利用共转化方法创制携带Pi9抗稻瘟病基因的无选择标记转基因水稻

水稻稻瘟病是由子囊菌(Magnaporthe oryzae)引起的水稻灾害性病害。培育抗病品种是防治稻瘟病最经济有效的措施之一。水稻Pi9抗稻瘟病基因来源于小粒野生稻并已被克隆和应用于转基因育种。为了提高无选择标记转基因植株的选择效率,将绿色荧光蛋白(GFP)用作可视遗传标记,对双菌株共转化系统进行改良:目的基因载体携带Pi9抗稻瘟病基因;标记基因载体用潮霉素磷酸转移酶(HPT)作为植物转化选择标记,用GFP作为负选择标记,筛除标记基因分离植株。两种载体的农杆菌转化株混合,分别与水稻品种‘浙恢414’、‘浙粳22’、‘浙11B’、‘日本晴’、‘空育131’和‘粤泰B’的愈伤组织共培养,然后从5%~38.3%的起始愈伤组织筛选获得了转化愈伤组织(HPT+GFP+)。对T0植株进行Pi9基因PCR检测,11.8%~77.8%的T0植株为共转化植株(HPT+GFP+Pi9+)。对共转化植株T1代进行绿色荧光检测,筛选阴性植株(GFP-),再通过PCR筛选Pi9+植株。根据13个T1群体的研究结果,61%的共转化植株在T1代分离出无选择标记转基因植株(HPT-GFP-Pi9+)。转Pi9的无选择标记植株和后代株系对水稻稻瘟病呈抗病反应。因此,本研究通过GFP标记提高了双菌株共转化系统的选择效率,转Pi9的无选择标记水稻株系为水稻抗稻瘟病育种提供了有用的遗传资源。     

广谱抗稻瘟病基因Pi9对籼稻的转化研究

通过农杆菌介导法，将由CaMv35s启动子启动的广谱抗稻瘟病基因Pi9转入5个籼稻品种（丰源B、湘晚籼13号、R996、527、1701）的愈伤组织中，所用质粒为pCAMBIA1301，pCAMBIA1301的T-DNA区含有潮霉素（hygmycin）抗性基因和β-葡萄糖苷酸酶（GUS）基因。以潮霉素作为筛选剂对籼稻愈伤组织进行筛选，结果表明，不同品种在转化过程中抗性愈伤率在73．9％～83．3％之间，获得的部分抗性苗经PCR检测为阳性，阳性植株的转化率差异显著，其转化率为5．7％～25．9％之间，对获得的抗性苗和T2代幼苗的根和叶进行GUS组织化学染色分析，有些抗性苗和T2代幼苗的根和叶呈蓝色反应，表明广谱抗稻瘟病基因Pi9基因己整合到水稻基因组并能正常表达。对T2代进行稻瘟病小种接种试验，结果显示了抗性分离。并且建立了一套较为有效的水稻遗传转化体系。     

水稻抗稻瘟病基因Pi2特异分子标记的开发与应用

稻瘟病是水稻最严重的病害之一,利用抗病基因选育抗病品种可以安全有效地防治稻瘟病.分子标记辅助选择(marker-assisted selection,MAS)技术可实现快速精准地定向培育含抗稻瘟病基因的抗性品种,但针对不同遗传背景育种材料开发设计特异性的分子标记是MAS育种的重要基础.广谱抗稻瘟病基因Pi2已被证明高抗...     

水稻耐盐性基因SKC1的KASP标记的开发与利用

籼稻品种‘Nona Bokra’中携带的SKC1^NB等位基因水稻耐盐性的主效QTL (Quantitative trait locus)位点。为了提高对水稻SKC1基因型鉴定效率,根据SKC1^NB基因中的功能性SNP位点开发了一个KASP分子标记SKC1^NB-KASP,利用该标记对‘Nona Bokra’与粳稻品种‘繁14’、‘花B’和‘武1B’的回交BC₃F₂群体进行SKC1等位基因的分型,发现在BC₃F₂群体受测的65个单株的DNA样品中,有16份样品的基因型与供体亲本‘Nona Bokra’相同,31份样品显示杂合基因型,18份样品与轮回亲本基因型相同。对这65份DNA样品的,SKC1基因进行测序以检验KASP标记基因分型结果的准确性,发现测序结果与KASP标记分型的结果完全一致。以上结果说明SKC1^NB-KASP标记可以高效、准确地鉴定,SKC1位点的基因型,大大提高了耐盐性水稻分子标记辅助选择育种的效率...     

Pi9基因分子标记辅助选择改良水稻不育系丰源A的稻瘟病抗性

为改良水稻不育系丰源A的稻瘟病抗性,以籼稻品系75-1-127作为广谱持久抗稻瘟病基因Pi9的供体亲本,先后以三系保持系丰源B和不育系丰源A为受体亲本,利用Pi9基因内共显性标记ClonDF_1R_1开展MAS连续回交育种。利用来自国内外不同稻区的33份稻瘟菌菌株进行温室内人工接种,分析丰源A、丰源B、75-1-127的抗菌谱,75-1-127的抗性频率为87.9%;而丰源A和丰源B的抗性频率均仅为33.3%。田间病圃抗性鉴定表明,75-1-127高抗苗瘟,而丰源B和丰源A高感苗瘟。结果表明,含有Pi9基因的75-1-127抗谱广、抗性水平高,在稻瘟病抗性育种中具有很大的应用前景;而丰源A和丰源B抗谱窄、抗性水平低,需要改良。根据Pi9基因序列信息开发了一个共显性分子标记ClonDF_1R_1,它从75-1-127基因组中扩增出一条320 bp的条带,而丰源B和丰源A基因组的扩增产物约450 bp。利用ClonDF_1R_1先后开展丰源B、丰源A稻瘟病抗性改良的MAS育种实践,获得了13个含Pi9纯合等位基因的改良抗病保持系丰源B-Pi9,以及11个含Pi9纯合等位基因的改良抗病不育系丰源A-Pi9。经过连续11 a的MAS回交育种实践,育成1个高抗稻瘟病、不育性稳定、柱头外露率高、农艺性状和产量性状优良的新三系不育系丰源A-Pi9-5,实现了丰源A和丰源B稻瘟病抗性的定向改良,为三系杂交水稻育种应用创制了新的亲本材料。     

分子标记选择水稻抗稻瘟病基因Pi40和Pib聚合体

培育多个抗病基因聚合的水稻品种是提高其抗病广谱性和持久性的有效途径之一。利用水稻抗稻瘟病基因Pi40、Pib的特异PCR标记,对含有Pi40、Pib的水稻品系复合杂交F250个植株进行检测,从中选择到Pi40、Pib双基因聚合的抗病植株28个,为持久、广谱抗病水稻育种奠定了基础。     

分子标记辅助选育聚合抗稻瘟病基因Pi5及Pita的水稻新品系

稻瘟病是对水稻生产具有严重威胁的真菌病害,选育并推广聚合多个抗稻瘟病基因的抗病品种是防控该病最为经济有效的途径.本研究以携带不同抗稻瘟病基因的'吉粳105'(Pita)和'T639'(Pi5)为亲本杂交衍生的后代群体为试材,利用分子标记辅助育种技术,筛选到3个聚合抗稻瘟病基因Pita.和Pi5的后代.并以其中一个株系'...     

利用分子标记辅助选择将抗稻瘟病基因Pi-9(t)渗入水稻恢复系泸恢17

本研究采用杂交和分子标记辅助选择技术,将亲本材料P2的水稻广谱高抗稻瘟病基因Pi-9(t)导入杂交水稻恢复系泸恢17,再利用抗稻瘟病基因Pi-9(t)的特异分子标记pB8检测该目的基因,获得68份携有Pi-9(t)基因型的回交株系。基因型鉴定表明株系WR1023、WR1043、WR1056和WR1062为均含有Pi-9(t)基因纯合的回交后代株系。表型分析表明WR1023和WR1056株系农业性状已稳定,且其株叶型、抗稻瘟病及配合力较好,我们认为可以用作育种抗性亲本材料。     

水稻抗稻瘟病基因Pi47的精细定位和候选基因分析

不断挖掘和克隆抗稻瘟病新基因, 是解析水稻抗病分子遗传机制和培育抗稻瘟病新品种的重要基础。Pi47是笔者从广谱、持久抗稻瘟病湖南地方品种湘资3150中鉴定的稻瘟病抗性基因, 前期研究将其初步定位于第11染色体标记RM224和RM5926间。本研究利用3个Pi47单基因系与感病亲本CO39杂交F₂群体1687个感病单株对Pi47精细定位, 利用6个STS标记对3个单基因系进行背景分析, 采用生物信息学方法进行了候选基因分析。结果表明, Pi47被精细定位于CAPS标记S32与K33间0.24 cM区域的171.2 kb物理区间内, 背景分析将Pi47进一步缩小至SC12和K33间67.8 kb的区间内; 该区间含有8个结构基因, 其中2个编码NBS-LRR抗病类似蛋白, 为Pi47的候选功能基因。稻瘟菌抗谱比较分析发现, Pi47单基因系与其定位区间内4个Pik位点的等位基因Pik、Pikm、Pikh和Pikp的近等基因系抗谱不同。这些结果为进一步克隆Pi47和利用其进行分子标记辅助选择培育抗稻瘟病水稻新品种奠定了基础。     

利用分子标记辅助选择聚合Pi9(t)和Xa23基因

利用分子标记辅助选择将广谱高抗稻瘟病的Pi9(t)基因和全生育期高抗白叶枯病的Xa23基因聚合到同一优良株系中,获得了含双基因的优良株系L10～L13.用来自不同地区的20个稻瘟病小种和中国流行的7个白叶枯病小种及安徽白叶枯病小种对聚合株系进行接菌鉴定,结果显示:聚合Pi9(t)和Xa23基因的株系L10～L13同时抗稻瘟病和白叶枯病;与稻瘟病的供体亲本75-1-127相比,抗性水平相当,均达抗级(R)水平,且抗谱相同;与白叶枯病的供体CBB23相比,对白叶枯病的抗性时期一致,均表现为全生育期抗性,而且抗性水平和抗谱相似.通过田间农艺性状的筛选,获得的双基因聚合系具有较好的农艺性状,可直接应用于生产或作为抗性亲本.     

利用与抗稻瘟病基因Pi1连锁的MRG4766标记鉴定173份云南地方稻种

稻瘟病是世界上危害最严重的水稻病害之一,鉴定与发掘抗稻瘟病种质资源是抗稻瘟病育种的重要基础工作。本研究利用与抗稻瘟病基因Pi1连锁的SSR引物MRG4766对173份云南地方稻种抗性基因Pi1进行了检测,并选择其中30个材料进行了人工接种验证。结果表明,人工接种验证与分子鉴定结果完全相符,说明SSR引物MRG4766用于鉴定抗稻瘟病基因Pi1是可行的。分子标记检测表明,供试的173份材料中有64份含有抗稻瘟病基因Pi1,占36.99%;其中102份籼稻中有33份含有该基因,占32.35%,而71份粳稻中有31份含有该基因,占43.66%,粳稻含有抗稻瘟病基因Pi1的比例比籼稻要高。检测到含有Pi1基因的种质材料分布在云南省11个州市29个县(市),分布范围较为广泛。南部边缘水陆稻区分布频率为41.03%,滇南单双季籼稻区分布频率为32.69%,滇中一季粳稻籼稻区分布频率为35.29%、滇东北高原粳稻区为35.29%、滇西北高原粳稻区33.33%。     

利用分子标记辅助选择聚合水稻基因Xa21和Pi9(t)

通过有性杂交和田间多代选育，利用分子标记辅助选择和田间／温室抗性鉴定，将广谱高抗白叶枯病的Xa21，基因和高抗稻瘟病的Pi9(t)基因聚合到同一品系中，获得双基因纯合且农艺性状稳定的株系。用中国7个和安徽省流行白叶枯病病菌以及多个稻瘟病小种进行抗病性鉴定，结果表明：双抗基因系同时抗白叶枯病和稻瘟病，抗性级别为HR-R，抗谱与供体亲本一致，抗性水平基本相当。室内考种结果显示：双抗基因系间株高变异较大；单株有效穗比两亲本弱；结实率和千粒重明显优于Xa21，基因的供体M12，与Pi9(t)基因的供体亲本75-1-127相当。     

水稻抗稻瘟病基因Pi35功能性分子标记的开发及其应用

稻瘟病是水稻生产上的严重病害,利用抗病基因培育抗病品种是控制稻瘟病最经济而有效的措施。在日本,稻瘟病部分抗性基因Pi35作为广谱持久抗性基因已广泛应用于水稻育种和稻瘟病防治实践。但是,Pi35基因在我国的资源和品种中的分布情况不清,制约了这一重要基因在我国育种实践中的应用,急需开发实用的分子标记,并系统研究该基因在我国的品种及其亲本中的分布情况,为稻瘟病抗性育种服务。本研究通过比对抗、感品种中Pi35等位基因序列,发现一个能检测抗、感病性差异的特异SNP(3780 T),并据此开发了Pi35基因的功能性分子标记Pi35-d CAPS。利用该标记检测了抗源藤系138的衍生品种10份、微核心种质204份和主栽品种67份,结合测序鉴定,确认5份藤系138衍生品种(垦鉴稻3号、垦鉴稻6号、垦稻8号、绥粳3号和龙粳34)及2份微核心种质(粳稻品种抚宁紫皮粳子和籼稻品种细麻线)携带Pi35基因。本研究结果为通过分子育种手段高效利用Pi35基因改良我国水稻(特别是籼稻)品种的稻瘟病抗性提供了手段。     

稻瘟病抗性基因Pi25特异性CAPS标记的开发与验证

为在水稻育种中快速与高效利用稻瘟病抗性基因Pi25, 本文利用该基因不同等位基因编码区序列差异开发了4套CAPS标记(CAP1/Hinc II、CAP3/Bgl II、CAP3/Nde I和CAP3/Hpy 99I), 并利用169份稻种资源、98个重组自交系(RIL)以及217个水稻转基因后代, 对4套标记的准确性和选择效果进行了验证。结果表明, 4套标记均能准确地检测Pi25/pi25座位。其中, 标记CAP1/Hinc II和CAP3/Hpy 99I特异性识别并酶切显性等位基因, 而标记CAP3/Bgl II和CAP3/Nde I特异性识别并酶切隐性等位基因。利用稻瘟病菌株JS001-20接种RIL与转基因材料, 抗性表现与标记检测的结果完全一致, 表明该CAPS标记准确可靠。分析稻种资源后发现, Pi25基因频率较低(1.2%), 说明该基因在我国水稻稻瘟病抗性育种中还没有被充分利用。本文的研究结果特别是开发的2对识别并酶切显性等位基因的CAPS标记可用于分子标记辅助选择, 改良我国早籼稻的稻瘟病抗性。     

水稻抗稻瘟病Pigm(t)基因的分子标记辅助选择与利用

旨在快速改良武运粳29196的稻瘟病抗性。采用定向回交育种策略,运用分子标记辅助选择技术和花药培养技术,快速改良武运粳29196的稻瘟病抗性。以籼稻品种谷梅4号为稻瘟病抗性基因Pigm(t)的供体,以高产易感稻瘟病的品系武运粳29196为受体,在连续回交和自交过程中,利用与Pigm(t)紧密连锁的In Dels标记S95477和S29742进行分子标记辅助选择。在BC2F1世代,进行花药培养,获得185个双单倍体群体(DH群体),从中筛选出82个含有Pigm(t)基因的改良株系。在经过对农艺性状、稻瘟病抗性的系统鉴定与稻米品质性状测定后,发现改良株系DH036和DH158的综合性状与武运粳29196已十分相近,且稻米品质有所提升,保持了武运粳29196丰产性的同时,稻瘟病抗性有了明显的提高。利用定向回交、花药培养和分子标记辅助选择相结合的技术体系,可明显提高稻瘟病抗性改良的预见性和准确性,缩短育种年限、加快育种进程。新育成的武运粳29196抗性改良系,为稻瘟病抗性育种提供了重要的遗传资源。