利用番茄果实特异启动子E8改造‘外源基因清除’的表达载体及转化金柑研究

利用"外源基因清除"技术(‘Gene-Deletor’),将外源基因从转基因金柑果实中彻底清除,可以达到用转基因作物生产出非转基因食品的目的。本研究利用引物pE8F和pE8R从樱桃番茄中克隆果实特异启动子E8,通过SalⅠ和SmaⅠ双酶切置换掉"外源基因清除"载体(pCambia-LF-polseed-FLP,简称Y-A)中的花粉、种子特异启动子PAB5,重新构造"外源基因清除"载体Y-A-E8,利用农杆菌EHA105介导转化实生态金柑,获得转化植株,并通过nptⅡ基因特异引物nptⅡ-F和nptⅡ-R PCR检测阳性转化植株。载体Y-A-E8 SalⅠ和SmaⅠ双酶切结果表明,E8启动子成功替换启动子PAB5,Y-A-E8经EHA105介导转化成功获得11株转化植株且PCR检测到6株为Y-A-E8转基因植株。研究结果可为"外源基因清除"技术在转基因金柑方面的应用提供参考。     

农杆菌介导的hIL-12基因转化马铃薯的研究

构建CaMv35S启动子驱动人白细胞介素12基因(hIL-12)的植物表达载体pBI121-hIL-12,通过三亲杂交法将重组载体导入根癌农杆菌菌株EHA105,农杆菌介导法转化马铃薯茎段,经卡那霉素抗性筛选,获得28株抗性植株。通过PCR检测,22株为阳性,从PCR阳性植株中随机选取5株,ELISA法检测茎和叶中hIL-12的表达量,其中2株与对照组相比有显著性差异(p<0.001),hIL-12的表达量分别为(3 714.0±48.8)pg/g和(3 465.0±185.0)pg/g,初步表明外源基因hIL-12已经整合进马铃薯基因组中并得到了表达,为进一步研究重组hIL-12的分离纯化和生物学活性奠定了试验基础。     

转金属硫蛋白基因(MT1)烟草抗Cd2+胁迫的生理特性分析

将柽柳(Tamarixsp.)金属硫蛋白基因(MT1,GenBank登录号:AB298390)插入植物表达载体pBI121,取代花椰菜病毒35S启动子下游的gus基因,利用农杆菌(Agrobactrium tumefaciens)介导法将MT1导入烟草(Nicotiana tobacum)基因组。对具有卡那霉素抗性,且经PCR-Southern检测和Northern杂交表现阳性的转基因株系进行抗Cd2 分析表明,金属硫蛋白基因的过量表达提高了转基因植株的抗Cd2 能力,在含200μmol L-1和400μmol L-1Cd2 的MS培养基上,转基因植株的株高和鲜重均明显优于非转基因株系;在生理性状上表现为转基因植株MDA含量及POD活性明显低于非转基因株系,叶绿素含量和SOD活性比非转基因株系明显增加。     

苏云金芽孢杆菌cry1基因的克隆、植物表达载体的构建及转化大豆

此研究利用醋酸钠-抗生素加热法从土壤中分离获得1株产晶体的苏云金芽孢杆菌菌株（Bacillus thuringiensis）。通过已知cry1基因设计引物,以分离得到的菌株DNA为模板进行PCR扩增,将克隆到的目的片段进行测序。测序结果表明：该序列与cry1基因同源性达到90%~99%。将该基因连接到植物双元表达载体pBI121中,构建了该基因的植物表达载体,并将阳性重组质粒转化根癌农杆菌EHA105,利用农杆菌侵染子叶节的方法进行大豆的转化。通过初步的PCR验证,成功获得了转基因植株,建立了大豆的转化体系。     

利用农杆菌介导法将查尔酮合酶基因导入大岩桐

本项研究通过植物基因工程技术,以改变花色为目的,对花卉进行遗传改良,以期产生新的花色品种,来改变现有花卉花色单一、品种缺乏的现状,丰富我市花卉品种资源。在应用转基因技术进行定向改良花色的研究中用的最多也最成功的基因就是:查尔酮合酶基因。查尔酮合酶(Chalconesynthase,CHS)是花色素合成途径中的一个关键酶,它在植物中表达的量可能影响花的颜色。本项目以查尔酮合酶(Chalconesyn-thase,CHS)基因作为目的基因,以大岩桐为研究对象。具体从矮牵牛(Petuniahybrida)特定发育阶段的花瓣的cDNA中,克隆到查尔酮合酶基因CHSA,进行质粒的重组后,插入到含有花椰菜花叶病毒CaMV35S启动子的植物中间表达载体中pBI121中,转化农杆菌LBA4404。通过农杆菌介导法(之叶盘法)遗传转化大岩桐,具体过程如下:农杆菌LBA4404pBI121chsA的培养→农杆菌与大岩桐叶盘共培养→脱菌筛选→抗性芽的扩繁与继代培养→抗性株的生根筛选→移栽成活。经过研究,成功地得到大岩桐转化植株,其中8个株系的转基因植株经PCR检测呈阳性,证明外源基因已整合进入受体植物。有一株玫红品系植株的花瓣上出现了白色的不规则斑点。     

水稻OsAPX1基因在烟草中的表达及其抗盐性研究

本研究采用RT-PCR方法克隆得到水稻细胞质抗坏血酸过氧化物酶(OsAPX1)基因全长cDNA(基因登录号:D45423);将该基因构建二元植物表达载体pBI121-OsAPX1;用农杆菌EHA105侵染介导烟草叶盘转化法转基因,获得转基因植株,PCR鉴定遗传转化的烟草植株成功地整合了水稻OsAPX1基因;Northern blot鉴定结果表明转基因T1代植株Ta在mRNA转录水平上表达;对Ta株系进行Kana抗性鉴定,表明转基因T2代株系有抗性;对T2代株系做NaCl、NaHCO3、Na2CO3抗盐性鉴定,结果表明与对照相比表现出转基因植株抗(耐)性提高;取T2代植株的叶片在不同浓度H2O2处理下,抗H2O2毒害的能力显著强于对照,转基因植物的抗性有所提高,有望在抗盐碱性育种上应用.     

草莓乙烯受体FaEtr2基因的克隆及其反义表达载体的构建

为了构建草莓乙烯受体FaEtr2基因的反义表达载体,在已报道的FaEtr2基因序列的基础上,设计特异引物,克隆草莓乙烯受体FaEtr2基因部分特异序列,将该片段反向插入植物表达载体pBI121的CaMV 35S启动子和NOS终止子之间,构建了反义表达载体pBI121Etr2。通过双酶切鉴定后,导入农杆菌EHA105中,酶切和PCR鉴定表明质粒已导入到农杆菌中。本研究为后期该反义基因转化草莓品种以改良草莓果实耐贮运性打下基础。     

南瓜韧皮部特异性启动子在转基因棉花中的表达

以自行构建的重组南瓜韧皮部特异启动子dENP构建了植物表达载体pBII2.利用根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)LBA44O4介导转化棉花(Gossypium hirsutum L.)品种珂字312,共获得转pBII2和对照pBI121的抗卡那霉素棉花再生植株243株,筛选出172株为转基因阳性植株.Southern blot分析确证外源Gus基因插入拷贝数在1个或2个以上.对这些转基因棉花植株进行Gus染色结果表明dENP和CaMV35S启动子一样均能驱动Gus基因的表达,前者仅在棉花的韧皮部内特异表达,而CaMV35S启动子驱动的Gus基因为组成性表达.Gus酶活力测定结果进一步表明dENP和CaMV35S启动子驱动Gus基因表达水平相当,但是转pBII2棉花植株的Gus富集在韧皮部组织.证明了dENP启动子驱动的外源基因在棉花中具有韧皮部特异而高效表达的特征,从而可用于棉花抗病、抗蚜虫转基因研究.     

根癌农杆菌介导的橡胶树花药愈伤组织遗传转化体系的建立

为建立根癌农杆菌介导的橡胶树遗传转化体系,以花药愈伤组织为受体,研究了农杆菌菌株、共培养温度、共培养时间、乙酰丁香酮(AS)等因素对遗传转化效率的影响。结果表明,农杆菌菌株、共培养温度和共培养时间对转化效率具有显著影响,AS不影响转化效率。2.2万个花药愈伤组织经EHA105菌株侵染后,转入未添加AS的培养基,22℃共培养6d,通过50mgL-1卡那霉素抗性筛选、叶片GUS染色、uidA和NptII基因PCR特异扩增、PCR产物测序及NptII基因Southern检测,鉴定出11株转基因植株,并通过嫁接和次生体胚发生,获得来自8个转基因株系的681株转基因植株,移栽成活253株。     

水稻质膜H+-ATPase基因对拟南芥遗传转化及其抗盐性分析

RT-PCR扩增得水稻质膜H -ATPase全长cDNA(PM-H -ATPase),构建了植物表达载体获得质粒pBI121-PM-H -ATPase,农杆菌介导、真空渗入法转化PM-H -ATPase基因入拟南芥,得35株T1代卡那抗性植株.抗性植株PCR分析表明,抗性植株整合了目的基因.Northern杂交分析进一步表明T3代转基因拟南芥表达了目的基因.抗盐(NaHCO3和NaC1)性分析表明:转基因植株的耐盐能力明显高于野生型;盐碱胁迫下转基因植株开花优先于野生型植株.     

甘蔗抗旱性及抗旱育种研究进展

甘蔗(Saccharum officinarum)是主要的糖料作物,具有重大的经济价值。世界各国在甘蔗种植面积相对稳定的情况下,通过遗传改良来选育和推广优良甘蔗新品种是保持甘蔗生产可持续发展的重要科技手段。甘蔗生产面临许多制约因素,干旱是影响甘蔗生产的主要非生物胁迫之一,对甘蔗的生长发育有重大影响,选育高产高糖抗旱新品种是甘蔗育种的主要目标之一。甘蔗抗旱性是由多种机理共同起作用的复杂过程,为了更好地了解甘蔗抗旱机制和抗旱育种进展,本研究主要从甘蔗的形态特征(叶片和根系的形态结构特征)、生理生化指标(质膜透性,渗透调节,抗氧化酶活性)、甘蔗抗旱相关基因、甘蔗抗旱相关蛋白以及抗旱种质资源鉴定评价等方面对甘蔗抗旱生理基础及其分子机制研究进展进行概述,以及对甘蔗传统抗旱育种和现代分子抗旱育种(转基因育种, DNA甲基化育种)进行概述,以期为中国甘蔗抗旱研究与抗旱遗传育种提供一些思路。     

广西荔枝精细化农业气候区划与应用研究

摘要：本文在研究广西荔枝生产现状和生态适宜性基础上,密切结合广西荔枝生产实际,筛选出广西荔枝精细化农业气候区划指标,运用广西90个气象站点1971-2000年的气候资料和台站地理信息,1：25 万地形数据, 建立了区划指标的空间分析模,按1 km ×1 km细网格对区划指标进行了小网格推算,采用GIS技术和打分法,在精细化农业气候区划系统平台上,将广西荔枝进行了精细化农业气候区划,分为最适宜区、适宜区、次适宜区和不适宜区四大区域,在此基础上,对照广西荔枝生产现状,进行了农业生产上科学布局与生产结构调整的对策措施研究,旨在为农业生产提供科学依据。     

花生DNA的五种改良CTAB提取方法的比较分析及其应用

花生是世界上重要的油料作物和经济作物之一,也是最重要的植物食用油来源之一,但花生分子标记和功能基因组学等分子生物学研究较落后。因此,本研究旨在建立适合自身的花生基因组DNA的提取方法,为开展花生分子标记研究和分子生物学研究提供帮助。本研究使用了5种改良CTAB法提取花生基因组DNA,所得DNA的纯度和浓度分别通过琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计检测,再利用8种分子标记技术的48条单引物和4对转座子保守区扩增引物对提取获得的花生基因组DNA的质量进行扩增验证和应用。结果表明:(1)综合花生基因组DNA的质量检测数据以及花生分子标记技术和转座子保守区的扩增验证结果来看,五种改良CTAB法的DNA提取效果表现依次为:方法一>方法五>方法四>方法三>方法二,其中方法一为最佳首选,方法五和方法四的提取效果也好,但是由于其有利用到强腐蚀性的平衡酚,不安全且不环保,所以不推荐;(2)在花生上建立了8种分子标记技术和4类转座子保守区的扩增体系;(3)克隆获得了花生4类转座子保守区序列。本研究为今后开展花生分子标记研究及转座子的克隆鉴定利用提供了帮助。     

基于SSR标记的冬瓜种质资源遗传多样性分析

为了加强冬瓜种质资源的保护和评价,明确资源间的亲缘关系,本研究利用SSR标记在分子水平上对111份冬瓜种质资源进行遗传多样性分析。结果表明,19对SSR引物共扩增出182条条带,其中多态性条带169条,多态率92.86%;通过POPGENE 1.31软件计算每对引物的平均有效等位基因数(Ne)为1.393 2,平均Nei's遗传多样性指数(He)为0.260 1,平均Shannon's信息指数(I)为0.418 7。采用Jaccard相似系数进行种质间的聚类分析,在遗传距离为0.70的位置可将全部种质分为6个类群。通过聚类结果可知,种质材料未按照地理来源划分,但相同果型、籽型的种质资源间亲缘关系较近。本研究基于SSR标记分析冬瓜种质资源遗传多样性并进行亲缘关系的聚类,将为冬瓜种质的保存和利用提供理论依据。     

栽培肾茶遗传多样性的SRAP标记分析

应用SRAP分子标记技术对云南、广西、福建、海南等地收集的16个栽培肾茶种质进行遗传多样性分析。15对引物经PCR扩增后共检测到124个条带,其中多态性条带80个,多态性条带百分率(PPL)为66.7%;肾茶种质间的观测等位基因数(Na)为1.669 4、有效等位基因数(Ne)为1.434 0,Nei’s基因多样性指数(H)为0.252 9,Shannon信息指数(I)为0.374 7,遗传相似度介于0.566 9到0.991 7之间,说明肾茶的遗传多样性水平较低。UPGMA聚类结果将肾茶种质分为2类,与根据花冠颜色对肾茶类型进行划分的结果对应,而遗传特性与地理分布没有明显相关性。实验结果可为肾茶遗传研究、品种选育与资源保护提供科学依据。     

云南草果SSR-PCR反应体系的优化及引物的筛选

草果为药食两用的草本植物,近年来在市场上供不应求,但关于草果居群的分子鉴定及种质资源的研究极为稀少。为使云南草果产业更加健康和可持续的发展,本实验对云南草果进行了SSR-PCR反应体系的优化及引物的筛选,为研究草果遗传多样性提供了依据。实验采用L16(43)正交试验设计,对PCR反应体系中的3个因素(2×Taq PCR Starmix,引物, DNA模板)进行优化,并利用单因素分析法,对PCR退火温度、PCR扩增产物点样量进行实验与分析。最终确定5个因素的最佳水平,即DNA模板(50 ng/μL) 2μL,2×Taq PCR StartMix 6μL,正反引物(10μmol/L)各1.5μL,dd H2O补足至20μL (即加入ddH2O 9μL),PCR产物点样量可以选择在1.5～2μL之间。从48对SSR引物中筛选出了7对扩增结果好的引物。7个SSR引物可用于草果资源的遗传多样性研究,为分子技术研究提供了科学依据。     

异地种植对微胚乳玉米主要性状的影响研究

在广西南宁、山西平遥两个地点分别种植16个微胚乳玉米杂交组合,观测了主要农艺性状和产量性状,同时估算了这些重要性状的广义遗传率。结果如下:(1)抽雄期、散粉期、吐丝期、株高和穗位高5个性状,在山西平遥所有组合的值都高于广西南宁;穗长、穗粒重和百粒重3个性状则是山西平遥所有组合的值都低于广西南宁;穗粗则随组合而异。(2)两地各性状的广义遗传率相差较大的有抽雄期、散粉期、吐丝期、穗长和百粒重。一年多点联合方差分析广义遗传率比单一地点分析都高的有株高、穗粗、穗粒重和百粒重。     

主要禾谷类作物糯质基因Waxy的系统进化及表达分析

糯性是农作物的一项重要农艺性状。有效控制农作物糯性的高低有助于选育出糯性适当的高品质谷物。糯性主要受Waxy基因控制,主要由于Waxy的缺失而引起籽粒支链淀粉含量升高所致。Waxy基因具有较高的保守性,在主要农作物的自然选择及人工选择的过程中,Waxy表达水平不同的种质材料被固定下来,并用于农作物新品种选育。本研究基于当前关于糯质基因Waxy的研究现状,系统分析了糯质玉米、不同倍型小麦中Waxy基因的拷贝数、变异特征及系统进化关系,期望进一步获得Waxy基因在农作物遗传改良中稳定糯性的调控机制。本研究也对如何利用基因编辑技术改良农作物的糯性进行了探讨。     

SYBR GreenⅡ黄芩18S rRNA基因实时荧光定量PCR方法的建立

利用SYBR GreenⅡ染料法,建立黄芩实时荧光定量PCR的反应体系。根据18S rRNA基因序列保守性,在18S rRNA基因保守区设计一对特异性引物,以常规PCR产物为标准品,浓度梯度稀释后制定标准曲线,对溶解曲线进行分析,对PCR退火温度,引物浓度,模板浓度等反应条件进行优化。结果表明:在20μL反应体系中,加入10μL SYBR Premix Ex Taq TM时,引物和cDNA最佳加入量分别为0.8μL和1.0μL;最佳反应程序:进行40次循环,95℃预变性30 s,95℃变性5 s,55℃退火30 s,72℃延伸30 s。标准曲线Ct的检测范围在14～29,扩增效率为97.8%;溶解曲线显示为单峰,其Tm为(85±1.0)℃。本研究建立的黄芩18S rRNA基因实时荧光定量PCR法,具有检测范围广,扩增效率高,特异性高等优点,对从分子水平阐明黄芩药效成分合成机制,筛选高产优质的黄芩种质资源具有重要的意义。     

文山州滴灌条件下减施氮肥用量对烤烟生长发育及产质量的影响

通过2年田间试验,研究了滴灌条件下不同施氮量对烤烟生长发育、经济性状、外观质量、内在品质及感官质量的影响。结果表明,滴灌条件下减施氮肥能够促进烤烟生长,提高中部叶烤烟还原糖、总糖、糖碱比和钾含量。降低总氮含量、总植物碱含量,协调中部叶内在化学成分,增加烤烟产值及产量,改善了烟叶的感官质量。2015、2016年度内在化学成分及感官质量均以采用滴灌施用纯氮60 kg/hm2处理最佳。在滴灌条件下,施用纯氮60 kg/hm2是文山地区烤烟生长、品质及产值方面最佳的组合,达到了节水、节肥与最佳种烟收益双重目的。