水稻粒形基因GW8 的功能标记开发和单体型鉴定

水稻粒形性状包含粒长、粒宽、粒厚和长宽比, 是一类影响水稻产量和品质的重要性状。基于基因GW8序列分析, 在该基因启动子区10 bp的Indel和第3外显子A/C和T/G的2个变异位点分别开发了功能标记, 并将其用于294份水稻微核心种质和2007-2013年江苏省审定的65份粳稻品种的基因型鉴定。研究结果表明这3个变异位点的等位变异对主要的粒形性状有着显著或极显著的影响; 其在水稻微核心种质存在的8种单体型对水稻粒形性状有着极显著的影响, 其中分别有126、85和58个代表品种的Hap3、Hap6和Hap1是最主要的单体型, 单体型Hap7对应水稻籽粒的粒长最长、长宽比最大、千粒重最大; 而江苏省审定的粳稻品种中仅发现分别有63个和2个代表品种的单体型是Hap6和Hap2。这些研究结果为水稻产量和品质育种中充分利用基因GW8的优异等位基因或单体型奠定了基础。     

水稻垩白基因Chalk5功能标记的开发与应用

水稻垩白是衡量水稻外观品质优劣的重要指标之一,降低稻米的垩白是培育优质水稻品种的前提。Chalk5是一个能显著降低稻米垩白从而提高稻米外观品质的主效基因。为提高垩白基因Chalk5在育种中的选择效率,在前人克隆的基础上,根据其启动子区域存在的2个功能突变位点,分别设计等位基因特异PCR(ARMS-PCR)引物,最终筛选出2对Chalk5基因的功能标记Chalk12、NChalk12和Chalk22、NChalk22,通过PCR产物测序的方法对这2对标记的检查结果进行了验证,说明Chalk12、NChalk12和Chalk22、NChalk22可以准确鉴定出Chalk5的不同基因型。利用该标记对不同来源的43份籼稻资源、江苏2007-2013年审定的65份粳稻品种和太湖流域179份粳稻地方资源进行了Chalk5基因型检测,筛选到携带chalk5低垩白率等位基因的籼稻资源20份,太湖流域粳稻地方资源仅8份,其余259份粳型资源中均不携带chalk5低垩白率等位基因,这也说明chalk5主要分布在籼型水稻资源中,在粳型资源中分布很少。     

鉴别水稻品种所需的多重PCR引物组的开发

为了鉴别覆盖日本水稻种植面积大约99％的130个水稻品种（其中12个是适合酿酒的品种），本研究开发出了4组多重PCR引物。确定了区分每个样本的基因排列，并设计了15组STS（序列标记位点）引物。将这些每一个引物组用来对这130个品种进行PCR分析，以便检测到对每个品种很适合的区分显带。     

水稻稻瘟病抗性基因Bsr-d1功能标记的开发和利用

稻瘟病是危害水稻最严重的病害之一, 选育抗病品种是防治该病害最有效的方法。Bsr-d1是对稻瘟病菌具有广谱抗性的一个重要基因。为提高Bsr-d1基因在育种中的选择效率, 根据Bsr-d1与其感病等位基因bsr-d1在功能区域存在的单核苷酸差异, 设计和筛选出Bsr-d1基因不同类型的基因功能标记CAPs5-1和3Bsr-d1/3bsr-d1, 结合测序分析验证, 可准确鉴定出Bsr-d1的不同基因型。利用3Bsr-d1/3bsr-d1对34份籼稻品种、江苏历年来主要推广的110份粳稻品种、其他省份的13份粳稻品种、148份太湖流域地方粳稻资源和19份太湖流域地方籼稻资源进行了Bsr-d1基因型检测, 筛选到携带Bsr-d1基因的籼型资源11份, 271份粳型资源中均不携带Bsr-d1基因, 这也说明Bsr-d1主要分布在籼型水稻资源中, 在粳型资源中几乎不存在。本研究为Bsr-d1基因的育种利用和分子标记辅助选择奠定了基础。     

基于SSR分子标记的玉米多重PCR扩增体系的建立

本实验以10个入选组多重的引物作为研究对象,探讨了适用于玉米DNA指纹库构建的多重PCR复合扩增体系的建立,分析了影响多重PCR组合建立的主要因素,包括引物扩增片段范围,引物间的相互作用,引物间主带与非特异带的相互影响,并提出了构建多重PCR扩增体系应该遵循的重要原则.     

强筋小麦分子标记多重PCR体系的构建与应用

面筋强度与小麦高低分子量谷蛋白亚基种类(组合)密切相关。以12个已知亚基基因组成的品种为对照,选用基因(位点)Axnull、Bx7^OE、Dx5、Glu-A3d、Glu-B3i和Glu-B3的标记,构建多重PCR体系。以该体系检测对照的结果与已知基因型完全一致,一次PCR可同时间接检测7个与强筋有关基因(位点)Ax1/Ax2^*、Bx7^OE、Dx5、Glu-A3d、Glu-B3i和Glu-B3。对62个陕西小麦品种的检测结果表明,优质强筋亚基基因(位点)Ax1/Ax2^*、Dx5、Glu-A3d、Glu-B3i和Glu-B3的比例依次为56.5%、9.6%、33.9%、1.6%和64.4%,所有品种均不含Bx7^OE,携带0、1、2和3个及以上基因(位点)的品种分别占6.5%、33.9%、48.3%和11.3%。说明聚合多个强筋亚基基因(位点)的品种频率较低,通过优质亚基基因的聚合育种,可望改善陕西小麦品种的面筋品质。本研究所构建的强筋小麦分子标记检测的多重PCR体系检测结果稳定且可靠,可用于小麦种质资源的快速评价和强筋小麦分子辅助选育。     

玉米InDel分子标记20重PCR检测体系的建立

为构建玉米多重PCR检测体系,提高分子标记检测效率,利用10份代表性玉米材料对238对InDel引物进行单重PCR评估,共得到192对扩增效率高、稳定性好的引物。根据软件评估结果、扩增质量、产物范围、染色体均匀分布原则从192对引物中优选出30对综合表现较好的引物形成扩增产物范围在80~200 bp和200~400 bp的两组核心引物组合,每套组合中有10对引物分布在不同染色体上。在核心引物组合的基础上综合考虑染色体分布、碱基片段范围、引物荧光颜色,逐一添加引物,最终形成两组玉米20重PCR体系,一组40重荧光标记毛细管电泳。     

小麦品质性状分子标记多重PCR体系的建立

小麦高分子量谷蛋白亚基组成、1B/1R易位、籽粒硬度、直链淀粉含量和穗发芽抗性等性状与加工品质密切相关，建立相关性状的多重PCR体系在小麦品质分子育种中具有重要意义。本研究利用现有品质性状基因的分子标记，建立了适合不同品质类型品种评价和分子聚合育种的3个多重PCR体系，并用已知基因的品种（系）进行验证。多重PCR体系Ⅰ包括ω-secalin（1B/1R）、Vp1B3和Pinb-D1b基因的分子标记检测，可用于一般的品质检测；体系Ⅱ包括ω-secalin、Ax2*、Bx17和Dx5 基因的检测，可望用于强筋小麦品种的选育；体系Ⅲ包括Wx-A1、Wx-B1和Wx-D1位点的检测，可用于淀粉品质或糯小麦的选育。每个体系内的引物之间不存在相互抑制作用和错配，检测品种（系）的结果可靠、重复性好，成本低。3个多重PCR体系用于小麦品质育种的亲本评价和杂交后代优质基因的聚合，将会提高优质专用小麦品种评价和选育的效率。     

玉米SSR分子标记的荧光多重PCR体系的构建及优化

以10对SSR玉米核心荧光引物为研究对象,探讨了多重PCR组合的建立,通过对两重PCR组合的优化,找到了适于两重、三重及四重PCR优化的方法;通过正交设计,快速找到了适于六重PCR的扩增体系,并且应用六重PCR体系成功构建了1个七重PCR。     

小麦优质谷蛋白亚基分子标记多重PCR体系的建立与应用

Ax1/Ax2*、Dx5和过量表达的Bx7亚基(Bx7^OE)被认为是对小麦品质有正向效应的优质亚基。根据以上亚基特异性分子标记建立相应的多重PCR体系,经品种和群体检验,证明利用该体系鉴定亚基的结果稳定可靠、成本较低。利用该多重PCR技术对89份西藏小麦育成和推广品种(系)的优质亚基频率进行鉴定,结果表明, Dx5和Ax1/Ax2*亚基的频率均为12.4%,没有检测到Bx7^OE,同时携带两个优质亚基的材料频率为10.1%,该麦区品质育种必须加强优质亚基的引入。针对优质亚基Ax1/Ax2*、Dx5和Bx7^OE的多重PCR体系,为小麦品质育种亲本评价和通过杂交方法聚合优质亚基基因提供了一种实用可靠的标记辅助选择技术。     

水稻非对称混合样品中非优势DNA模板SSR标记的PCR检测

利用DNA混合池筛选分子标记可以大大提高检测效率,来自不同亲本的模板DNA的浓度一旦相差悬殊,可能影响PCR扩增结果。本文对不同稀释浓度和混合比例的模板DNA进行SSR标记的PCR扩增。结果表明,单一模板不同稀释倍数的影响不明显,但不同模板DNA竞争造成非对称混合样中非优势模板扩增量的明显降低。对于扩增效果较好的SSR标记而言,模板浓度比为1 ：7时仍可检测到低浓度模板的扩增产物。     

滇1型水稻质核雄性不育恢复基因的PCR分子标记

用混合品集分析方法(Bulked Line Analysis简称BLA)，在保持系和测交父本中的DNA各取20个样等量混合，对PMRF、OSR-33、RM294、RG304、RG257五对引物进行筛选，结果发现PMRF和OSR-33俩对PCR引物在保持系和恢复系之间有遗传差异。用这俩对引物分别对40个保持系和60个测交父本DNA样品进行扩增。另外，用滇l型杂交粳稻的保持系40份和测交父本60份与不育系进行测交，杂种Fl花粉的育性经1％的I-KI染色。用扩增出的带型与F1花粉的育性进行相关分析，结果表明扩增出带型与花粉的育性呈显著正相关，两种带型对应的花粉可育率均值经t别验差异极显著。表明PMRF和OSR-33标记与滇l型细胞质雄性不育育性恢复基因连锁，由于PMRF和OSR-33PCR引物是设计在第10染色体长臂的中部，所以，滇l型细胞质雄性不育育性恢复的一个基因可初步定位于第10染色体长舒的中部。     

水稻Wx复等位基因基于PCR的功能标记开发与利用

直链淀粉含量是影响稻米食味品质的重要因素,主要由蜡质基因(Wx)调控,Wx基因座存在Wxa、Wxb、Wxin、Wxmw等多个复等位基因,通过分子标记辅助选择(marker-assisted selection,MAS)培育中低直链淀粉含量的水稻品种是提高稻米适口性的重要途径。Wx复等位基因的功能由单碱基核苷酸多态性(single nucleotide polymorphisms,SNP)决定,其检测依赖于测序或酶切,存在耗时多、费用昂贵等缺点。为提高选择效率,本文利用Wx复等位基因的SNP差异和四引物扩增受阻突变(tetra-primer ARMS-PCR)原理,进行PCR功能标记的开发。引物设计过程中,针对扩增效率低和非匹配的延伸2个技术难题,提出了调整错配位点的解决方案,成功开发了基于PCR技术的两对功能性标记Waxygt-ARMS2和Waxyac-ARMS2,可以准确区分上述复等位基因型,且具有操作简单、耗费较低的特点。利用新开发标记对辽宁省育成的部分水稻品种进行Wx基因型检测的结果表明,40份辽宁育成品种均携带Wxb基因,遗传基础单一。上述结果为利用Wx基因位点的分子标记培育中低直链淀粉含量的水稻品种,改良辽宁省水稻品种的食味品质提供了技术支撑。     

水稻氮高效、耐冷基因OsGRF4功能标记的开发及其利用

通过分子标记辅助选择(molecular marker-assisted selection,MAS)培育氮高效水稻品种是减少氮肥使用量、发展绿色农业和可持续农业的一个重要途经。水稻OsGRF4基因编码生长调节因子蛋白,编码区第487和488碱基由TC变异为AA,导致丝氨酸突变为赖氨酸,使得水稻具有氮高效利用、高产和耐冷的特性。为了提高OsGRF4基因在育种中的选择效率,本研究根据功能SNP(single nucleotide polymorphism)位点设计和筛选出等位基因特异PCR(polymerase chain reaction)功能标记PF+DMR+PR和PF+XMR+PR。利用此功能标记对不同品种(品系)和川大粒/巨穗稻的F2群体进行基因型检测,结合测序分析验证,能准确快速鉴定OsGRF4的纯合显性、纯合隐性和杂合基因型,且具有操作简单、成本低的特点。本研究开发的功能标记为通过MAS方法利用OsGRF4基因培育氮高效、高产和耐冷水稻新品种提供了技术支撑。     

水稻广亲和基因S5-n的功能标记开发及其应用

广亲和基因S5-n是能够恢复籼、粳杂种育性的基因,利用常规育种方法回交转育广亲和基因需要通过配组杂种F₁,根据F₁的育性判断和选择S5-n,选育周期长,方法繁琐。因此,在广亲和遗传改良和聚合育种中需要寻找一种快速、简便的广亲和基因检测方法。本研究根据水稻广亲和基因和籼粳S-5等位基因序列存在136 bp缺失的特征,设计了InDel标记S5136。前人研究已经明确02428、Dualr、CPSLO17具有S5-n,分子标记S5136 PCR扩增这3个材料的带型为缺失带型,而不携带广亲和基因S5-n的材料的带型为非缺失带型。利用该标记对3037与02428的F₂群体分析表明,该标记能准确区分S5-n、S5-i纯合及杂合基因型,标记基因型符合1∶2∶1比例,没有发生偏分离现象。利用该标记从554份水稻品种资源(O. sativa L.)和27份普通野生稻(O. rufipogen Griff.)以及24份江淮流域杂草稻资源中筛选出具有缺失带型的资源材料13份,并对其PCR产物测序证实为S5-n,对Kasalath的广亲和性进行了初步验证;从20份02428的高世代育种材料中,筛选到携带广亲和基因S5-n的恢复系2份。该标记可以用于S5-n基因资源筛选、分子标记辅助选择育种和培矮64S为母本的杂交种种子纯度鉴定。     

水稻抗稻瘟病基因Pi-ta和Pi-b多重PCR体系的构建与应用

稻瘟病是我国水稻主产区的重要病害之一, 其主效抗性基因Pi-ta和Pi-b在我国很多稻区表现广谱持久的稻瘟病抗性, 被广泛应用于我国的水稻育种和生产。本研究选用稻瘟病抗性基因Pi-ta和Pi-b及其等位基因的功能标记, 在对22份分别已知抗病基因Pi-ta和Pi-b以及感病基因pi-ta与pi-b组成的水稻品种检测验证基础上, 建立了2套稻瘟病基因多重PCR体系: 体系I同时检测抗病基因Pi-ta与Pi-b, 体系II 同时检测感病基因pi-ta与pi-b, 并利用2套体系对336份高世代育种材料进行检测, 与单标记检测结果比较, 表现稳定可靠, 重复性好。本研究构建的抗稻瘟病基因分子标记多重PCR体系可用于水稻种质资源的快速评价和抗稻瘟病分子标记辅助育种。     

水稻香米基因标记的开发与应用

稻米的香味是稻米食味品质的重要指标,而香味是受隐性核基因控制,杂合基因型不表现出香味,因此在香米育种中需要寻找一种快速、简便、准确的香味基因检测方法。本实验分别设计了水稻香米基因fgr的2个等位基因的基因标记（InDel-E2、InDel-E7）,利用这两个标记对20个香米和2个非香稻品种（品系）,以及2个香米／非香米组合的F1进行快速检测。结果显示,InDel—E2能检测到11个香米品种（品系）,InDel-E7可检测其余9个香米品种（品系）,且2个标记都能检测杂合基因型,说明本研究中的20个香米品种（品系）受2个香米基因控制。供试材料的分子检测结果与香米的基因型完全相符,因此本研究开发的2对标记可应用于香米育种的基因标记辅助选择和新香米基因的筛选。