不同水温下重金属镉诱导金属硫蛋白在鲫鱼组织中的表达

以鲫鱼（Carassius auratus）为试验材料,研究了在一定环境条件下重金属镉的胁迫对鲫鱼不同组织中金属硫蛋白（MT）含量的影响。结果表明,平均体长为（15.32±0.63）cm、平均体重为（310.6±5.69）g的鲫鱼不同组织中的MT本底值存在着明显的差异（P〈0.01）,含量顺序为肝脏〉肾脏;不同水温条件下鲫鱼相同组织中的MT本底值差异显著（P〈0.01）,鲫鱼肝脏中的MT本底值平均含量在水温（26.5±1）℃和（16.5±1）℃时分别为3.50和3.25μg.g^-1;肾脏中的MT平均含量分别为3.20和2.72μg.g^-1;不同水温下,经不同的暴露时间、不同暴露浓度的Cd^2＋胁迫下MT在鲫鱼肝脏和肾脏中的表达趋势较为一致,都是呈先升高后稳定的状态,在试验后的6 h内的增加速率最大,MT的含量在12 h时达到峰值。鲫鱼的肝脏和肾脏组织在12 h内MT的增加量与Cd^2＋的浓度呈较好的相关性,表现出一定的剂量-效应关系,表明水体中的Cd^2＋可诱导鲫鱼组织中MT的合成与表达,且主要诱导时间在12 h之内。相同Cd^2＋质量浓度胁迫下,水温的改变不影响Cd^2＋胁迫MT在鲫鱼组织中的表达趋势,但影响MT表达的含量和速率,相同Cd^2＋质量浓度下MT在鲫鱼组织中的表达含量和速率均随水温的升高而增加。     

金属硫蛋白作为重金属污染生物标志物的研究进展

金属硫蛋白（MT）是一类普遍存在于生物体内的低分子量、富含半胱氨酸、热稳定性、可诱导型非酶蛋白,具有维持生物体内金属含量动态平衡和重金属解毒作用双重机制。大量研究表明,MT可作为重金属污染的生物标志物,用来预测生物体受重金属暴露的状况和重金属污染的压力,且对制定预防性的管理措施、及时监控环境污染皆具有重要的现实意义。本文根据国内外文献资料查阅及综合分析,主要阐述了金属硫蛋白的基本结构、多态性、生理功能及其作为生物标志物在环境污染检测与诊断方面的研究与应用,并展望其今后研究方向。     

植物金属硫蛋白的研究进展

金属硫蛋白是一类低分子量、富含半胱氨酸的金属结合蛋白，随着植物分子生物学的发展，植物金属硫蛋白研究越来越热。本文就其分类、多态性、特性、空间结构、功能以及表达特点逐一综逆．并对其应用前景进行了展望。     

猪肝金属硫蛋白的诱导效果

用ZnSO4经腹腔注射诱导,比较研究了不同诱导次数和剂量对猪肝金属硫蛋白的合成量的影响。结果表明:经5次锌的总剂量为330mg/kg体重诱导,金属硫蛋白的合成量显著高于3次锌的总剂量为80mg/kg体重诱导的合成量(P<0.05),但与诱导7次,锌总剂量为780mg/kg体重比合成量差异不显著。     

籽粒苋类II型金属硫蛋白基因的分离及其表达分析

Metallothioneins (MTs) are a group of small,Cys-rich, metal-binding proteins. Plant MTs are divided into two types based predominantly upon the arrangement of Cys residues: those only containing the Cys-Xaa-Cys (Xaa is an amino acid other than Cys)metal-binding motif (type 1) and those containing a combination of the Cys-Cys,Cys-Xaa-Cys and Cys-Xaa-Xaa-Cys motifs (type 2).Both type 1 and type 2 contain two Cys-rich MT-like amino- and carboxyl-terminal domains separated by a central region of about 40 residues which is devoid of Cys (Robinson et al.,1993).Here we report a type 2 MT from amaranth.     

天祝白牦牛金属硫蛋白基因(MT-1)全序列分子克隆及生物信息学分析

金属硫蛋白-1基因(metallothionein-1,MT-1)是一类广泛存在于动物体内的金属结合蛋白,除维持金属动态平衡和重金属解毒外,还可参与清除自由基、拮抗电离辐射和抗应激等。为深入研究MT-1基因参与动物机体抗逆性的分子机制,本研究采用RT-PCR和RACE(rapid amplification of cDNA ends,RACE)技术获得天祝白牦牛(Bos grunneins)MT-1基因全长cDNA序列,运用生物信息学方法分析MT-1蛋白的理化性质、结构和不同物种间的同源性,并利用RT-qPCR方法分析MT-1基因在天祝白牦牛各个脏器和组织中的表达丰度。结果表明,天祝白牦牛MT-1基因cDNA序列全长为408 bp(GenBank登录号:KF770836),开放阅读框(ORF)长186 bp,编码61个氨基酸,氨基酸的分子量为5.981 kD;氨基酸序列分析显示,天祝白牦牛MT-1基因编码氨基酸序列与牛(Bos taurus)的同源性高达100%,同时与大多数哺乳动物相似;荧光定量PCR结果发现,MT-1 mRNA在天祝白牦牛8个不同脏器和组织中均有表达,心脏中表达量最高。天祝白牦牛MT-1基因的成功克隆为进一步研究该基因的功能提供了基础资料。     

商陆抗病毒蛋白基因转化芥菜的获得及抗性研究

以芥菜(Brassica Juncea Coss.)的子叶为外植体,通过根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)的介导,将商陆抗病毒蛋白基因PAP导入到芥菜中。对所获得的40株抗性植株进行PCR扩增,其中阳性植株为29株;Southern blot分析结果证明PAP基因已被整合到芥菜基因组中,在大多数转基因植株中外源基因呈单拷贝,少数为双拷贝;Northern blot分析结果表明,PAP在转基因植株中正常表达。转基因植株接种病毒试验初步结果表明,转PAP基因的植株对芜菁花叶病毒TuMV的侵染有一定的抑制作用。     

Pt-mVirD2-GUS质体蛋白编码基因的合成及转化烟草的研究

将拟南芥冷调节基因AtCor15A的质体定位信号肽编码序列、丧失了核定位信号序列的根癌农杆菌VirD2基因突变序列mVirD2和GUS基因序列,拼接成pt-mVirD2-GUS嵌合基因,由CaMV 35S启动子和Tons终止子控制,并经根癌农杆菌介导,成功导入了烟草基因组.     

转CBF1基因烟草植株的花器官变异及其插入区侧翼序列的分析

在转CBF1基因烟草的后代中发现了花器官变异的植株，主要有花瓣裂瓣、花型变小、花丝变短花粉萌发率降低和育性降低等表型变化。采用TAIL－PCR方法，从花器官变异明显和不明显的植株中分别克隆到了各自的T－DNA插入区域的侧翼序列。将这些侧翼序列与GenBank database及pBI121质粒进行比对。结果表明表型差异明显的2个植株的T－DNA插入位点相同，属于一个转基因株系；且T－DNA插入区位于烟草基因组的非编码区。说明这些花型的变异并非由T－DNA在受体基因组中插入位点不同造成的，也不是由外源转基因对受体功能基因的破坏引起的。     

Introduction of Yeast Metallothionein Gene (CUP1) into Plant and Evaluation of Heavy Metal Tolerance of Transgenic Plant at the Callus Stage

For phytoremediation, it is necessary to use plants with a large biomass and ability to absorb and accumulate heavy metals. Attempts were made to produce heavy metal-tolerant plants by introducing a metallothionein gene, CUP 1, into plants with a large biomass. In the present study, we evaluated the heavy metal tolerance of sunflower plants at the callus stage in terms of 2,3,5-triphenyl-tetrazolium chloride (TTC)-reducing activity, measured the mRNA expression level of the introduced gene, and selected tolerant clones. The transgenic calli of several strains showed a high TTC-reducing activity even after treatment with Cd 200 μM for 10 d. In the transgenic calli of a few strains, which showed a low TTC-reducing activity, the amount of metallothionein was lower than that in the other transgenic strains. Conversely, some transgenic calli with a high TTC-reducing activity expressed a much higher amount of mRNA of the introduced gene.     

棉花农杆菌基因转化体系的优化和转苜蓿抗菌肽基因(alfAFP)植株的获得

为了优化根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导的棉花(Gossypium hirsutumL.)下胚轴切段的基因转化体系,以苜蓿(Medicago sativa L.)抗菌肽基因(alflafa antifungul peptide,alfAFP)为目标,利用γ-葡萄糖甘酸酶基因(gus)和潮霉素抗性基因(Hpt)的检测方法,分析了根癌农杆菌菌种、菌液浓度、浸染下胚轴的时间、共培养中乙酰丁香酮(AS)的浓度、共培养温度和时间等因子对基因转化的影响.优化分析表明,用农杆菌菌株LBA4404,当OD_(600)值为0.5～0.7的菌液浸染5～7日龄的棉花无菌苗下胚轴切段10～15 min.在含200 μmol/L AS的共培养基中21℃暗培养60h,可更有效地提高转化率.经上述条件处理的下胚轴在含50 mg/L潮霉素的愈伤诱导培养基上培养3周可产生转化率最高的愈伤组织.愈伤组织经分化培养获得15株再生棉花,经过PCR和PCR-Southern分析.发现其中12株含有外源基因alfAFP.     

抗青枯病转群体感应猝灭基因烟草的培育

利用具有猝灭青枯菌群体感应信号分子功能的aac基因构建高效植物表达载体,通过农杆菌介导的方法转化烟草,获得了卡那霉素抗性植株57株。经PCR及RT-PCR检测,筛选得到30株阳性转基因再生苗,并证实了目的基因已经整合到烟草基因组中,且在转录水平上得到表达。转基因植株苗期抗青枯病试验表明,16天后转基因烟草较对照植株病情指数降低了51,相对病情指数为56.5％。     

PchsA驱动的烟草orf25基因表达载体构建及遗传转化

为研究orf25基因的功能及其与烟草雄性不育性的相关性,通过PCR方法从质粒p UC57-Pchs A中扩增了花特异性启动子Pchs A,并以其取代植物表达载体p BI121中的组成型启动子Ca MV35S,然后将orf25基因插入到Pchs A启动子下游,构建由Pchs A启动子驱动的orf25基因表达载体,测序结果显示植物表达载体p BI121-Pchs A-orf25构建成功。将该表达载体导入根癌农杆菌LBA4404中,采用根癌农杆菌介导法遗传转化雄性不育烟草MS革新3号,共获得76株转基因烟草植株,经PCR鉴定,转基因阳性植株为18株,转化率为23.7%。研究结果证明目的基因orf25已整合到烟草基因组中,为进一步探究该基因的功能及其与烟草雄性不育性的关系奠定了基础。     

白藜芦醇合成酶(RS)基因转化胡萝卜及高白藜芦醇转基因胡萝卜株系的筛选

白藜芦醇是具有抗病及多种保健功能的芪类次生代谢物,胡萝卜(Daucus carota var.sativa)则是富含β胡萝卜素等多种营养成分的重要蔬菜。研究着眼于创建具有白藜芦醇保健功能的胡萝卜新种质资源,在对葡萄(Vitis vinifera L.)白藜芦醇合成酶(resveratrol synthase,RS)基因在胡萝卜中高效表达的密码子优化基础上构建无潮霉素磷酸转移酶(HPT)抗性基因的转化载体pCB-RS-hyg-,应用根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导法将pCB和pCB-RS-hyg-共转化到胡萝卜并获得再生植株。经过T0、T1和T2代的逐代筛选,获得2个白藜芦醇含量较高(11.34和15.23mg/g)的转基因胡萝卜株系。     

Vigna radiata var. GM4 Plant Growth Enhancement and Root Colonization by a Multi-Metal-Resistant Plant GrowthPromoting Bacterium Enterobacter sp. C1D in Cr(VI)-Amended Soils

Contamination of agricultural soils by heavy metals has become a major concern due to their toxic effects on plant growth, symbiosis and consequently the yields of crops. In the present study, to enhance plant growth in Cr(VI)-amended soils, novel metalresistant plant growth-promoting bacteria (PGPB) were isolated from a soil contaminated with industrial waste effluent. One of the bacterial isolates, identified as Enterobacter sp. C1D by 16S rRNA gene sequencing, was found to be multi-metal resistant in nature with excellent plant growth-promoting (PGP) traits. Mung bean (Vigna radiata var. GM4) inoculation with Enterobacter sp. C1D significantly (P < 0.01) increased root and shoot length, shoot and root weight, and chlorophyll content in a range of Cr(VI) treatments. Plant tolerance towards Cr(VI) measured as effective concentration showed higher values with Enterobacter sp. C1Dtreated plants compared to un-inoculated plants. Root colonization study was also carried out using green fluorescence protein-labeled Enterobacter sp. C1D under a hydroponic system. Confocal laser scanning microscopy of the plant roots showed heavy bacterial loads on the surface of the plant root specifically at the root tip and the point of root hair/lateral root formation. The results of PGP traits showed that elevated indole acetic acid levels and 1-aminocyclopropane-1-carboxylate deaminase activity enabled Enterobacter sp. C1D to enhance V. radiata growth in Cr(VI)-amended soils, whereby it significantly increased plant tolerance towards elevated Cr(VI) concentrations.     

根癌农杆菌介导的转录因子DREB1A基因在地被菊花中的遗传转化

以地被菊花（Dendranthema grandiflomm cv．White Snow）无菌苗叶片为外植体，在附加不同浓度植物生长调节剂的MS基础培养基上诱导培养，通过器官直接发生途径获得再生植株。结果表明，2．0mg/L 6-BA和0．2mg/L NAA组合可获得93．8％的再生芽。将含拟南芥（Arabidopsis thaliana）逆境诱导转录因子DREB1A基因的植物表达载体pBI-DREB1A导入根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）LBA4404，农杆菌介导法遗传转化地被菊花White Snow叶盘，经PCR和PCR—Southem检测，DREB1A基因已整合到转化植株的基因组中。遗传转化过程中，预培养2d后，将OD600=0．5～0．7的根癌农杆菌稀释30倍后侵染叶盘10min，再共培养2d，有利于获得最高遗传转化效率。     

转5-烯醇式丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶(EPSPS)基因抗草甘膦烟草和棉花的获得

以从抗草甘膦的荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)G2中克隆的、并按双子叶植物偏爱密码子改造的5-烯醇式丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶(EPSPS)基因aroAG2M为目的基因,用菊花Rubisco小亚基的启动子驱动,在基因的5'端加叶绿体定位信号肽,构建植物表达载体。用根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导的叶盘法转化烟草(Nicotiana tabacum)获得转基因植株,PCR检测表明,外源基因已整合到烟草基因组中。转基因和非转基因植株6～8叶龄苗的叶片涂抹不同浓度的草甘膦异丙胺盐,表明转基因植株可抗4‰浓度的草甘膦,而非转基因对照植株则在2‰草甘膦时即死亡。花粉管通道法转化棉花(Gossypium hirsutum),得到3株具有草甘膦抗性的转基因植株,PCR和Southern检测显示,外源基因已整合到棉花基因组中,田间喷洒草甘膦异丙胺盐水剂,表明T1代转基因植株具有草甘膦抗性。     

小油桐外植体的KN1基因遗传转化及其超量表达的转基因植株

本研究采用农杆菌介导法将KN1基因遗传转化小油桐,并获得了转基因植株。在研究中分析了农杆菌菌液菌液的浓度、侵染时间和外植体的大小对遗传转化效率的影响以及KN1基因超量表达对转基因植株再生的影响。研究结果表明：以苗龄15d左右的小油桐无菌苗子叶为外植体,农杆菌菌液浓度OD600为0.6～0.8时,侵染8min,外植体大小为（0.8×0.8）～（1.0×1.0）mm时,遗传转化效果最好;对抗性芽及再生植株进行GUS及PCR检测结果表明,KN1基因已经整合到小油桐植物基因组中。KN1基因的超量表达可提高小油桐再生芽分化,影响转化芽及植株的外观形态及叶片的表型,包括芽及植株矮小,茎杆粗壮;叶片缩小,边缘分裂,对称性丧失,无子叶柄等。