橡胶树中碱性转化酶HbNIN9表达及酶学特性分析

转化酶作为蔗糖分解代谢的关键酶,在植物生长发育、生物与非生物胁迫响应等生理过程中发挥重要作用。基于对橡胶树不同组织转录组数据库的分析,本研究克隆了一个在橡胶树种子中有较高丰度表达的中碱性转化酶基因HbNIN9;系统进化分析和在线软件预测均显示其亚细胞定位为线粒体,属于中碱性转化酶α亚族成员;利用原核表达体系成功获得Hb NIN9优化表达的重组蛋白,优化表达的诱导条件为0.5 mmol/L IPTG,25℃培养6 h;酶学特性分析表明,HbNIN9蛋白酶活反应的最适温度为45℃,最适pH值为7.5,米氏常数Km值为18.09 mmol/L。本研究从蛋白水平证实了Hb NIN9为典型的中碱性转化酶,有助于深入揭示线粒体型转化酶在橡胶树种子糖代谢中生理功能,丰富橡胶树中碱性转化酶家族成员的生理生化研究。     

慈竹细胞壁转化酶BeCWINV1的克隆、亚细胞定位和表达分析

细胞壁转化酶(CWINVs)是糖降解关键酶之一,在植物发育、同化物分配和调节库强等方面具有重要作用。为了探究慈竹中CWINVs基因的亚细胞定位和表达水平,本研究以慈竹转录组数据库为基础,从慈竹笋中克隆到BeCWINV1基因。其开放阅读框序列长度为1 758 bp,编码585个氨基酸残基。序列比对和系统进化分析表明,BeCWINV1具有细胞壁转化酶特异的活性功能位点"WECPD",并与绿竹Boβfruct1、水稻CIN2、玉米INCW2亲缘关系较近,聚在一个CWINV分支上。将BeCWINV1-GFP融合载体瞬时转化洋葱表皮细胞的研究也证明了BeCWINV1定位在细胞壁上,表明其可能参与质外体空间蔗糖的水解。实时荧光定量PCR分析表明,BeCWINV1在慈竹茎杆中表达量显著高于其他部位;额外施加蔗糖对BeCWINV1表达没有明显影响,但糖供应受到限制时其表达被显著激活。这些结果表明,BeCWINV1参与慈竹茎杆韧皮部卸载,对逆境胁迫下维持细胞内糖浓度和库活性方面有重要的作用。     

酵母表达芥子酶基因TGG4、TGG5的酶学特性差异研究

十字花科植物广泛存在芥子酶,并利用芥子酶以抵御病虫害的侵袭。TGG4和TGG5是在拟南芥中发现的新型芥子酶基因,二者基因序列极为相近。本试验通过对转TGG4和TGG5基因酵母的诱导表达及相应重组蛋白的纯化,探讨两个蛋白的酶学差异性。结果表明:TGG4、TGG5的最大Vc激发浓度都为1mmol/L;但是在最适反应温度和最适反应pH上,两个重组蛋白略有不同,TGG4和TGG5的最适温度分别为67℃和57℃,而最适pH分别为6.5和5.5,TGG4比TGG5要耐高温耐碱性;这两个重组蛋白酶活性都受NaCl的抑制。     

SH-110菌海藻糖合成酶基因克隆、表达及酶学性质研究

为找到理想的工业化生产海藻糖合成酶基因工程菌,以长白山温泉SH-110基因组DNA为模板,PCR扩增编码Tres基因片段,克隆至pET-30a(+)原核表达载体,转化E.coli BL21(DE3),实验中采用IPTG和乳糖同时进行对比诱导,对表达产物进行SDS-PAGE和酶学性质研究。成功克隆了2912 bp的Tres基因,实验中发现加入IPTG和乳糖后,融合蛋白在胞内都得到了表达,而且添加乳糖诱导的蛋白表达量偏高。表达重组酶Tres相对分子量约为110 kDa,最适作用温度60℃,最适pH7.0。金属离子Ca2+、K+、Zn2+对重组酶有明显激活作用,Ba2+、Cu2+、Mn2+有明显抑制酶活作用。重组酶的动力学常数Km为8.823 mmol/L和Vmax为235.29 mmol/L。已成功在大肠杆菌表达重组Tres,为进一步研究利用基因工程菌生产大量海藻糖合成酶,进行大规模生产海藻糖提供理论依据。     

木薯碱性/中性转化酶MeNINV4酵母功能互补

木薯(Manihot esculenta Crantz)为大戟科植物,其块根富含淀粉,主要用于食用、饲用,同时木薯淀粉还可广泛应用于工业生产中。木薯块根淀粉的合成需要蔗糖提供碳水化合物和能量,碱性/中性转化酶在木薯块根蔗糖分解利用时起关键作用。前期已从木薯基因组中克隆获得了11个碱性/中性转化酶基因,其中Me NINV4主要在茎中表达。本研究主要利用转化酶酵母突变菌株SEY2102进行酵母功能互补实验,鉴定Me NINV4是否具有催化蔗糖分解的功能。结果发现,转了p DR196-Me NINV4的SEY2102酵母可以在以蔗糖为唯一碳源的培养基中生长,表明Me NINV4能催化分解蔗糖。提取含有p DR196-Me NINV4质粒的SEY2102酵母粗酶液,进行碱性/中性转化酶活性检测,发现其能催化蔗糖分解成还原糖。这些结果为进一步研究Me NINV4的酶学特性及生理功能提供参考。     

己糖激酶调控‘赤霞珠’酿酒葡萄蔗糖分解代谢

以酿酒葡萄(Vitis viniferaL.)‘赤霞珠’果实为试材,研究己糖激酶与蔗糖分解代谢关键酶[可溶性酸性转化酶和蔗糖合酶(分解方向)]在果实发育过程中的关系,以期为己糖激酶对蔗糖分解代谢的调控提供知识。利用高效液相色谱(HPLC)分析了发育期‘赤霞珠’葡萄果实中蔗糖、葡萄糖和果糖的含量,测定了其己糖激酶、酸性转化酶和蔗糖合酶活性变化趋势。研究表明,果实整个发育过程中,蔗糖含量极微,己糖激酶表现出与葡萄糖、果糖相反的梯度变化;葡萄糖和果糖含量低时,可溶性酸性转化酶和蔗糖合酶的活性开始上升;葡萄糖和果糖含量高时,可溶性酸性转化酶和蔗糖合酶的活性降低。相关性分析表明,蔗糖含量与葡萄糖含量、果糖含量显著相关,葡萄糖和果糖含量与可溶性酸性转化酶、蔗糖合酶活性负相关,己糖激酶活性与所有因子负相关,但无显著相关。讨论后得出己糖激酶可能通过其催化活性调控葡萄糖和果糖的积累并反馈调节可溶性酸性转化酶和蔗糖合酶。     

橡胶树品种‘湛试327-13’乙烯响应分子机制分析

橡胶树‘湛试327-13’新品种兼具抗寒和高产的特性,揭示其在乙烯刺激后的分子机制有利于精准鉴定和选育种质资源。本研究以1.5%乙烯利处理橡胶树‘湛试327-13’开割树为材料,利用荧光定量技术分析胶乳和树皮中活性氧淬灭酶、蔗糖转运蛋白和橡胶生物合成关键酶等基因的表达规律,结果表明：乙烯利处理并连续割6刀后,橡胶树活性氧淬灭酶、蔗糖转运蛋白、胶乳抗性和橡胶生物合成关键酶基因在树皮表达量高于其在胶乳中表达量。与对照相比,随着割胶刀数的增加,‘湛试327-13’树皮脂肪氧化酶(HbLOX1)和过氧化物酶基因(HbPOD1)基因表达显著上调,最高为22.15和31.95倍;蔗糖转运蛋白HbSUT1、HbSUT2a分别提高66.11和58.50倍;几丁质酶(HbCHI)、葡聚糖酶(HbGLU)和橡胶素(HbHEV)分别提高16.93、8.09和10.37倍;橡胶生物合成关键酶基因HbGGPPS和HbHMGS1分别提高了14.71和15.05倍。说明乙烯刺激橡胶树后,‘湛试327-13’胶乳和树皮中活性氧淬灭酶、蔗糖转运蛋白、胶乳抗性和橡胶生物合成关键酶基因依次高表达且持续时间长达6刀(18 d...     

木薯Linamarase基因的克隆、表达及酶学特性分析

亚麻仁苷酶(Linamarase)是存在于木薯、巴豆等作物中的降解生氰葡萄糖苷Linamarin（亚麻仁苷）的酶,在结构上与芥子酶有很大的相似性,对它的研究有利于揭示生氰葡萄糖苷酶和芥子酶之间的关系以及芥子酶的起源问题。通过真核表达的方法,克隆了木薯Linamarase基因,构建酵母表达载体,转化毕赤酵母GS115,经诱导表达和亲和纯化,获得纯化的Linamarase重组蛋白。SDS-PAGE分析表明,重组蛋白分子量集中在71 kD左右。该酶最适反应温度在37℃左右,最适pH约为5。以pNPG为底物时,Km为1.70 mmol/L,最大反应速率Vmax为8.36 μmol/(min?mg)。     

拟南芥TGG5基因的克隆、表达和酶学特性

芥子酶是广泛存在于十字花科植物中的一类降解硫代葡萄糖苷的酶。当植物受到病虫侵袭时, 芥子酶与其底物硫代葡萄糖苷结合,释放有毒的水解产物形成植物重要的化学防御系统。TGG5 是新 发现的一类芥子酶基因,对其研究将有利于揭示芥子酶防御系统的功能。试验克隆了拟南芥TGG5 基 因cDNA,构建酵母表达载体,转化毕氏酵母GS115。经甲醇诱导表达和Ni 亲和层析,获得纯化的 TGG5 重组蛋白。SDS-PAGE分析表明,重组蛋白分子量集中在58 kD左右,并有较明显拖尾,呈现典型 的糖基化蛋白的特征。进一步探讨了TGG5 重组蛋白的酶学特性,结果表明：该芥子酶的Km为1.96 mmol/L,Vmax为0.084 mmol/(min·mg);酶反应的最适pH 为5.5;该芥子酶在37~80℃范围内有较广泛的 温度适应性,并具有较好的80℃热稳定性;NaCl对该酶有明显的抑制作用;低浓度抗坏血酸具有激活芥 子酶的作用,抗坏血酸终浓度为1.5 mmol/L时,酶活力最大。RT-RCR分析,证实了TGG5 只在拟南芥根 中特异表达,这表明TGG5 可能代表了一个芥子酶基因新亚家族。     

α-苦瓜素蛋白的原核表达及其抗体制备

α-苦瓜素是一种典型的Ⅰ型核糖体失活蛋白,具有多种生物活性,有着广泛的应用前景。本研究通过原核表达技术成功获得α-苦瓜素蛋白及制备了血清抗体。首先通过RT-PCR方法从苦瓜籽中克隆到α-苦瓜素全长基因,然后将该基因连接至原核表达载体p ET-28a(+)上,导入大肠杆菌Rosetta菌株中并少量诱导表达,筛选出重组蛋白的最适表达条件。在37℃、终浓度1 mmol/L IPTG的诱导条件下,可成功诱导出分子量约为29.7 k D左右的可溶性重组蛋白,与预期α-苦瓜素大小一致。按照最适条件进行大量诱导α-苦瓜素蛋白的表达,利用Ni-NTA柱对α-苦瓜素重组蛋白进行纯化,最后以纯化的α-苦瓜素蛋白免疫注射新西兰大白兔制备抗血清。Western blotting分析表明,制备的抗血清具有较好的特异性和灵敏度,可以特异性检测苦瓜籽中的α-苦瓜素蛋白。本研究结果为下一步探究α-苦瓜素调控植物防御生物胁迫的分子机理提供指导。     

剑麻悬浮细胞体系的建立

为了获取良好的剑麻悬浮细胞体系,以剑麻无菌幼苗嫩叶为诱导材料,对剑麻胚性愈伤组织的获得,建立细胞悬浮系和影响悬浮细胞增殖的主要影响因子进行了探讨。结果表明:幼叶在培养基为MS+2.0 mg/L 2,4-D+1.0 mg/L 6-BA上诱导的愈伤组织,经1～2次继代培养后获得了颗粒状、浅黄色的胚性愈伤组织;接种于液体培养基接种量为2 g (鲜重),继代周期为7 d,经4～5次继代震荡培养建立了细胞悬浮系,细胞生长符合"S"型曲线,细胞浓度可达6.1×105～4.6×106个/m L以上;在悬浮细胞生长前期,pH值明显下降,在细胞对数生长期,pH值略有升高,并趋于平缓;最适宜的细胞悬浮培养基为(MS+1.5 mg/L 2,4-D+4.0 mg/L6-BA+350 mg/L水解酪蛋白, 30 g/L蔗糖, pH值为5.8)。通过建立剑麻悬浮细胞培养体系的方法,为进一步应用于剑麻悬浮细胞转化体系和多倍体育种等研究。     

白木香倍半萜合酶基因AsVS的克隆与表达分析

法尼基焦磷酸(farnesyl diphosphate, FPP)是植物萜类化合物合成途径的重要前体之一,经不同的酶催化可形成各类萜类化合物,Vetispiradiene合酶可催化FPP形成Solavetivone和Lubimin的前体Vetispiradiene。本研究利用白木香转录组数据,首次克隆了编码白木香Vetispiradiene合酶的基因(命名为As VS, Genbank登录号为MH378283),AsVS基因序列全长为1 632 bp,编码543个氨基酸,该氨基酸序列与马来沉香倍半萜合酶聚类于同一分支,具有较近的亲缘关系,该蛋白植物倍半萜的保守性结构域DDXXD,NST/DTE和R(R)X8W,相对分子量为62.73 kD,理论等电点为5.51,包含40个磷酸化位点;二级结构以α螺旋和无规则卷曲为主;不含跨膜结构域。RT-qPCR分析结果表明AsVS基因在结香剂处理过程中于白木香茎干样品中持续上调表达,其第6天及第9天的表达量分别为对照处理的2.36和5.02倍。此结果为进一步研究As VS基因在白木香萜类化合物的合成及沉香致香成分富集中的功能提供了理论基础。     

菠萝蜜锈病分级标准及田间病害调查

海南省是菠萝蜜的重要产区之一。自2016年起对海南省11个菠萝蜜规模化种植地区的果园进行了菠萝蜜锈病普查,对发病较严重的5个市县进行了连续两年的固定点监测。结果表明:万宁、定安、澄迈、琼海等地的菠萝蜜锈病发病率极显著高于其他地区;除琼海外,其它市县菠萝蜜果锈病发病率4～6月的均高于9～11月;发病率最高的是2017年五指山,达20.00%,最低的是2018年澄迈,为9.33%;病情指数方面五个监测点2017年均大于2018年。单苞和单果锈病严重度均为5级。综上,4～6月是菠萝蜜锈病发病的高峰期;综合两年比较,各地区的平均发病率与平均病情指数均有所下降,病果数量也在下降。通过提出锈病分级标准,为明确锈病害发生规律,提高防治水平提供参考依据。     

菠萝AcSAP转录因子对非生物胁迫和生物胁迫的应答响应

STERILE APETALA (SAP)是调节花序、花和胚珠发育,调控分生组织细胞的增殖和器官大小的多功能基因。本研究利用生物信息学的方法对菠萝SAP转录因子进行序列分析,并通过qRT-PCR技术研究了非生物胁迫和生物胁迫对菠萝SAP基因表达的影响。结果表明,菠萝SAP蛋白为稳定疏水酸性蛋白且含有3个WD40重复区域,蛋白质二级结构显示,菠萝SAP蛋白主要结构元件为延伸链和无规则卷曲;qRT-PCR分析显示,逆境胁迫下,AcSAP的表达量与对照差异显著。在H2O2、NaCl、SA、ABA、Eth、低温(4℃)和病菌侵染胁迫下,AcSAP的表达量显著升高。研究表明,逆境胁迫能使AcSAP基因的表达受到影响,进而直接或间接影响植物生长发育,为今后菠萝的抗逆研究和分子育种提供了理论依据。     

胶孢炭疽菌泛素结合酶基因CgUBC2的RNAi突变体获得与功能分析

为了研究胶孢炭疽菌泛素结合酶基因CgUBC2的功能以及与致病相关基因间的关联性。利用RNAi技术构建沉默载体pSilent-1:CgUBC2,通过PEG介导法获得突变体菌株,实时荧光定量PCR法分析其侵染寄主过程中的差异表达,以及与PG、ECH、LIP、PKS、HMT、Sin3P、NRPS 7个致病相关基因的关联性。通过特异性引物检测鉴定、表达量分析,获得CgUBC2的RNAi突变体为pSilent-1:CgUBC2-1和pSilent-1:CgUBC2-2,侵染过程中突变体菌株CgUBC2基因表达量、7个致病相关基因的表达量显著低于野生型菌株。成功获得胶孢炭疽菌泛素结合酶基因CgUBC2的RNAi沉默突变体,CgUBC2参与侵染寄主的过程、正向调控7个致病相关基因和致病力。     

木薯MeHXK1酵母功能互补鉴定

已糖激酶是植物催化已糖磷酸化生成磷酸已糖的一类重要的酶,参与植物生长发育及信号转导的过程。在前期研究中已从木薯基因组克隆获得7个已糖激酶基因,其中木薯已糖激酶基因MeHXK1主要在叶片、块根韧皮部、雄花和雌花中表达。本研究利用已糖激酶酵母突变菌株YSH7.4-3C鉴定酵母功能,研究已糖激酶是否具有催化已糖磷酸化的作用。结果发现:转pDR195-MeHXK1载体的YSH7.4-3C酵母在以葡萄糖或果糖为唯一碳源的培养基中能生长,说明木薯已糖激酶MeHXK1可通过催化己糖磷酸化为酵母的生长提供碳水化合物和能量。这些结果为进一步研究MeHXK1蛋白的酶学特性及生理功能提供参考。     

橡胶树胶孢炭疽菌效应蛋白基因CgE35对孢子产量的影响

橡胶树炭疽病是橡胶树的重要真菌病害之一,主要由胶孢炭疽菌引起。效应蛋白是病原菌侵染植物的重要致病因子,在寄主与病原菌的相互识别中发挥重要作用。为了进一步阐明橡胶树炭疽菌的致病机理,课题组前期对橡胶树胶孢炭疽菌的效应蛋白在基因组水平上进行了预测,其中一个编码候选效应蛋白的基因被命名为CgE35。本研究对CgE35基因进行了扩增,并对其所编码的效应蛋白CgE35进行了生物信息学的分析,分析结果表明,该基因编码一条由200个氨基酸组成的多肽,分子质量约为21.7 kD,其氨基段含有一段由24个氨基酸组成的典型信号肽序列,且该蛋白不含任何跨膜结构域和已知的保守结构域。为了进一步研究该基因的功能,我们根据同源重组原理,构建了 CgE35基因的敲除载体pCB1532-CgE35,通过PEG介导的原生质体转化法将其转入胶孢炭疽菌原生质体细胞中进行同源交换,经过对转化子进行抗性筛选和分子鉴定,获得CgE35基因的敲除突变体ACgE35,并对其孢子产量和菌落生长情况进行分析,发现胶孢炭疽菌CgE35基因的敲除突变体ACgE35的孢子产量明显低于野生型菌株,而二者的菌落生长情况没有差异。以上结果表明,橡胶树胶孢炭疽菌CgE35基因编码一个未知功能的分泌蛋白,该基因与胶孢炭疽菌的产孢能力有关,但与其菌丝的生长关系不大。本研究结果为阐明胶孢炭疽菌的致病机理,建立新型橡胶树炭疽病防控策略提供理论依据。     

芒果种质对炭疽病、蒂腐病、疮痂病的抗性评价

芒果炭疽病、蒂腐病和疮痂病是芒果种质的重要病害,给中国各芒果产区造成严重的危害,而抗病品种选育是防治芒果病害最经济有效的途径。为评价新引进的芒果种质对炭疽病、蒂腐病、疮痂病的抗性水平,采用田间抗病性鉴定方法对56份芒果种质果实的3种病害进行抗性评价。结果表明,56份种质资源中,高抗炭疽病种质5份、中抗炭疽病19份、高感炭疽病4份,高抗蒂腐病16份、中抗蒂腐病26份、高感蒂腐病1份,高抗疮痂病1份、中抗疮痂病17份、高感疮痂病4份,对3种病害均有抗性的种质资源7份。本研究结果初步揭示新引进的一些种质资源对芒果炭疽病、蒂腐病、疮痂病的抗性情况,为进一步地依托供试种质开展抗病性育种提供参考。     

血叶兰可培养内生真菌多样性

为了解血叶兰内生真菌的多样性,揭示其菌群群落结构及分布特征。本研究以霸王岭自然保护区野生血叶兰为研究对象,采用组织块分离方法,对血叶兰内生真菌进行分离鉴定和多样性的研究。结果表明:从血叶兰不同组织部位中共分离出来66株内生真菌,通过r DNA-ITS序列分析将其归为4纲18属,其中以刺盘孢属(Colletotrichum)为优势类群,占菌株总数33.33%;茎中分布的菌群和菌株数量均最高,分别占61.11%和36.26%,根部与茎段菌群都以刺盘孢属最多;不同组织中叶片的内生真菌的多样性指数(H’)和均匀度指数(E)最高,分别为2.75和1.19;茎与叶部位内生真菌相似程度最高,相似性系数为0.381。因此,血叶兰内生真菌资源组成丰富,不同部位中内生真菌分布及组成存在较大差异,但又有一定组织的专一性。