甘蓝型油菜异分支酸合酶基因的克隆及信号通路相关基因的诱导表达

为了解异分支酸合酶1(ICS1,水杨酸合成的限速酶)在甘蓝型油菜抗病过程中的功能,以甘蓝型油菜耐菌核病品种宁RS-1为材料,在核盘菌侵染时,研究甘蓝型油菜ICS1基因和水杨酸信号通路相关基因的诱导表达。首先利用同源序列法克隆得到宁RS-1中ICS1基因的c DNA序列,命名为Bn ICS1。Bn ICS1序列全长1 719bp,编码572个氨基酸残基,含有1个分支酸结合域。表明油菜中也存在异分支酸途径。接种核盘菌前、后及不同时期荧光实时定量PCR结果发现Bn ICS1在核盘菌接种后6hpi(接种后6h)表达量升高,但是24hpi后降低;而MPK4基因的表达量在6hpi降低,24hpi后升高,说明SA合成先是被核盘菌诱导,但随后又被抑制。EDS5基因和PR1基因表达量从接种后6hpi持续升高,而PDF1.2基因的表达量不断降低,说明SA信号通路最终受核盘菌诱导形成病斑,而茉莉酸途径及其诱导的植物防御反应受到抑制。     

甘蓝型油菜-核盘菌酵母双杂交cDNA文库构建及BnJar1互作蛋白筛选

油菜与核盘菌相互作用的过程中，JA（茉莉酸）合成相关基因表达量升高，但是JA信号传递却受到了抑制，推测核盘菌分泌的效应蛋白可能直接或间接作用于JAR1蛋白，使其活性降低，从而抑制依赖JA途径的油菜防御系统。前期通过转录组测序获得了差异表达基因BnJar1全长序列，为进一步揭示BnJar1基因参与油菜-核盘菌相互作用过程的机理，本研究对BnJAR1蛋白进行生物信息学分析和预测，构建了核盘菌-油菜互作表达基因酵母文库，并以BnJar1作为诱饵蛋白对文库进行酵母双杂交筛选，获得了5个来自油菜的互作蛋白：丙二烯氧化物环化酶2(BnAOC2)、COP9信号复合物（BnCOP9）、4a-羟基四氢生物蝶呤脱水酶（BnDcoH）、腈水解酶2(BnNIT2)和茎特异性蛋白（BnTSJT1）;2个来自核盘菌的互作蛋白：MFS结构域蛋白（SsMFS）和Rho3 GTP酶（SsRho3）。相关结果为研究油菜-核盘菌的相互作用，挖掘致病或抗病相关基因，进一步解析其机理奠定了基础。     

甘蓝型油菜BnERF50的超表达增强了转基因拟南芥对核盘菌的抗性

从接种核盘菌(Sclerotinia sclerotiorum)后的甘蓝型油菜品种中双9号cDNA芯片中筛选出一个新的抗性相关基因BnERF50。序列分析表明该基因产物BnERF50蛋白含有一个典型的ERF(乙烯相应转录因子)保守结构域,属于ERF家族成员。接种核盘菌24h后,该基因的表达量被诱导显著上调。在它的超表达转基因拟南芥中,病原相关蛋白(PR)防御素基因PDF1.2和几丁质酶基因ChiB的表达量升高,对腐生营养型真菌核盘菌的抗性显著增强。     

海南蒟cDNA文库的构建及评价

全长cDNA文库构建是改良胡椒性状的分子机理研究基础,有助于重要相关基因的克隆、功能分析、调控及其利用.以性状优良并具代表性的海南蒟(Piper hainanense)为试材,采用优化的In-Fusion SMARTerTM Directional cDNA Library Construction Kit技术,构建叶片材料的全长cDNA文库.结果表明:文库的滴度为2.0×106 cfu/mL,文库容量为1.3×106 cfu.从文库中随机挑取20个克隆进行质粒DNA提取、PCR及酶切鉴定,结果显示:插入片段大小为1.0～2.0 kb,重组率为100％,表明该文库质量较高,可满足后续研究需要.     

应用抑制消减杂交技术 构建花生果皮差异表达文库

为构建花生果皮差异表达基因消减文库，分离花生果皮差异表达cDNA片段，本研究采用抑制消减杂交技术，以花生种仁cDNA为Driver，果皮cDNA为Tester，进行两次消减杂交和两次抑制性PCR，将第二次PCR产物与pGEM-T easy 载体相连，电击转化大肠杆菌，成功构建果皮差异表达cDNA文库。所长出菌落中89.2%为白色克隆。采用PCR法对重组子进行鉴定，发现其中单一扩增条带的克隆约占83.5%， 片段大小集中分布于250～750bp之间。     

甘蓝型油菜全基因组cDNA FOX-hunting过表达文库构建

为系统解析甘蓝型油菜基因功能,结合FOX-hunting和Gateway重组技术,以4种激素和4种非生物胁迫处理的甘蓝型油菜幼苗根和叶片及成熟期种子和角果全长cDNA为混样,构建了全长cDNA FOX-hunting过表达文库。经检测,初级文库滴度为3.0×106,库容为1.2×107CFU;次级FOX-hunting过表达文库滴度为2.6×106,库容为1.04×107CFU。次级文库菌液PCR鉴定表明,阳性克隆率为96%,扩增均为250～3000 bp随机分布的单一条带,表明初级文库已较好地重组到pJVC55载体上。农杆菌转化后的克隆测序发现,140个克隆中有12个克隆为非特异扩增。GO富集分析发现剩余128个基因中,除21个基因功能富集于光合作用途径外,其余基因在转录因子和激酶中随机分布,且功能涉及器官发育、物质代谢和胁迫响应等多个方面。上述结果表明,本研究构建的甘蓝型油菜FOX-hunting过表达文库无功能偏向性、多态性丰富、完整性高,可作为油菜功能基因组的研究基础。     

巴西橡胶树低温诱导全长cDNA文库构建

通过低温诱导处理巴西橡胶树(Hevea brasiliensis)品系93-114幼嫩枝条和树叶,提取总RNA,并分离纯化mRNA.利用SMART技术合成橡胶树全长cDNA,经过Sfi I酶切后连接到pDNR-LIB载体中,得到全长cDNA文库.文库库容为1.4×106,重组率达到100%.挑取单菌落提取质粒并酶切鉴定,插入片断分布在0.3～2 kb之间,平均大小为1 kb左右,表明该文库质量合格,可用于全长基因的筛选.     

甘蓝型油菜MAP激酶4的序列及其诱导表达分析

拟南芥MPK4（AtMPK4）在病害抗性中具有重要作用。本文克隆和分析了油菜MPK4（BnMPK4）的cDNA及其氨基酸序列和诱导表达变化。推导的氨基酸序列含有T201E202Y203磷酸化位点和CD锚定区域,与AtMPK4的序列相似性为95%。用化学物质苯丙噻重氮、甲基茉莉酸、草酸以及核盘菌（Sclerotinia sclerotiorum）分别处理油菜品种中双9号,采用荧光定量PCR方法测定BnMPK4在各诱导或处理后的表达量。结果表明,苯丙噻重氮快速诱导该基因的表达,甲基茉莉酸抑制其表达;草酸和核盘菌均快速诱导该基因上调表达,并且二者的上调表达趋势相似。结果表明油菜MPK4可能在油菜菌核病防卫反应中起作用。     

花生球蛋白基因片段的克隆

为克隆花生贮藏蛋白基因建立了花生未成熟种子的cDNA文库。根据大豆贮藏蛋白的保守区设计特异引物，从花生cDNA文库中扩增出450bp的特异性产物。经过测序分析表明与大豆球蛋白各亚基基因的同源性均达90％以上，说明已得到花生球蛋白基因的cDNA片段。该片段可以作为探针从cDNA文库中筛选花生球蛋白基因的cDNA全序列。     

干旱胁迫的水稻根高效酵母双杂交体系建立

采用SMART技术在酵母菌株AH109中构建了干旱胁迫下水稻根部全长cDNA文库,采用改进的滤膜杂交方法建立了高效酵母杂交体系,以抗旱相关水稻转录调控因子OsWRKY71基因作为诱饵对该方法进行检验。实验获得的酵母杂交文库容量为4.9×106,平均插入片段为800bp,达到了基因分离和克隆等后续研究的标准。同时采用滤膜杂交法将文库的杂交效率提高到了6.9%,是液体杂交法的6倍以上。该方法不需要特殊的设备,且具有低消耗和高效率的特点,可用于高通量酵母双杂交分析。     

橡胶树HbDHN1基因克隆及表达分析

采用Macroarray印迹杂交技术从本实验室构建的橡胶树机械伤害诱导的树皮抑制性差减杂交(SSH)cDNA文库中检测到1个差异表达EST.采用RT-PCR和RACE技术获得了该基因全长cDNA序列,包括124 bp的5'端非编码区,337 bp的3'端非编码区和1个编码224个氨基酸的开放阅读框.该cDNA编码的蛋白具有植物脱水素蛋白的特征性结构,属于SK2类脱水素蛋白.命名为H6DDHN1,与其它植物的SK2类脱水素蛋白具有49.0%～68.2%的氨基酸序列同源性.RT-PCR分析表明,机械伤害对HbDHN1基因的表达没有明显影响,受伤组织的脱水显著上调该基因的表达.     

感染高粱花叶病毒甘蔗叶片cDNA文库构建及评价

为了研究甘蔗花叶病与甘蔗寄主致病的互作分子机制,利用SMART技术成功构建了感染高梁花叶病毒甘蔗叶片的cDNA文库,用于后续酵母双杂交互作蛋白筛选试验.采用Omega公司Plant RNA Kit提取感染高粱花叶病毒甘蔗叶片总RNA,经过Oligotex纯化获得mRNA,将其反转录成cDNA第一链,再在DNA聚合酶作用下,通过长距离PCR扩增双链cDNA.经SfiI酶切并去除短片段后,连接到pGADT7-SfiI载体上,成功获得初级cDNA文库,最后以初级文库100万克隆为基数扩增,得到扩增文库并提取质粒.经检测构建的文库容量为1.6×106 cfu,文库滴度2.2× 106 cfu/mL,文库cDNA插入片段长度主要分布在700～2 000 bp,文库重组率约为96％.结果表明,该文库质量较好,为筛选分离抗病功能基因及开展寄主与病毒互作的研究奠定了基础.     

接种PRSV番木瓜种苗胞质酵母双杂交cDNA文库的构建与分析

利用Trizol法提取接种PRsv 4 d的番木瓜种苗总RNA,分离纯化mRNA,反转录合成双链cDNA,双链cDNA末端经Pfu-DNA聚合酶补平,与EcoR I接头连接,XhoI酶切消化产生粘端.用Sepharose CL-2B柱分离纯化去除小分子cDNA片段,再与pMyr酵母表达载体连接,转化受体菌XL10-Gold,构建了接种PRSV番木瓜种苗胞质酵母双杂交cDNA文库.所获得的原始文库的克隆总数为1.8×106cfu,重组率为100%,文库滴度为2.6×109cfu/mL.对随机选取的34个克隆进行PCR鉴定,结果表明插入片段长度均大于O.5 kb且集中在1 kb左右.文库质量鉴定结果表明,该文库具有较好的库容量、较高的重组率以及较大的插入片段.     

辣椒Rop cDNA分离及其序列分析

从cDNA文库中分离获得1个cDNA阳性克隆,测序和序列分析结果表明,其长度为1141 bp,含有1个长度为197 aa的开放读码框架,与烟草等植物的Rop有较高的同源性,该cDNA是从UV处理的辣椒cDNA文库中分离获得的,可能与辣椒适应UV辐射胁迫有关.该cDNA的分离为进一步研究其在辣椒适应UV辐射防御反应的分子机理研究奠定了重要的基础.     

甘蓝型油菜矮化突变体抑制消减cDNA文库 的构建及初步分析

采用抑制性消减杂交(suppression subtractive hybridization, SSH)技术，以甘蓝型油菜矮化突变体“NDF-1”为实验方（tester），野生型“3529”为驱动方（driver）构建植株差异表达的抑制消减cDNA文库。所建cDNA文库的插入片段大小主要集中在100 bp~1000 bp之间。斑点杂交筛选得到了32个阳性克隆，序列测定和同源性对比分析表明，其中的12个克隆功能未知，其余涉及到激素信号转导、第二信使、光合作用、脂肪酸代谢及衰老等多个方面。还对部分差异表达基因的功能进行了分析。为进一步认识油菜植株矮化的机理奠定了基础。