EPA和DHA合成表达载体构建及对水稻的遗传转化

二十碳五烯酸(eicosapentaenoic acid, EPA)和二十二碳六烯酸(docosahexaenoic acid, DHA)是最具有营养价值的ω-3超长链多不饱和脂肪酸(very long-chain polyunsaturated fatty acids, VLPUFAs),其主要来源是某些深海鱼油、藻类和微生物。由于过度捕捞、重金属污染及提取产生的高昂价格等问题,已难以满足市场的需求,而高等植物中不存在ω-3 VLPUFAs途径。因此,开发富含EPA和DHA新植物资源具有广阔的应用前景。本研究将7个与ω-3 VLPUFAs合成相关的酶基因共同导入水稻中,创建ω-3 VLPUFAs合成通路,以期获得种子中富含EPA和DHA的水稻新材料。人工合成优化后的EPA和DHA合成相关的7个基因,利用不同的水稻胚乳特异性高强度启动子,以及不依赖启动子的3’-非翻译区(untranslated regions, UTRs),分别与这些目的基因组合,利用高效多转基因堆叠系统II (transgene stacking II, TGS II)构建到植物表达载体中,通过农杆菌介导法进行遗传...     

小麦miR395a前体克隆、遗传转化及组织表达模式分析

miRNA是一类在调控植物发育和生物及非生物逆境胁迫响应过程中发挥重要功能的非编码小RNA,为了探究miR395a在小麦抗病中的功能和作用机制,比较了不同物种中的miR395a成熟序列,分析发现miR395a在不同物种中具有较高的保守性,其中小麦与拟南芥、番茄以及大豆中的miR395a成熟序列具有高度一致性。并从小麦叶片中克隆了miR395a的前体序列,并将其连接到植物表达载体pCambia1301上,构建了miR395a前体的过量表达载体,之后通过农杆菌介导的遗传转化法,转化至小麦栽培品种(百农207)中,获得56株转基因植株,并通过PCR鉴定出11株阳性转基因植株。用RT-qPCR技术对不同组织中miR395a的表达量进行分析,结果显示,miR395a为组成型表达,但在不同组织中的表达量有差异,其中在三叶期和抽穗期叶片中的表达量较高,叶鞘中次之,旗叶中表达量最低。综上,获得了过量表达miR395a前体的小麦转基因植株,为进一步研究miR395a在小麦抗病中的功能及作用机制提供了材料来源。     

玉米miR395基因家族生物信息学分析及靶基因预测

MicroRNA(miRNA)具有调控基因表达的作用,为了揭示玉米miR395基因家族进化规律、表达模式及功能,开展了基因定位、多序列比对、顺式作用元件分析、二级结构分析、靶基因预测及表达模式分析。结果共鉴定到16个成员,且均集中分布在第2号、第10号染色体上;19个碱基完全相同,表明在进化过程中具有高度保守性;具有18个ABRE类顺式作用元件,推测其通过参与调节ABA信号传导,提高玉米抗逆性;多数靶向基因参与硫酸盐同化,初步推测玉米miR395基因家族参与玉米硫代谢;转录组分析发现zma-miR395基因家族中一些成员为下调表达模式。研究结果为后续玉米相关基因的功能解析奠定了基础。     

水稻白穗突变体wp7的鉴定及基因定位

水稻白穗变体可用于研究穗部叶绿体发育机制及光合作用机理,进而指导产量性状的改良.在水稻育种材料中发现一个白穗突变体wp7 (White panicle 7),对其进行表型观察、光合色素含量与光合指标测定、显微结构观察、遗传分析和基因定位.结果 表明:其抽穗期颖壳白化,枝梗和穗轴绿色.wp7的颖壳叶绿素与类胡萝卜素含量均...     

水稻延伸因子复合体家族基因鉴定及非生物胁迫诱导表达模式分析

延伸因子复合体(Elongator, ELP)是一类在真核细胞转录中起延伸RNA聚合酶Ⅱ作用的蛋白质复合物,这类复合体在植物生长发育以及生物和非生物胁迫响应等方面均发挥着重要作用。本研究利用生物信息学的方法对水稻(Oryzasativa)ELP基因家族(OsELPs)成员进行鉴定,并进一步对其理化性质、亚细胞定位、染色体定位、启动子顺式作用元件及在非生物胁迫下的表达模式进行分析。结果表明:OsELPs基因家族含有6个成员、随机分布在水稻5条染色体上,这6个基因编码含250～1344个氨基酸残基的蛋白质,其分子量介于27.97～148.99kD,等电点介于5.01～8.63。系统进化分析将来源于水稻(Oryza sativa)、拟南芥(Arabidopsis thaliana)、酵母(Saccharomyces cerevisiae)和人类(Homosapiens)的ELPs蛋白分为4个亚组(GroupⅠ～GroupⅣ),其中第I亚组包含OsELP1,第Ⅱ亚族包含OsELP2和OsELP5,第Ⅲ亚组包含OsELP4,而第Ⅳ亚组包含OsELP3和OsELP6。OsELPs的启动子区域中存在...     

水稻减数分裂异常突变体osmd的表型分析及基因定位

减数分裂是有性生殖生物繁殖的基础,减数分裂和受精过程的正常进行保证了有性生殖生物配子体和合子体世代交替,并维持了遗传物质的稳定性。因此发现和克隆减数分裂相关基因可为进一步理解减数分裂调控过程提供研究基础。通过正向遗传学方法,筛选一个水稻减数分裂相关突变体并将其命名为osmd(Oryza sativa meiosis defect)。对其生长过程、花器官、花粉育性进行观察分析;通过DAPI,FISH染色对其进行染色体行为分析;并对该突变体进行遗传分析、基因定位和候选基因分析。结果表明,与野生型相比,osmd突变体营养生长过程正常,花器官以及雌蕊形态正常,但是成熟期花药不饱满,花粉粒不能被I2-KI染色。对突变体osmd花粉母细胞减数分裂过程观察发现,在粗线期染色体不能完全配对、终变期出现单价体、二分体时出现滞后染色体、四分体时期出现多个微核。通过FISH试验确定osmd突变体同源染色体不能正常配对。遗传学分析表明,osmd突变体不育表型由一个单核隐性基因控制;通过图位克隆将osmd的突变位点定位到10号染色体上的2个Indel分子标记Chr10-312和Chr10-1003-3之间,该区间共有900 kb,有133个开放阅读框。该区间内一个已知水稻减数分裂相关基因OsPAIR3编码区序列无变化。由此推测Os MD是一个未报道的参与水稻减数分裂同源染色体配对过程的蛋白。     

OsI2基因的克隆及其植物表达载体的构建

在旱稻IRAT109干旱胁迫下cDNA芯片分析结果的基础上,通过RT-PCR,5'-RACE及3'-RACE方法,从IRAT109总RNA中扩增得到了干旱胁迫下芯片表达谱中上升表达强度第二的基因全长序列,命名为OsI2,全长有523 bp,并对基因序列结构进行了分析.该基因与全长cDNA文库中的CT836140.1有99%同源.OsI2基因编码产物对应1个包含57个氨基酸的开放阅读框(ORF),为一功能未知蛋白.其编码产物也可能对应两个中间相隔19 bp的较小ORFs(43个氨基酸和42个氨基酸),都是功能未知的蛋白.在pBI121载体的基础上,将OsI2基因与CaMV35S连接成功构建了pBl121-OsI2植物表达载体,为进一步研究其功能创造了条件.     

水稻耐盐性基因SKC1的KASP标记的开发与利用

籼稻品种‘Nona Bokra’中携带的SKC1^NB等位基因水稻耐盐性的主效QTL (Quantitative trait locus)位点。为了提高对水稻SKC1基因型鉴定效率,根据SKC1^NB基因中的功能性SNP位点开发了一个KASP分子标记SKC1^NB-KASP,利用该标记对‘Nona Bokra’与粳稻品种‘繁14’、‘花B’和‘武1B’的回交BC₃F₂群体进行SKC1等位基因的分型,发现在BC₃F₂群体受测的65个单株的DNA样品中,有16份样品的基因型与供体亲本‘Nona Bokra’相同,31份样品显示杂合基因型,18份样品与轮回亲本基因型相同。对这65份DNA样品的,SKC1基因进行测序以检验KASP标记基因分型结果的准确性,发现测序结果与KASP标记分型的结果完全一致。以上结果说明SKC1^NB-KASP标记可以高效、准确地鉴定,SKC1位点的基因型,大大提高了耐盐性水稻分子标记辅助选择育种的效率...     

水稻早衰突变体esl3的鉴定与基因定位

叶片早衰直接降低作物的光合作用、产量和品质。因此,鉴定早衰突变体和研究其基因功能对于作物的遗传改良具有重要的作用。esl3来源于水稻籼型恢复系缙恢10号的EMS诱变库,苗期叶片中上部即呈现褐化枯萎,该特征一直持续到植株成熟。与野生型相比,突变体衰老部位叶绿素和光合速率极显著下降,绿色部位光合色素和光合速率则略有升高。农艺性状分析发现,结实率无显著变化,有效穗、穗长、穗粒数、千粒重、株高和干物质重则显著或极限著下降。遗传分析表明,esl3叶片早衰枯死性状受1对隐性核基因控制。利用391株日本晴/esl3的F₂突变型单株,最终把ESL3基因定位在第5染色体SSR标记RM19085和Indel标记Ind05-2之间,物理距离91 kb,包含14个注释基因,为下一步调控基因的克隆和功能研究奠定了基础。     

水稻抗坏血酸氧化酶基因家族生物信息学分析

抗坏血酸氧化酶(ascorbic acid oxidase,AAO)是多铜氧化酶家族中的一员,在植物生长发育过程中起重要作用。为深入研究水稻AAO基因家族的功能特征及表达模式,采用生物信息学从Phytozome的水稻数据库鉴定出14个AAO成员,并对其染色体定位、蛋白理化性质及二级结构、基因结构、保守基序、系统发生树和表达模式等方面进行预测分析。结果显示,14个OsAAO不均匀地分布在8条染色体上,多为碱性蛋白;蛋白二级结构以无规则卷曲为主要组成部分;基因结构和保守基序分析表明,OsAAO内含子数目变化差异较大,但氨基酸序列具有较强的保守性;系统发生树可分为3个亚家族,OsAAOs与玉米、高粱簇在一起,亲缘关系较近;另外表达模式分析发现,OsAAO在不同的组织部位表达水平具有差异,这表明其行使功能不同。这些结果为今后研究该基因家族的生物学功能和培育耐旱品种提供理论依据。     

青岛市不同生态功能区表层土壤重金属污染初步评价

本文分析研究了青岛市工业区、商业区、居民区、农业区、旅游区表层土壤中重金属Cd、Cr、Cu、Ni、Pb、Zn的含量,采用Mul1er地积指数法对其污染状况进行评价,结果表明：Cd在各功能区含量均高于国家土壤环境环境质量二级标准,其浓度大小顺序为：工业区(0.807mg/kg)>商业区(0.748 mg/kg)>居民区(0.642 mg/kg) >农业区(0.532 mg/kg) >旅游区(0.356 mg/kg),Cr、Cu、Ni、Pb、Zn浓度均低于国家二级标准;按Mul1er地积指数法评价,Cd和Ni在五个功能区表层土壤的地累积指数为1,均属于轻度-中等污染,Cr、Cu、Pb 在不同功能区污染水平略有不同,Zn在五个功能区地累积指数为0,为无污染。由此可知,青岛市表层土壤均受到Cd和Ni污染,未受Zn污染。     

水稻早衰突变体esl5的鉴定及其基因精细定位

叶片早衰直接影响作物产量和品质, 鉴定早衰突变体、图位克隆调控基因对于研究植物衰老机理具有重要的意义。以甲基磺酸乙酯诱变水稻籼型恢复系缙恢10号, 获得一个早衰突变体esl5 (early senescent leaf mutant 5), 本文对其进行了形态鉴定、细胞学观察、理化分析和基因定位等研究。结果表明, 与野生型相比, esl5的苗期叶片正常, 分蘖期呈黄绿色, 孕穗期开始叶片中上部逐渐黄化衰老; 衰老部位的细胞结构异常, 细胞膜降解, 叶绿体基质片层疏松、排列不规则, 光合色素含量和光合速率极显著下降。此外, esl5的·OH和H₂O₂含量极显著升高, SOD和CAT的活性则极显著降低。与野生型相比, esl5的生育期延长了20 d左右, 千粒重显著增加, 穗粒数、实粒数和结实率则显著降低。esl5受1对隐性核基因调控, 精细定位在第3染色体Indel标记Indel03-1和Indel03-2之间83.4 kb的物理范围内, 包含11个注释基因, 这为ESL5的克隆和功能研究奠定了基础, 也有利于水稻品种的遗传改良。     

菠萝AcMYB44基因的克隆及植物表达载体构建

为研究R2R3-MYB转录因子家族成员AcMYB44基因在菠萝非生物胁迫过程作用机制,利用PCR技术从菠萝品种‘手撕菠萝’叶片中克隆AcMYB44并利用生物信息学对其结构及功能进行分析。结果表明,克隆获得的AcMYB44基因cDNA序列全长1 048 bp,开放阅读框(ORF)为771 bp,编码256个氨基酸。AcMYB44编码一个无信号肽、无跨膜结构且定位于细胞核的不稳定亲水蛋白,存在两个SANT保守结构域,属于R2R3-MYB家族。系统进化分析表明,AcMYB44与AtMYB44、AtMYB70、AtMYB73、AtMYB77、GmMYB73、MsMYB44、CeMYB44、DcMYB44亲缘关系较近且聚类为S22亚族。模式植物中研究表明S22亚族成员与抗逆相关。利用同源重组的方法构建了绿色荧光蛋白融合表达载体pGREEN-AcMYB44-ORF-GFP。以上结果为深入研究AcMYB44基因在菠萝中的功能奠定基础。