马铃薯StWRKY15在转基因烟草的耐寒性分析

WRKY转录因子在植物的正常生长发育以及逆境生长过程中起着重要作用.本研究以4℃作为低温胁迫水平,对'青薯9号'马铃薯组培苗进行胁迫处理.通过RT-qPCR技术对马铃薯的5个WRKY转录因子基因进行表达分析,筛选出对低温响应的基因,构建表达载体遗传转化烟草,初步分析基因的功能.结果 显示,4℃低温胁迫下,马铃薯中的StWRKY15基因上调显著(P＜0.05);STRING预测分析StWRKY15编码蛋白的互作蛋白,主要包括StWRKY72编码蛋白、StGRAS6编码蛋白、c2结构域QUIRKY蛋白;通过双酶切方法成功获得重组质粒PRI101-StWRKY15;冻融法介导转化烟草,过表达StWRKY15基因显著提高了转基因烟草的耐寒性.4℃低温胁迫下,StWRKY15基因的过表达明显增加了脯氨酸、可溶性糖及总蛋白含量,降低了丙二醛含量;胁迫10d时,转基因烟草的长势优于野生型烟草.综上所述,可推断出StWRKY15对低温胁迫有响应,在逆境胁迫下可减轻植株受到的损伤,在一定范围内增强转基因烟草的耐寒性.本研究为进一步了解马铃薯WRKY转录因子的功能提供了理论依据.     

基于转录组金银花WRKY转录因子的挖掘与分析

WRKY转录因子是植物抗逆应答过程中最为常见的蛋白家族。为了挖掘金银花抗寒相关的WRKY基因,本研究基于已有的转录组数据,利用植物转录因子数据库和BioEdit对WRKY进行筛选及保守结构域分析,对筛选出的WRKY转录因子利用ExPASy进行理化性质分析,利用PSORT进行亚细胞定位预测,NetPhos进行磷酸化位点分析并且利用MEME数据库对WRKY基因的氨基酸进行序列分析,运用MEGA软件对筛选的金银花WRKY转录因子基因和21个已知抗寒的WRKY基因进行序列同源比对,并构建系统进化树。结果表明:金银花中筛选的30个WRKY基因的蛋白为85～721个氨基酸,理论等电点的范围为4.85到9.76。所有LjWRKY基因编码的蛋白中只有LjWRKY6为稳定蛋白,其余均属于不稳定蛋白,所有蛋白均属于亲水性蛋白。亚细胞定位预测结果,LjWRKY所有蛋白定位于细胞核。除LjWRKY23不具有Try磷酸化位点,其它所有氨基酸均具有Ser、Thr和Try磷酸化位点。LjWRKY蛋白比较保守,WRKYGQK没有发生任何变异,且包含三类WRKY转录因子。系统进化树发现,有12个WRKY基因与已知抗寒基因有同源性,推测其参与了金银花低温逆境下的反应。研究结果可以通过筛选的WRKY基因,进行进一步的转基因验证,进而为植物抗寒分子育种提供分子基础。     

茄子SmWRKY1转录因子基因克隆及序列分析

克隆茄子转录因子SmWRKY1基因,对其序列进行分析,为SmWRKY1基因在茄子抗逆分子育种的应用中提供理论依据。以茄子幼苗为试材,依据GenBank上已提交的番茄、甜椒、烟草的WRKY基因序列设计引物,提取总RNA利用RT-PCR方法扩增得到基因片段,克隆、测序并通过NCBI在线和DNAMAN等软件对其核酸及氨基酸序列进行分析。同源克隆得到SmWRKY1,核酸序列930 bp,翻译为310个氨基酸组成的蛋白序列,其中Ser和Thr量最多,分别占总氨基酸数的12.0%和11.0%。NCBI检索SmWRKY1属于WRKY基因超家族,第114至120个氨基酸含有WRKY保守结构域“WRKYGQK”,其锌指结构为C2H2型,初步证实SmWRKY1属于第二大类WRKY转录因子。DNAMAN构建茄子SmWRKY1与不同植物WRKY蛋白的系统发育树,表明茄子WRKY1与番茄中的WRKY1蛋白亲缘关系最近,同源性达96%。WRKY基因在植物耐逆性的研究中有着重要的作用,通过克隆出SmWRKY1基因片段,为进一步克隆其全长、研究其功能做前期准备,为分子育种、培育茄子耐逆性新品种奠定了一定的基础。     

陆地棉基因GhWRKY40-1的克隆及表达分析

【目的】WRKY转录因子通过激活下游一系列抗逆应答基因的表达而提高植株的综合抗性。本研究旨在研究WRKY转录因子在陆地棉中的功能。【方法】通过基因芯片筛选鉴定出1个逆境诱导的陆地棉WRKY转录因子基因,由于此基因编码蛋白含有1个典型的WRKY结构域,且与拟南芥At WRKY40具有较高相似性,故命名为GhWRKY40-1。采用电子克隆及反转录-聚合酶链反应技术获得GhWRKY40-1基因c DNA全长,并对其进行序列分析及结构与功能预测。【结果】GhWRKY40-1的开放阅读框为981 bp,编码326个氨基酸,预测蛋白相对分子质量为35.78×103,等电点为8.39。GhWRKY40-1在拟南芥原生质体中瞬时表达定位于细胞核,且具有转录激活活性。RT-PCR结果表明,GhWRKY40-1受甘露醇诱导上调表达。【结论】推测GhWYKY40-1可能参与干旱胁迫应答反应,并且在植物逆境胁迫中发挥重要作用。上述分析为进一步从分子水平上验证其抗逆生物学功能以及揭示棉花非生物胁迫抗逆机制奠定了基础。     

马铃薯转录因子StWRKY6基因克隆及其生物信息学的分析

WRKY转录因子是目前研究的与逆境有关的转录因子之一。本试验以马铃薯栽培品种‘冀张薯12号’为材料,获得StWRKY6基因,并对其进行了生物信息学分析和功能的初步研究。StWRKY6基因长度为1 491 bp,由496个氨基酸编码而成,其相对分子量为55 212.93,理论等电点为7.02,带负电残基总数为48,带正电残基总数为47,不稳定系数为51.70。该蛋白质二级结构以无规则卷曲为主,占54.9%,α-螺旋为32.3%,延伸链为9.7%,β-折叠为3.2%,是不稳定蛋白,属于亲水蛋白。通过进化树分析,与番茄同源性最高,可达90%以上;利用RT-qPCR构建表达谱,发现StWRKY6在叶片中的表达量较高;经过低温胁迫和盐胁迫处理一定时间后其表达量显著增加,说明其可能与马铃薯的耐盐性和耐低温性有关。本研究为深入研究马铃薯StWRKY转录因子参与非生物胁迫调控提供科学依据。     

蒙古冰草WRKY转录因子基因的序列分析

WRKY转录因子是一类与植物抗逆相关的蛋白家族,通过激活植物抗逆应答基因的表达而提高其抗逆性。为挖掘蒙古冰草(Agropyron mongolicum)抗旱相关的WRKY基因,本研究在已有转录组测序数据的基础上,用Plant TFDB数据库中的Prediction和Blast对WRKY基因筛选及保守结构域分析,对筛选出的WRKY转录因子用Ex PASy Proteomics Server和MEME程序预测其分子量、等电点和基序、并用MEGA7.0.7与已报道具有抗旱功能的16个WRKY蛋白进行多序列比对分析并构建系统进化树。结果表明:蒙古冰草中筛选出14个WRKY基因,其蛋白大小在63~677 aa范围内,分子量和等电点分别介于7.1~73.3 k D和6.09~10.09之间;基序预测得到1个特征基序,2个保守基序,最长的基序含29个氨基酸。蒙古冰草WRKY转录因子蛋白基本上比较保守,WRKYGQK没有发生变异,但存在着Q残基的变异;进化树分为两大类,一类为Unigene19129、Unigene47036、Unigene50921、其C端锌指结构是C2HC,另一大类Unigene29536、Unigene43681、Unigene52656等C端锌指为C2H2;蒙古冰草中筛选出的WRKY基因与16个具抗旱功能的WRKY基因均有同源性,推测这14个WRKY转录因子参与蒙古冰草干旱逆境下的反应。     

蒜芥茄黄萎病抗性相关基因SsWRKY22和SsWRKY33的克隆与表达分析

黄萎病是茄子生产中的重要病害之一,严重影响茄子的产量和品质。WRKY转录因子在植物抗病中扮演着重要的角色,但在茄子黄萎病抗性中的作用不明。本研究从黄萎病高抗材料野生蒜芥茄的转录组数据中,筛选获得WRKY家族中的SsWRKY22和SsWRKY33基因,利用PCR技术克隆获得目的基因,并对其进行生物信息学和表达模式分析。结果表明,SsWRKY22和SsWRKY33基因的ORF序列大小分别为528和1 073 bp,编码175个和357个氨基酸;蛋白分子量分别为19.19和40.46 kD,均属于亲水性不稳定蛋白,其中,Ss WRKY22编码的蛋白属于酸性蛋白,而Ss WRKY33编码的蛋白属于碱性蛋白,亚细胞定位预测两个基因编码的蛋白均定位于细胞核上;此外,SsWRKY22和SsWRKY33分别属于Ⅱ类和Ⅰ类WRKY转录因子,具有不同的蛋白结构。系统发育分析结果表明,Ss WRKY22与野生潘那利番茄、番茄和马铃薯中的WRKY22亲缘关系较近;而Ss WRKY33与辣椒中的WRKY33亲缘关系最近。利用RT-qPCR对SsWRKY22和SsWRKY33基因在蒜芥茄不同部位(根,茎,叶)的表...     

龙眼DlWRKY57基因克隆与拟南芥遗传转化

以龙眼成熟叶片为材料,利用实验室构建的龙眼转录组数据库,筛选出Dl WRKY57基因c DNA序列,对其开放阅读框(ORF)进行克隆和生物信息学分析。结果表明,Dl WRKY57基因ORF长度为894 bp,编码297个氨基酸,此蛋白属于WRKY基因家族中的域a类,存在1个WRKY结合位点。通过生物信息学分析表明,该蛋白属于非跨膜亲水蛋白,预测定位于细胞核,存在45个氨基酸磷酸化位点。其二级结构由无规则卷曲、琢-螺旋和延伸链构成,其中无规则卷曲为二级结构中最主要的结构元件,并且二级结构与三级结构预测结果高度一致。同源基因进化树分析表明该基因与木薯亲缘关系最近。以p MD18-T和p BI121载体为基础,成功构建了植物超表达载体p BI121-Dl WRKY57,利用农杆菌花序法转化拟南芥,经PCR分子检测,获得含Dl WRKY57基因的拟南芥植株,该超表达载体的遗传转化为Dl WRKY57基因功能的深入研究提供依据。     

高粱WRKY家族成员鉴定及生物信息学分析

WRKY转录因子是调控植物生长发育的重要转录因子,本研究利用高粱基因组数据库(v3.1.1),通过生物信息学分析鉴定出97个高粱WRKY基因家族成员,其CDS序列长度为423～4 965 bp,编码氨基酸长度为141～1 655 aa。染色体定位发现97个基因不均匀地分布于10条染色体上,其中3号染色体上数目最多,有23个WRKY基因,6号染色体最少,只有5个WRKY基因。根据WRKY保守结构域和锌指结构的特点对97个转录因子进行分类,可将它们分为Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ三大类,分别有11个、70个和16个成员。另外对WRKY蛋白保守基序分析发现WRKY结构域有3个保守基序组成,各组成员的保守基序基本一致。部分蛋白的WRKY保守域和锌指结构具有多样性,分析发现部分高粱WRKY蛋白的WRKYGQK结构域中‘Q’突变为‘E’、‘S’和‘K’。系统进化关系显示高粱Ⅱ、Ⅲ类WRKY转录因子类聚在Ⅰ的下级分支上,表示Ⅱ和Ⅲ类可能是由Ⅰ类进化而来的。     

MAS育种改良籼稻恢复系R747及其杂交种稻瘟病抗性

为了改良籼稻恢复系R747及其杂交种的稻瘟病抗性,以携带广谱抗稻瘟病基因Pi9的籼稻品系75-1-127为供体亲本,以R747为受体及轮回亲本,利用Pi9基因内功能标记,开展分子标记辅助选择育种实践。获得了如下主要结果:室内接种试验表明,75-1-127与R747对来自国内外不同稻区的24份稻瘟菌菌株的抗菌谱差异显著,抗性频率分别为91.7%和41.7%,两亲本在田间自然病圃苗瘟抗性表现分别为高抗和高感;根据Pi9基因序列信息开发了一个共显性多态标记SPL-1,该标记在75-1-127和R747基因组中分别扩增出一条745 bp和一条850 bp的条带,标记基因型对稻瘟病抗感表型的选择效率为100%;从BC6F3株系中遴选出一个高抗苗瘟的改良恢复系R747-Pi9,并用它与不育系培矮64S、P88S和桃1A分别配制出高抗稻瘟病的杂交种;利用分布于水稻全基因组不同位点的220个SSR标记,分析了改良抗病恢复系R747-Pi9与受体亲本R747的遗传背景差异,结果表明R747-Pi9对R747的背景回复率为0.94。本研究通过分子标记辅助选择和连续回交育种,成功定向改良了恢复系R747及其杂交种的稻瘟病抗性。     

温度对小果博落回种子萌发的影响与血根碱合成基因表达分析

博落回属植物属于罂粟科,包括两个种:博落回Macleaya cordata (Willd.) R. Br.与小果博落回Macleaya microcarpa (Maxim.) Fedde.。博落回属植物中含有一些重要的药用活性成分。一些包含博落回提取物的产品广泛用于饲料添加剂和其他领域。当前对于博落回属植物资源的研究主要集中于博落回,而对小果博落回资源的研究较少。主要是由于小果博落回无菌苗较难获取,使得遗传转化等方面的研究很难进行。本研究在5个不同温度下筛选出小果博落回最优的萌发温度,并且分析了3个不同时期的小果博落回无菌苗中血根碱合成相关基因的表达情况。除此以外,还比较了同一时期的小果博落回与博落回的根、茎、叶组织中的血根碱合成相关基因的表达情况,为下一步小果博落回的资源开发提供了前期研究基础。     

转录组学技术在茶树抗逆性的研究进展

茶树(Camellia sinensis)属山茶科山茶属,是一种重要的木本经济作物,其叶片富含多种活性物质,其中尤以儿茶素、咖啡因、茶氨酸及其他游离氨基酸等活性成分对茶叶品质有重要影响。逆境胁迫是影响茶树生长发育、产量及品质的重要因素,人们对茶树应答逆境胁迫的分子机理越来越关注。转录组学作为功能基因组学的重要组成部分,它从RNA水平上全面研究物种的基因表达情况。利用该技术研究逆境胁迫下茶树基因表达的情况,有利于阐明茶树对逆境胁迫的应答机理。本综述主要介绍应用转录组学技术研究茶树应答生物胁迫和非生物胁迫(干旱,温度,盐碱,重金属等)的进展,以期为茶树抗逆性分子机理的研究提供理论参考。     

组学技术应用于茶树物质代谢研究中的进展

茶树是多年生常绿木本植物,对种质资源进行有效地评价与分析是茶学研究的重要领域,茶树代谢产物如多酚类、咖啡碱、茶氨酸和多糖类等物质不仅是重要的植物天然产物,也是构成茶叶滋味、香气的特征品质成分,被广泛应用于食品、医药等行业。组学技术具有高通量、高灵敏度和系统性的特点,已成为生命科学研究中的强有力工具,也为茶树研究提供了新的方法。茶树系统生物学的研究离不开组学技术的发展,功能基因组学、蛋白质组学、代谢组学等技术已应用于儿茶素、氨基酸、咖啡碱、多糖等重要功能成分的代谢研究。本研究综述了组学技术在茶树物质代谢中的研究进展,对研究中的不足之处进行了阐述,并讨论了组学技术在茶树物质代谢研究中的应用前景。     

马铃薯块茎发育期主要植物激素的动态变化

为了明晰几种主要的植物激素在马铃薯块茎形成中的作用,本研究采用LC-MS/MS法测定了马铃品种‘PB06’及品种‘会-2’块茎发育不同时期叶片、匍匐茎/块茎组织中植物激素ABA、GA3、JA和IAA含量的动态变化。结果显示,随着块茎的发育,匍匐茎/块茎中ABA及JA含量增加;叶片中ABA含量逐渐增加,JA含量先上升后下降,两个品种变化趋势相同。GA3的积累随着匍匐茎的膨大而下降;IAA含量峰值出现在匍匐茎膨大时,并且在之后匍匐茎的膨大中仍然维持高含量水平。表明,IAA及GA3对匍匐茎的伸长是必要的,ABA、JA是诱导块茎形成的正调控因子,GA3为负调控因子。该研究结果对开展植物激素调控块茎形成机理的研究具有重要的支撑作用。     

茶树CCoAOMT基因克隆及启动子的结构分析

茶树咖啡酰辅酶A-O-甲基转移酶(CCoAOMT)是甲基化EGCG生物合成的一种重要酶,为探明CCoAOMT基因的表达调控规律,进一步解析甲基化EGCG生物合成的调控机制。本研究采用同源克隆法获得了茶树CCoAOMT的cDNA全长序列,采用染色体步移技术(Genome walking)获得了该基因的启动子序列,并对其序列进行了生物信息学分析。结果表明,CCo AOMT全长cDNA为1 000 bp,其中开放阅读框长735 bp,编码245个氨基酸,含有caffeoyl-CoA O-methyltransferase和SAM功能结构域;进一步分离得到CCoAOMT基因上游调控序列1 624 bp,发现其含启动子核心元件TATA-box、CAAT-box及5'UTR Py-rich stretch (高水平转录顺式作用元件)、MYB (干旱诱导时的MYB结合位点)、G-box、GAG-motif、GATA-motif、GT1-motif、Sp1 (光响应元件)、CGTCA-motif、TGACG-motif (茉莉酸甲酯响应元件)等重要顺式作用元件。由结果推测,CCoAOMT基因在转录水平受各类转录因子的调控,该结论为进一步研究CCoAOMT基因的转录调控机制提供了理论指导。     

黄金茶CsDAM2基因克隆及其功能分析

休眠是通过植物体内相应基因的表达调控机制,使植物芽停止生长,以适应外界低温、短日照等不良环境条件的结果。茶芽打破休眠的早晚,密切关系到茶树经济生产的效益。为进一步掌握茶树芽休眠与解除的分子机理>本研究克隆了可能与黄金茶发芽早相关的转录因子(dormancy associated MADS-box CsDAM2),并在烟草中过表达CsDAM2,对CsDAM2转基因烟草和野生型烟草进行低温处理。结果表明,在相同处理条件下,随着温度的降低,同野生型烟草比较,转基因烟草电导率增加幅度小,并且叶绿素荧光值降低率低,说明在抗寒性能上,转基因烟草具有显著优势,进而一定程度上证实了 CsDAM2具有提髙茶树抗寒性的作用。本研究结果为进一步揭示茶树芽休眠与解除的分子机理提供了科学依据。     

“Gros Michel”香蕉胚性细胞悬浮系及遗传转化体系的建立

本研究以"Gros Michel"香蕉未成熟雄花序为外植体,建立了其胚性细胞悬浮系及遗传转化体系。结果表明,90 d后可诱导产生浅黄色松散的胚性愈伤组织,经悬浮培养120 d后获得含有均质细胞团的胚性细胞悬浮系(ECS);将3个月龄的ECS置于胚诱导培养基30 d后有大量白色半透明状球形的体细胞胚发生,继代培养60 d后发育为成熟不透明的体细胞胚;将成熟的体胚在萌发培养基上培养10 d后有幼芽产生,转移至生根培养基30 d后得到幼苗。同时开展了含绿色荧光蛋白(GFP)的pCAMBIA0380载体的遗传转化研究,经过3次液体培养基筛选转移至半固体筛选培养基90 d后,在胚萌发培养基和生根培养基中不再添加抗生素。经对转化植株的根尖镜检及PCR鉴定,均为阳性植株。研究结果将为进一步开展"Gros Michel"优质抗病基因功能研究提供材料和技术支撑。     

安吉白茶阶段性白化过程中光合特性的变化

为阐明安吉白茶阶段性白化过程中光合特性的变化,本研究以特殊茶树资源安吉白茶为材料,研究其阶段性白化过程中叶绿体超微结构、光合作用、光合色素和生化成分的变化。结果表明,安吉白茶白化阶段叶绿体发育受阻,已发育的叶绿体超微结构被破坏,复绿阶段则逐渐恢复正常;净光合速率、气孔导度和蒸腾作用在阶段性白化过程中整体呈上升趋势,而在白化期显著下降;胞间CO2浓度在阶段性白化过程中整体呈下降趋势,而在白化期有所升高;光合色素和茶多酚含量在阶段性白化过程中整体逐渐上升,而在白化期显著降低;总氨基酸和茶氨酸含量在阶段性白化过程中整体逐渐下降,而在白化期显著升高。为安吉白茶叶色突变和高氨基酸含量形成机制研究提供了一定的理论基础。     

4个不同苯甲醇含量茶树品种的转录组分析

香气是茶叶品质决定因子之一,苯甲醇作为一种芳香族醇,参与茶叶香气物质形成。本研究选用4个苯甲醇含量不同的茶树品种,分别是‘薮北’(苯甲醇含量低)、‘湘妃翠’、‘牛皮茶’(苯甲醇含量中等)和‘铁香茗’(苯甲醇含量高),通过Illumina Hiseq^TM2000高通量测序技术对上述4种茶树一芽二叶的转录组进行测序,通过Blast搜索比对,共有151 198条Unigene获得了基因注释。4种茶树在新陈代谢路径中注释的基因数最多,其中次生代谢物生物合成和萜类和聚酮化合物代谢途径可能与茶树苯甲醇合成有关,通过对4种茶树样品的Unigene与NR数据库比对,发现5条可能编码茶树苯甲醇合成途径的关键酶β-葡萄糖苷酶基因,这些相关研究为分析茶树香气功能基因提供理论指导,为香气相关候选基因的发掘提供重要依据。