油菜种子特异表达启动子NAPIN的功能鉴定

构建了在油菜中新克隆的种子特异表达启动子NAPIN驱动GUS的植物表达载体pB1121 NAPIN-BAR,并利用真空渗透法转入拟南芥基因组中.转基因拟南芥后代卡那霉素抗性发生分离,选取具有3:1分离比的后代自交,产生纯合的具有单拷贝插入的后代,并通过PCR确认有植物表达载体特有的BAR基因启动子35S序列的插入.转基因后代GUS染色结果表明,GUS染色主要出现在角果皮位置,幼苗期只有子叶能被染色.新克隆的NAPIN启动子控制基因只在和种子有关的部位和种子衍生的部位表达.     

一个水稻小热休克蛋白基因的克隆和鉴定

小分子热休克蛋白(SHSP)广泛存在于各类生物体中且在生物发育和逆境响应过程中发挥重要作用。我们克隆了一个水稻小热休克蛋白基因(OsSHSP17.6),序列分析表明该基因编码区为477bp,可编码一个含158个氨基酸的多肽,分子量约17.6kD。序列分析显示该类SHSP在不同的植物中是保守的,在分类上隶属于CI类。实时定量RT-PCR分析显示热激处理可显著增强该基因的转录;Western blotting分析显示该蛋白大小与预期一致,且其含量在热激处理时大幅度增加。这些结果一致表明OsSHSP17.6可能参与了水稻热应激反应,这为进一步鉴定OsSHSP17.6的功能提供了基础。     

一个花生早期胚特异性表达基因AhDGAT3启动子的克隆及功能分析

为获得在早期胚中特异性表达启动子,本研究通过基因组步移技术对AhDGAT3（GenBank: AY875644.1）的启动子进行克隆。研究结果表明,获得了AhDGAT3 起始密码子ATG上游 5´侧翼序列2181 bp,应用PLACE和plantCARE在线分析显示,AhDGAT3启动子除了含有核心调控元件TATA-box和CAAT-box之外,还有多个非生物胁迫作用元件,如茉莉酸响应元件、防御和干旱胁迫响应元件TC-rich repeats、光响应元件、干旱诱导的MYB结合位点、光响应MYB结合位点等之外,还包含种子表达相关顺式作用元件及分裂组织表达相关元件。构建重组载体pBI121-PAhDGAT3,转化拟南芥,GUS染色结果显示,该启动子能驱动下游GUS基因,仅在发育早期的心型胚期至鱼雷型胚期较短时间内的胚中特异性表达。     

玉米醇溶蛋白ze19基因启动子克隆与功能分析

从玉米自交系9801基因组DNA中克隆玉米醇溶蛋白基因ze19启动子,将其克隆到pMD18-T载体上.该序列与发表序列同源性为94％,包括TATA box、CAAT box启动子基本元件以及多种参与调节醇溶蛋白表达的顺式元件.将ze19启动子取代质粒PBI 121-gus中的CaMV35S启动子,构建由ze19启动子驱动GUS的植物表达载体pBIze19-gus,利用土壤杆菌介导法将重组载体pBIze19-gus转入烟草中.对转基因烟草植株GUS活性的定性与定量分析结果表明,ze19启动子驱动GUS基因在转基因烟草种子中表达活性最高,在叶片中活性很弱,在茎中没有活性.所克隆的ze19启动子具有种子特异表达特性,为玉米种子生物反应器的研究提供借鉴.     

甘蓝型油菜GPAT6基因启动子的克隆与表达载体构建

通过同源PCR克隆的方法,首次从甘蓝型油菜中克隆了甘油-3-磷酸酰基转移酶6（sn-glycerol-3-phosphate acyltransferase6,GPAT6）基因长1110bp的启动子,并将其成功构建到植物表达载体pBI121上.重组载体可用于转化拟南芥,探究甘蓝型油菜GPAT6基因的组织表达特征.     

甘蓝型油菜BnLEC1.A07 基因启动子在不同含油量品系中的克隆与活性分析

为了进一步研究BnLEC1基因对油脂生物合成的影响,以高油品系61616和低油品系51070为材料,进行了转录组和定量PCR分析。结果表明,BnLEC1.A07基因在61616品系中的表达水平明显高于51070品系。对启动子P_(LEC1)61616(1829 bp)和P_(LEC1)51070(1824 bp)进行了克隆和序列比较。结果表明,两个启动子之间存在大量的SNP和InDel,其中以单碱基SNP最为丰富。顺式作用元件分析表明,P_(LEC1)61616比P_(LEC1)51070多1个CAAT-box和2个茉莉酸反应元件,缺少1个细胞周期调控元件和2个非生物胁迫反应元件。随后我们构建了包含该启动子的GUS融合载体和LUC融合载体。烟草叶片瞬时转化后的GUS染色、LUC荧光显像和荧光素酶活性分析显示,P_(LEC1)61616的活性高于P_(LEC1)51070。综合结果表明,BnLEC1.A07基因在不同品系中的表达水平与其含油量呈正相关,P_(LEC1)61616比P_(LEC1)51070具有更强的启动子活性。本研究为进一步探讨脂肪合成基因BnLEC1.A07在不同油菜品系中的调控机制提供了理论依据。     

GUS报告基因在植物功能基因研究中的应用

近十年来,植物转基因技术取得了显著的进展,许多转基因植物不断问世,其中报告基因GUS在基因工程和遗传转化中发挥着重要的作用。就GUS基因的来源,GUS基因在转基因植物中的表达,GUS活性的测定方法,GUS基因转基因安全评价,GUS基因应用的最新进展作了简要综述。     

大豆GmPR10基因启动子的克隆及序列分析

GmPR10基因是病程相关蛋白PR10(pathogenesis-related proteins 10)在大豆中的同源基因。为探明大豆GmPR10基因的表达调控规律,应用PCR技术从大豆抗疫霉根腐病品种绥农10号中克隆了GmPR10基因上游2 235 bp的启动子序列pGmPR10,定向替换pBI121载体的CaMV35S组成型启动子,构建植物表达载体pBI121/pGmPR10/GUS,并转化农杆菌侵染烟草叶盘。GUS染色结果表明,pGmPR10受聚乙二醇(PEG)、低温(4℃)、水杨酸(SA)、茉莉酸(JA)和脱落酸(ABA)诱导表达,因此推测GmPR10基因可能参与植物激素调节植物生长发育的过程,以及生物胁迫和非生物胁迫条件下植物对环境响应的过程。此外,利用PLACE和Plant CARE在线启动子预测工具分析pGmPR10,结果表明:pGmPR10含有启动子的一般结构TATA-box和CAAT-box,光应答元件,生长素和细胞分裂素响应元件,热激元件,低温应答元件,干旱应答元件以及ABA、SA、JA应答元件等。     

大豆GmGAMYB1启动子克隆与分析

利用PCR技术从大豆品种东农42基因组中分离得到了GmGAMYB1基因启动子片段pGmGAMYB1,定向替换载体pBI121的CAMV35S组成型启动子,构建表达载体pBI121-pGmGAMYB1,驱动下游报告基因GUS基因表达,并利用PLACE和PlantCARE在线启动子预测工具进行分析.结果表明:序列中含有多种典型的光及各种激素和胁迫诱导特异性表达元件,如光应答元件如3-AF1 binding site、BOX-4、T-Box和TCT-motif;赤霉素应答元件GARE;脱落酸应答元件ABRE;热激元件CCAATBox;节律钟Ciradian等.     

大豆GmbZIP33基因启动子的克隆及瞬时表达分析

启动子作为基因调控的重要元件,决定着下游基因表达的时空和强度特性。为研究大豆GmbZIP33基因启动子功能,在前期克隆获得GmbZIP33基因(Glyma.03G219300.1)序列的基础上,通过N-PCR(nested PCR)技术克隆了GmbZIP33 CDS上游启动子区序列(2 316 bp)。利用PlantCARE在线分析软件进行顺式作用元件的预测,发现该序列上除含有TATA-box和CAAT-box等核心调控元件外,同时包括与抗逆、光响应、激素响应、蔗糖应答元件和多个与组织特异性表达相关的元件。为研究GmbZIP33启动子的表达调控特性,构建了该启动子调控报告基因GUS表达的载体,并利用农杆菌介导的花序浸染法将其转入拟南芥中,发现该启动子驱动下的GUS基因在不同组织(莲座叶、花、荚果和根)的维管束中均特异性表达;对转基因拟南芥进行实时荧光定量PCR检测发现,GUS基因在花中表达量最高,荚果中次之,表明GmbZIP33基因可能受到多种因素和蔗糖的调节并参与花荚发育的调控。     

甘蓝型油菜BAN同源基因片段克隆与序列分析

参照拟南芥（Arabidopsis thaliana)BAN基因和cDNA的保守序列设计引物，对甘蓝型、白菜型、芥菜型油菜和拟南芥及其它十字花科栽培品种的基因组总DNA进行PCR扩增，均获得与拟南芥BAN基因扩增片段大小极其相似的PCR扩增产物，表明BAN基因可能广泛存在于十字花科植物中。甘蓝型油菜和拟南芥BAN扩增片段测序比较分析显示，拟南芥BAN片段（779bp)与已往的报道完全相同，甘蓝型油菜的BAN片段（780bp)与拟南芥BAN外显子的同源性为90％，但与内含子的同源性仅为74％。甘蓝型油菜BAN氨基酸序列与80多种植物的NADPH还原酶类有不同程度的同源性。     

甘蓝型油菜BnADC基因的克隆及原核表达

利用同源克隆和RACE(Rapid amplification of cDNA ends)技术从甘蓝型油菜中克隆到精氨酸脱羧酶(Arginine decarboxylase,ADC)基因cDNA全长序列,命名为BnADC。BnADC全长为2 649bp,包含344bp的5′非翻译区(5′ Untranslated region,5′-UTR)、226bp的3′非翻译区(3′ Untranslated region,3′-UTR)和2 079bp的完整开放阅读框(open reading frame,ORF),编码75.1kD的蛋白质。5′-UTR中含有12bp的uORF (Upstream open reading frame),编码MIRE 4个氨基酸。氨基酸同源性比对表明,BnADC蛋白与其他植物ADC蛋白具有很高的相似性,与芥菜的同源性高达93%;系统进化树分析表明,BnADC与芥菜、拟南芥的ADC亲缘关系较近。在获得全长cDNA的基础上,构建融合表达载体pET30a(+)-BnADC,转化大肠杆菌（Escherichia coli）表达菌株BL21(DE3),SDS-PAGE检测到一个约81.1kD的融合蛋白被E. coil表达,且融合蛋白主要存在于菌体沉淀中。     

甘蓝型油菜分枝角度QTL定位及候选基因分析

分枝角度是油菜重要株型性状.为筛选和发现适度紧凑的分枝角度调控基因,以提高产量利于机械化收获,以分枝角度差异显著的油菜品种Holly和APL01为亲本构建的重组自交系(RIL)群体为材料,在2个环境中对分枝角度进行QTL定位及候选基因分析.结果表明,RIL群体分枝角度表现出连续变异且呈正态分布.利用前期构建的高密度SN...     

甘蓝型油菜BnKNAT2基因克隆和功能分析

为分析甘蓝型油菜中调控分生组织细胞特异分化的KNOX基因家族成员KNAT2,从品种中双11号中分离克隆了BnKNAT2基因,ORF长984bp,由5个外显子组成,该基因编码327个氨基酸残基的蛋白质,该蛋白质包含有KNOX1、KNOX2、ELK和Homeobox KN结构域,属I类KNOX蛋白。甘蓝型油菜中BnKNAT2存在4个拷贝,在主花序(原基)、授粉后7d的角果和茎中活跃表达。利用35S启动子构建了BnKNAT2的超表达载体(pD1301S-BnKNAT2)转化拟南芥野生型Col-0,21个转基因株系（T2）的叶片呈现不同程度卷曲、蜷缩以及波纹状叶缘。另外,BnKNAT2转基因株系开花期相比野生型明显推迟。     

甘蓝型油菜CMS三系及杂交种的选育研究

引进我国长江流域甘蓝型半冬性双低品种(系)，在陕西关中生态条件下连续多年进行适应性选择，选育出适宜关中的双低自交系；用这类自交系与不育株测交和回交，育成不育株率100％、不育度95％以上的不育系212A、218A、159A等。用多亲本复合杂交改良的单、双低恢复系116C、1102C与不育系测交，育成了陕油6号、陕油8号等品种。2000年陕油6号通过陕西省农作物品种审定委员会审定，2001年陕油8号通过国家农作物品种审定委员会审定。     

油菜种子油体的观察和大小分析

研究油菜种子树脂半薄切片和超薄切片,发现胚子叶细胞被蛋白体和油体所充实,蛋白体为球状晶体蛋白体,油体大小差异较大,小油体呈球形,大油体呈椭球形。油体经分离和统计分析,表明小油体数量较多,平均直径为0.57 μm;大油体数量较少,平均直径为2.39 μm;不同大小油体的数量随着油体体积的增加而逐渐减少。     

空间条件对没菜诱变效果的研究——突变类型的观察与筛选

利用返回式地球卫星搭载甘蓝型油菜种子的试验表明,空间条件对油菜种子具有诱导性状变异的作用,许多由空间条件诱导的性状变异能够传递给后代。通过对变异后代进行田间筛选,获得早熟、丰产、黄色种皮等突变类型,为油菜品种改良提供了丰富的遗传变异基础材料。     

甘蓝型油菜遗传转化的研究进展

综述了近10多年来甘蓝型油菜各种遗传转化方法的主要研究进展，并对遗传转化在甘蓝型油菜重要性状改良方面的应用进行了系统总结。     

甘蓝型油菜小孢子离体培养条件改良

应用低含油量甘蓝型油菜品系1064与高含油量品系H105杂种F1花蕾进行小孢子培养,研究了两个种植地点的油菜小孢子产胚率的影响。对长度在0.4cm～0.6cm,0.6cm～0.8cm以及0.8cm以上的胚分别培养,并比较了秋水仙碱悬浮处理离体小孢子、浸根和滴芽3种染色体加倍方法的加倍效率。结果表明,种植在西宁的材料小孢子产胚率比南京高,为8.6枚/皿;0.6cm～0.8cm大的胚转接到B5固体培养基,其成苗率高达48.53%;3种加倍处理方法中以50mg/L秋水仙碱悬浮小孢子48h染色体加倍效率最高,达到46.23%。本研究构建了含有123个株系的DH群体,可用于油菜含油量性状的QTL分析。     

甘蓝型油菜胞质雄性不育系212A的选育与研究

在Ledos字兴?号后代材料中发现5株雄性不育株,经与中双2号自交系212B保持,育成了细胞质雄性不育系212A和保持系212B.通过人工套袋自交、剥蕾授粉自交及镜检观察,认为不育系212A属稳定型细胞质雄性不育系,产生的原因可能与低温时期的死蕾现象有关.恢保关系的研究表明,212A胞质雄性不育系与pol CMS、陕2A CMS恢保关系相同.遗传研究表明,测交F2育性为可育与不育3∶1分离;用恢复系回交(BC1)后代全可育,无育性分离;用保持系回交,后代育性为可育与不育1∶1分离.初步认为控制不育系的基因为S(rr),保持系基因为N(rr),恢复系基因为N(RR)或S(RR),属1对核基因控制的细胞质雄性不育系.