柠条锦鸡儿CkF5H基因及启动子的克隆

为了研究CkF5H基因在柠条锦鸡儿中木质素生物合成途径方面中的生物学功能,以我国西北干旱荒漠地区重要的豆科饲用灌木柠条锦鸡儿为材料,克隆了1个木质素合成相关的CkF5H基因,该基因c DNA全长1 679 bp,g DNA全长3 495 bp,具有2个外显子,1个内含子,编码520个氨基酸,Gen Bank登录号HQ829862。通过染色体步移的技术克隆了1 550 bp的启动子序列,对启动子序列上的响应元件进行了分析。结果显示,具有昼夜节律响应元件、防御与胁迫响应元件、赤霉素顺式作用元件和热响应元件等。CkF5H富含二级结构,其中α螺旋占39.81%,β折叠占15.96%,不规则卷曲占44.23%,并预测其三维结构。对CkF5H基因推导的氨基酸序列预测分析得出,CkF5H蛋白等电点为6.45,分子量为58.09 ku,不稳定系数45.72,是不稳定蛋白,总平均亲水性-0.143,属亲水性蛋白。因此,克隆柠条锦鸡儿的CkF5H基因并详细分析,可为进一步研究该基因提供理论依据。     

柠条锦鸡儿CkLEA4-3基因克隆及表达分析

胚胎发育晚期蛋白是植物在逆境胁迫下产生的一种应激蛋白质,具有较高的亲水性和热稳定性,与植物抗逆功能密切相关。本研究从已构建的柠条锦鸡儿干旱胁迫抑制削减杂交文库(SSH)中筛选到一条LEA蛋白编码基因的部分序列,用RACE技术扩增得到该基因cDNA全长。序列比对与系统进化分析显示,该基因没有特定结构域,它与拟南芥LEA4(AT3G53040)基因同源性最近,故命名为CkLEA4-3。该基因cDNA长971 bp,开放阅读框架长636 bp,编码211个氨基酸,推测蛋白分子量为22.44 kD,等电点为5.76,是一种亲水蛋白。利用荧光定量PCR技术检测发现,CkLEA4-3基因在干旱、ABA、NaCl和脱水处理下均受到不同程度的诱导,推测CkLEA4-3基因可能与柠条锦鸡儿响应逆境胁迫有关。     

巴西橡胶树SNARE蛋白全长cDNA克隆及其序列特征分析

从巴西橡胶树Hevea brasiliensis差减cDNA文库中筛选到一个与SNARE蛋白同源性较高的基因片段,根据其序列信息设计特异引物, 采用cDNA末端快速扩增技术RACE（Rapid Amplification of cDNA Ends）进行差异片段的5’和3’端的扩增,获得了长度为1 070 bp的全长cDNA克隆R295。序列分析表明该基因包含600 bp的开放阅读框,5’-UTR为93 bp, 3’-UTR为377 bp,编码199个氨基酸。该基因编码的蛋白具有一个SNARE coiled-coil保守区、一个典型的VAMP基元及一个羧基端的CAAX基元。同源分析表明该蛋白属于一类特殊的longins蛋白。RT-PCR检测表明它在胶乳中特异表达,在叶中没有表达。     

小麦脂质转运蛋白cDNA结构及相应肽链构造特征的分析

根据测序获得的1条261 bp cDNA片段,通过电子延伸、设计引物,从小麦Mardler/7*百农3217(Pm2)的cDNA中扩增获得1条651 bp的cDNA片段,通过同源比对发现其包含小麦LTP1 完整的编码序列.该片段包含基因的5'非翻译区42 bp,3'非翻译区261 bp,开放阅读框348 bp,编码115个氨基酸.预计蛋白的分子量为11.2 kD,等电点为9.46.此基因有8个位置保守的半胱氨酸(C)残基及25个氨基酸的信号肽,为典型的植物脂质转运蛋白基因.其基因序列数据库(GenBank)登录号为AY796184(基因)和AAV65513(蛋白).通过疏/亲水性分析,发现肽链分子具有较大范围的疏水面.     

疣粒野生稻金属硫蛋白(OMMT-2)基因的获得及序列分析

从疣粒野生稻叶片cDNA文库中分离出1个金属硫蛋白基因的cDNA序列,命名为OMMT-2。该基因全长532bp,其中5’非翻译区为111bp,3’非翻译区171bp,开放阅读框长249bp,编码82个氨基酸,该蛋白的分子量为7775.9,理论等电点为6.49;基因编码的氨基酸含有14个半胱氨酸(Cys),占了总氨基酸的17.07%,且集中分布在肽链的N端和C端,呈CXC和CXXC排列方式。疏水性分析表明,该蛋白在43~56个氨基酸之间有较强的疏水区。通过氨基酸序列分析表明,金属硫蛋白中半胱氨酸的位置和数目有较强的保守性,揭示了半胱氨酸对金属硫蛋白的功能十分重要。     

灵芝金属硫蛋白基因的克隆及序列分析

采用RT-PCR和3′-RACE相结合的方法获得了灵芝（Ganoderma lucidum）金属硫蛋白的cDNA序列。该序列全长为315bp,5′-端非翻译区为47bp,3’端非翻译区具有166bp,开放阅读框长度为102bp（包括一个终止密码子）,可编码33个氨基酸。在其编码的氨基酸序列中半胱氨酸（Cys）含量最高,占21.2%,其次是丝氨基酸Ser(S)和丙氨基酸Ala(A),均占12.1%。对其编码的氨基酸序列进行分析发现该序列具有金属硫蛋白的保守序列模式,是金属硫蛋白家族的成员。     

柠条锦鸡儿CkCDPK基因的克隆、表达分析及载体构建

钙依赖蛋白激酶作为一个关键的信号传导器,通过调控和参与植物体内的代谢途径等方式在植物抵御逆境胁迫过程中发挥着重要作用。为了探索柠条锦鸡儿相关基因的功能,本研究利用同源克隆的方法,从柠条锦鸡儿中克隆了1个CDPK类基因的CDS,命名为CkCDPK。通过测序和生物信息学分析,结果显示,该基因包含1 710 bp的开放阅读框,编码570个氨基酸,分子质量为64.03 ku,蛋白质等电点(PI)为9.12。结构分析显示,CkCDPK含有N端可变区、蛋白激酶区、4个EF手型结构和类似钙调素等结构域。利用实时荧光定量PCR检测了CkCDPK基因在不同逆境胁迫下的表达量,结果显示,NaCl胁迫和干旱胁迫下该基因的表达量呈现出单峰趋势,其中,盐胁迫6 h、干旱胁迫4 h表达量最高,外源ABA诱导下该基因的表达量基本呈逐渐上升趋势。表明该基因可能参与了柠条锦鸡儿的抗逆性调控。构建植物超表达载体pCAMBIA3301-CkCDPK,可为进一步研究CkCDPK基因在柠条锦鸡儿抗逆性调控中的作用奠定基础。     

烟草SKP1基因cDNA的克隆分析及原核表达

应用DDRT-PCR法获得可被壳寡糖诱导的枯斑三生烟SKP1基因cDNA的3’端序列,通过5’ RACE扩增该基因cDNA的5’ 端,进而扩增此基因cDNA的全长,通过同源性比较分析,与本塞姆氏烟草的SKP1基因同源性达81%,其cDNA全长653 bp(GenBank登录号：AY702087),其中编码区位于73~540 bp,编码一条155个氨基酸的多肽。经预测该多肽的分子量为17 527.78 Da,等电点为4.57,定位于细胞质,功能结构域分析结果显示在4~105位氨基酸有一明显的Skp1结构域,其E值为1.25e-52,因此推断该基因为枯斑三生烟的SKP1基因。将该基因编码区亚克隆到原核表达载体pET23b(+)上,转化大肠杆菌BL21(DE3),表达出与预测分子量一致的蛋白。为进一步研究该基因的功能奠定了基础。     

柽柳MnSOD基因的克隆及功能验证

根据已克隆得到的柽柳MnSOD基因片段,采用RACE技术从柽柳中获得MnSOD的cDNA全长序列.该基因全长为1 087 bp.其中,5'非编码区40 bp,3'非编码区333 bp,开放读码框(ORF)长699 bp,编码232个氨基酸.分子量为26 KD,等电点为7.10.该MnSOD氨基酸序列与拟南芥MnSOD序列同源性最高为83%,从12个物种的序列比对可以看出MnSOD氨基酸序列保守性较高.该序列的Genbank注册号为AY573576(基因)和AAS77885(蛋白).将MnSOD基因与酵母表达载体pYES2连接,并进一步转化到酵母基因组中.对重组酵母INVSc1(pYES2-SOD)和对照INVSc1 (pYES2)进行干旱、高温胁迫实验.结果表明:重组酵母的抗干旱、高温能力明显高于对照,证实了来源于柽柳的MnSOD基因具有抗干旱和耐高温能力.     

芝麻八氢番茄红素脱氢酶基因SiPDS的克隆与序列分析

来自芝麻的八氢番茄红素脱氢酶基因(phytoene desaturase gene,PDS)的分离鉴定尚未见报道。本研究根据已报道植物PDS基因的氨基酸保守区,设计简并引物,扩增出编码芝麻新蔡选抗PDS基因c DNA的中间片段。利用电子克隆技术,从芝麻EST数据库中比对得到一条高度同源的序列,并通过RT-PCR方法,从新蔡选抗成功克隆了八氢番茄红素脱氢酶基因的c DNA,命名为Si PDS(Gen Bank登录号:KJ191121)。c DNA序列全长2 273 bp,开放阅读框长度为1 743 bp,编码580个氨基酸。根据克隆获得的全长c DNA序列设计引物,从新蔡选抗DNA中克隆获得Si PDS基因的全长DNA,长度为5 592 bp,转录区包括14个外显子和13个内含子。序列分析表明,Si PDS与其他植物的PDS蛋白序列高度相似;系统进化树分析表明,芝麻Si PDS与黄芩的亲缘关系最近。Si PDS基因可以用作植物病毒诱导的基因沉默载体的内源检测基因,在利用基因工程技术改良芝麻农艺性状方面具有较大的应用价值。     

分子标记技术在宜机收玉米品种选育中应用策略

推广玉米全程机械化操作,关键在于由机械收穗向机械收粒转型,是节约成本、增加效益的有效手段。选育宜机收品种主要应从抗倒性强、成熟期一致、穗位整齐、籽粒成熟后脱水速率快、苞叶宜脱离等性状进行入手。本研究从宜机收品种特征特性分析,收集整理分子标记技术在相关性状方面研究成果,提出分子标记检测在宜机收品种选育中起到的作用。针对宜机收品种特征相关性状研究规律,提出了分子标记检测在玉米宜机收品种改良选育方向。研究结果为快速进行玉米宜机收品种选育提供综合的参考依据。     

79个铁线莲品种花粉育性分析

铁线莲享有"藤本皇后"的美誉,是优异的垂直绿化材料。本研究以79个铁线莲栽培品种为试材,通过0.5%TTC法和I2-KI法两种方法测定铁线莲品种的花粉量和花粉活力,并比较栽培品种之间的差异。结果表明:两种方法测定花粉量差异不显著,测定花粉活力差异显著,TTC法测量花粉活性均值高于I2-KI法并成为铁线莲栽培品种花粉活力检测的最佳方法。铁线莲品种间花粉量差异显著,品种间变幅为0~241粒,平均花粉量为118粒,以48粒花粉量为级差,栽培品种可分为5类群。铁线莲品种花粉均具活力,其花粉活力变幅为2.8%~78.4%,萌发率最高为78.4%(C.’Doctor Ruppel’),最低为2.8%(C.’Purpurea Plena Elegans’),铁线莲品种群间花粉活力排序为早花大花组>晚花大花组>其他基因型,本研究可为铁线莲杂交育种亲本选配等研究提供科学依据。     

谷子(Setaria italica)DNA甲基化修饰相关酶类基因的进化及表达分析

为系统研究谷子(Setaria italica)参与DNA甲基化修饰相关酶类的编码基因,本研究以测序品种‘豫谷1’为材料,水稻(Oryza sativa L.) DNA甲基化修饰相关酶类基因作为参考,运用序列比对和系统进化树构建的方法,得到13个参与谷子DNA甲基化修饰相关的酶类基因,这些基因与水稻的相应基因相似度为64%~80%。谷子与水稻中DNA甲基化修饰相关酶类基因在系统进化树上主要分成了三个进化枝,并且同功的DNA甲基化修饰相关酶类基因在分枝上彼此相邻。同时,实时荧光定量PCR筛选出13对在谷子中能成功扩增的引物,并对实时荧光定量PCR的程序进行确立和优化。本研究为深入开展谷子的表观遗传学研究提供了科学依据。     

棉花CML基因家族成员鉴定与功能分析

【目的】类钙调素(Calmodulin-like,CML)蛋白是1种重要的Ca2+传感器,在调节植物应激反应机制中起重要作用。对CML基因家族进行全基因组学分析,以便深入研究CML基因在棉花逆境胁迫下的作用。【方法】利用生物信息学的方法进行了棉花CML家族成员的鉴定。利用转录组数据和反转录聚合酶链式反应分析陆地棉(Gossypium hirsutum L.)CML基因在盐胁迫下的表达模式。利用病毒诱导基因沉默技术对GhCML44-2基因进行沉默并进行功能验证。【结果】在陆地棉(Gossypium hirsutum L.)、雷蒙德氏棉(G. raimondii Ulbrich)、亚洲棉(G. arboreum L.)中分别获得了154个、74个、78个CML蛋白。进化树和保守基序分析表明,GhCML蛋白分为8个亚类,都含有保守的EF-hand结构域;在盐胁迫下,107个GhCML基因在叶和根中有显著的差异表达,且在根和叶中的差异表达模式不同。启动子分析表明,这些基因启动子中存在多种不同的胁迫响应元件;利用病毒诱导基因沉默技术成功沉默GhCML44-2的棉株相较于对照更加不耐盐。【结论】该研究结果有助于了解棉花CML基因家族的进化与功能,为后续研究其功能提供了一定的理论依据。     

基于SNP标记的大麦遗传多样性与群体遗传结构分析

为了评价大麦种质组合的配制,本研究对384份不同来源大麦种质资源的农艺性状和遗传背景进行分析,并选取了分布于大麦7条染色体上具有多态性的6 454个SNP标记进行群体遗传结构分析,结果表明:(1) 384份参试大麦种质资源的6个农艺性状中,除分蘖数外,其他性状表现基本接近正态分布。6个参试农艺性状统计量指标在环境、基因型、基因型与环境互作效应方面均达到极显著水平(p<0.01)。(2) SNP标记基因分型共分为8种类型。其中A/G类型的最多为2 386个;T/A类型的最少,为104个。平均各条染色体上分布922个,其中4H染色体上最多,为1 288个;1H染色体最少,为642个。(3)遗传结构分析结果显示,384份参试材料分为3个亚群,第1亚群有48份材料,第2亚群有149份材料,第3亚群有187份材料。本研究结果为分子标记辅助育种提供科学依据。     

基于RNA-seq的铁线莲转录组信息分析

本研究首次采用高通量测序技术对同一株上三种不同花被类型的铁线莲'薇安'进行了转录组测序,构建了铁线莲的cDNA文库,并对转录组数据进行过滤及拼接、功能注释、基因的差异表达分析等。通过转录组测序,一共获得了 146 036条序列,99 652个Unigene基因,长度分布在201-14 638 bp之间,平均长度977 bp。对聚类后得到的Unigene进行同源搜索和功能注释,共9 133个Unigene与七个数据库(NR, GO,NT, Pfam, KEGG, KOG, Swissprot)均具有同源性,占总数目的9.16%。经SSR位点查找与分析,从检测到的99 652个序列总数中识别出23 035个SSR位点,包含序列的SSR的数量有18 243个,总长为129 654 975 bp 该研究结果可为铁线莲'薇安'不同花被类型的差异基因表达及筛选和探究重被花形成的分子机制提供了科学依据。     

长筒石蒜类胡萝卜素裂解双加氧酶基因LlCCD4的克隆与表达

长筒石蒜(Lycoris longituba)是石蒜属植物,为中国特有的观赏花卉,具有极高的观赏价值也是石蒜属少有的香花品种,然而目前尚未有关于其花香方面的报道。故本研究以长筒石蒜花瓣为材料,在长筒石蒜中开展了花香基因CCD4的研究。利用课题组已获得的长筒石蒜花瓣转录组数据库,我们筛选到1个与拟南芥CCD4基因同源性最高的序列,并克隆得到了其完整的编码区,命名为LlCCD4。该基因编码区全长为1 815 bp,编码604 aa,蛋白质分子量约为66.20 kD,理论等电点为6.43,属于酸性不稳定的疏水性蛋白,且具有CCD4基因共有的保守结构域。进化分析进一步表明该基因为CCDs基因家族中的CCD4成员,与单子叶植物番红花中的CCD4基因具有较高的同源性。实时荧光定量分析证实该基因在长筒石蒜的盛花期即长筒石蒜花瓣最香的时期表达量最高。本研究将有助于揭示长筒石蒜花香形成的分子机理,并为石蒜属植物花香改良提供基因资源。     

通过优化gRNA设计提高CRISPR/Cas9系统中基因编辑效率的方法

CRISPR/Cas9系统是一种广泛应用于动物、植物、真菌、细菌的新一代基因定点编辑技术,如何提高g RNA的编辑效率是该技术的关键点也是许多研究者关注的焦点。本研究利用CRISPR/Cas9技术对番茄miR167a前体序列进行基因编辑,根据番茄miR167a前体序列在线设计候选g RNA,同时结合体外编辑检测的方法筛选出能够在体外成功编辑的g RNA-G1,把其连接到含有荧光标记的pP1C.1C表达载体,转化番茄子叶,产生愈伤组织数116个,得到5个含有表达载体的材料,经测序发现,其中3个材料发生了编辑。结果表明,通过体外检测和在线软件设计相结合的方法来快速检测g RNA的编辑效率,能筛选出最优的g RNA用于载体的构建,与未采用体外编辑检测来设计g RNA的方法相比,显著提高了CRISPR/Cas9的编辑效率。本研究通过优化g RNA,创新了一种高效利用CRISPR/Cas9进行基因编辑的方法。     

中华猕猴桃‘金阳’果实生长发育动态分析

研究南京地区‘金阳’猕猴桃果实发育规律,为其在南京及其周边地区的推广及优质丰产提供理论依据。以5年生‘金阳’猕猴桃为试验材料,定期观察并记录‘金阳’猕猴桃从坐果到成熟软化过程中的鲜重、干重、纵横径、种子发育和果肉颜色等形态指标,并测定可溶性固形物、可溶性糖、可滴定酸、有机酸、维生素C、叶绿素和类胡萝卜素等含量。结果表明,‘金阳’猕猴桃花后0～40 d果实迅速膨大,鲜重快速增加;花后20～116 d干物质不断积累;花后83 d种子开始变黑,花后97 d种子完全变黑成熟。‘金阳’果实成熟前,可溶性固形物变化幅度较小,可溶性糖含量呈上升趋势,维生素C和可滴定酸均呈先上升后下降的趋势,有机酸中奎宁酸、苹果酸、柠檬酸的含量较高。‘金阳’花后138～154 d,果实达到可采收状态。果实采收后,硬度迅速下降,并且类胡萝卜素/叶绿素的比值升高,果肉颜色由绿色转为黄绿色,再变为黄色。南京地区可食用状态下‘金阳’猕猴桃单果重为80.5 g,果肉金黄色,维生素C的含量为129 mg/100 g,可溶性固形物的含量为14%,可滴定酸的含量为1.4%,果实经济性状良好,因此‘金阳’猕猴桃适宜在南京地区推广。     

外源物质调控芥蓝幼苗MAM3基因表达及其生物信息学分析

萝卜硫苷的水解产物(萝卜硫素)对人体具有很强的抗氧化和防癌抗癌功效。本研究利用亚硒酸钠和茉莉酸甲酯处理芥蓝7 d幼苗,探究其对萝卜硫素含量及MAM3基因表达量的影响,并对MAM3蛋白进行生物信息学分析,以探寻萝卜硫素合成代谢过程的分子机理。结果显示,硒和茉莉酸甲酯处理都能提高芥蓝幼苗萝卜硫素水平,茉莉酸甲酯使萝卜硫素水平极大提高,且MAM3基因在茉莉酸甲酯的刺激下表达量与萝卜硫素水平一致。通过克隆所得MAM3基因测序发现,其开放阅读框序列1 518 bp,可编码505个氨基酸。通过一系列在线软件对MAM3蛋白进行生物信息学分析,预测MAM3蛋白为稳定的亲水蛋白,隶属于HMGL-Like大家族,是一种叶绿体蛋白,MAM3蛋白有58个磷酸化位点,且预测其蛋白结构元件中30.50%为α-螺旋、47.52%为随机卷曲、21.98%为延伸链;通过氨基酸序列多重比对发现,其与欧洲油菜、甘蓝有高度同源性。该结果证明,MAM3基因在萝卜硫素合成过程中起着重要作用。本研究结果为高萝卜硫素芥蓝品种的选育提供实践依据;对MAM3蛋白的生物信息学分析,为进一步深入研究MAM3基因功能打下理论基础。