为模板进行PCR扩增,连接至植物表达载体pCAMBIA3301中,再利用冻融法和热激法转到农杆菌GV3101菌株中,通过农杆菌浸染法转化拟南芥植株,初步证明已获得海岛棉GbTCP10基因的拟南芥。利用重叠PCR方法替换拟南芥At-MIR319的成熟链和互补链序列,构建含有amiRTCP10前体的植物表达载体amiRTCP10-pCAMBIA3301,本试验结果有助于进一步研究海岛棉GbTCP10基因的生物学功能和棉花纤维发育机制。     

玉米醇溶蛋白γ-zein基因载体构建及亚细胞定位

用PCR方法从pROK.TG1LK扩增得到γ-zein基因的全长,克隆到中间载体pMD18-T,获得了重组质粒pMD18-γ-zein,分别用Nco Ⅰ和Bgl Ⅱ 2种限制性内切酶酶切重组质粒和经过改良的pCAMBIAI 1302载体,经回收、连接、转化、鉴定后,构建了由35S驱动的绿色荧光蛋白(GFP)融合的植物表...     

白花虎眼万年青QtJMT基因的克隆及其植物表达载体的构建

茉莉酸及其甲基化的衍生产物茉莉酸甲酯,后者具有较高生物活性,在植物的生命活动过程中发挥重要作用。茉莉酸甲基转移酶(jasmonic acid carboxyl methyltransferase, JMT)作为甲基转移酶类家族中的重要成员,是将茉莉酸甲基化衍生为茉莉酸甲酯过程中发挥催化作用的关键酶,过表达能够使得植物内源茉莉酸甲酯的生物合成能力增强,内源茉莉酸甲酯的含量提高,进而增强植物抗逆性及提高植物次生代谢物质含量,以及调控植物生长发育。白花虎眼万年青具有抗逆性强、次生代谢物质丰富、以及器官再生方式独特等特点,可能具有较高生物活性的茉莉酸甲基转移酶及其分子机制,但是尚未见到报道。本研究根据白花虎眼万年青叶上珠芽转录组分析数据,设计引物,克隆分离出茉莉酸甲基转移酶基因完整编码区,进而对其进行了三维立体结构、蛋白质保守序列及系统发育等生物信息学分析,将其命名为QtJMT基因,并成功将其连接到泛素启动子(pUB)驱动的植物表达载体上。本研究结果为QtJMT基因的深入分析其功能及在花卉分子育种中的应用提供了一定的依据。     

菠萝AcMYB44基因的克隆及植物表达载体构建

为研究R2R3-MYB转录因子家族成员AcMYB44基因在菠萝非生物胁迫过程作用机制,利用PCR技术从菠萝品种‘手撕菠萝’叶片中克隆AcMYB44并利用生物信息学对其结构及功能进行分析。结果表明,克隆获得的AcMYB44基因cDNA序列全长1 048 bp,开放阅读框(ORF)为771 bp,编码256个氨基酸。AcMYB44编码一个无信号肽、无跨膜结构且定位于细胞核的不稳定亲水蛋白,存在两个SANT保守结构域,属于R2R3-MYB家族。系统进化分析表明,AcMYB44与AtMYB44、AtMYB70、AtMYB73、AtMYB77、GmMYB73、MsMYB44、CeMYB44、DcMYB44亲缘关系较近且聚类为S22亚族。模式植物中研究表明S22亚族成员与抗逆相关。利用同源重组的方法构建了绿色荧光蛋白融合表达载体pGREEN-AcMYB44-ORF-GFP。以上结果为深入研究AcMYB44基因在菠萝中的功能奠定基础。     

铁皮石斛CIPK24与CBL1的互作及盐胁迫下的表达分析

为研究铁皮石斛(Dendrobium catenatum Lindl.)应对盐胁迫的抗性机制,利用PCR技术从铁皮石斛cDNA中克隆丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶基因CIPK24和类钙调素B亚基蛋白基因CBL1,用生物信息学技术对其编码蛋白的进化关系进行了分析;采用实时荧光定量PCR技术分析它们的表达模式;并构建酵母表达载体,利用酵母双杂交技术研究这两个蛋白的互作关系。结果表明,铁皮石斛CIPK24和CBL1分别与拟南芥CIPK24以及CBL1蛋白的亲缘关系最近;空间表达模式分析发现CIPK24和CBL1基因在花萼、合蕊柱等生殖器官中表达量较高,而在营养器官中表达量较低;盐处理铁皮石斛组培苗后,CIPK24在根中受盐胁迫诱导上调表达,在茎和叶中表达量变化不明显;而CBL1基因在根和叶中受盐胁迫诱导均呈现上调表达,且根中CIPK24和CBL1基因的表达模式相似。酵母双杂交结果表明铁皮石斛CIPK24和CBL1蛋白能够互作。本研究表明,根中CIPK24和CBL1通过互作可能在铁皮石斛响应盐胁迫中起到重要作用,为进一步研究铁皮石斛耐盐性提供理论参考。     

本生烟脂质转移蛋白基因克隆及VIGS沉默载体和过量表达载体构建

非特异性脂质转移蛋白(non-specific lipid transfer proteins,nsLTPs)是植物中大量存在的小分子脂类结合蛋白,具有多种生物学功能。为研究nsLTPs在调控植物应答生物与非生物胁迫的反应中起的作用,本研究以本生烟(Nicotiana benthamiana)为材料,成功克隆非特异脂质转移蛋白NbLTP1全长基因,其开放阅读框序列为360 bp,编码119个氨基酸,分子重量为12.44 kD,为疏水性蛋白,等电点为7.45。对NbLTP1蛋白质三级结构进行了预测和分析,并进一步构建了烟草脆裂病毒(Tobacco rattle virus,TRV)介导的病毒诱导的基因沉默载体TRV:NbLTP1。荧光定量PCR结果表明通过VIGS可以显著抑制NbLTP1基因的表达。此外还通过In-Fusion克隆技术快速成功构建了pCAMBIA1305-NbLTP1-3*HA过量表达载体。本研究为下一步遗传转化、后续研究NbLTP1调控植物防御生物与非生物胁迫的分子机理、培育新种质提供理论依据。     

西瓜减数分裂相关基因ClSPO11-1的互作蛋白筛选

减数分裂是有性生殖的关键过程.Ⅱ型拓扑异构酶SPO11是在植物减数分裂过程中起重要作用的一类酶,然而,该类酶在减数分裂过程中的具体分子作用机制目前尚有待鉴定.本研究以西瓜花蕾cDNA为模板,首次克隆获得西瓜拓扑异构酶基因ClSPO11-1的CDS全长1 095 bp,编码394个氨基酸.为了进一步研究ClSPO11-1...     

粉葛查尔酮合成酶基因PtCHS的克隆与植物表达载体构建

查尔酮是植物体形成的一类次级代谢产物,在植物花色形成、育性及抵抗胁迫中发挥重要作用.前期研究发现粉葛与野葛中总黄酮的含量和葛根素的含量差异较大,而查尔酮合成酶是黄酮类化合物合成中的首个关键酶.为了研究野葛与粉葛中的查尔酮合成酶(CHS)基因是否存在差异性,利用同源克隆的方法,根据已报道的野葛(CHS基因序列设计引物,从...     

基于Gateway技术的拟南芥雄性不育GHF 基因表达载体的构建

随着模式植物拟南芥全基因组测序工作的完成更多雄性不育相关基因功能需要阐明。利用拟南芥突变体库,从反向遗传学角度进行突变基因的功能研究需要构建相应的载体进行互补实验。Gateway技术是一种高效,快速的克隆系统。笔者利用Gateway克隆技术成功构建拟南芥GHF基因表达载体,并遗传转化拟南芥,为进一步阐明该基因功能奠定了基础。