固定化酶膜催化茶多酚形成茶黄素反应条件优选

用SAS统计软件中的响应面分析法探讨了固定化多酚氧化酶酶膜催化儿茶素生产茶黄素的最佳反应条件,确定了酶膜法生产高纯度茶黄素的五个重要因素及最佳组合。五个因素包括反应时间、酶与底物之比、通气量、底物浓度和pH值。最佳反应条件为：反应时间49βmin、酶与底物之比为1:128.7、通气量为23.81L/min 、底物浓度5.95βmg/ml和pH值4.3。该条件下产物茶黄素浓度的理论值为0.766βmg/ml,实测值为0.754±0.017βmg/ml,表明优化模型合理,条件筛选结果准确。     

茶树鲜叶中维生素B6代谢酶PLK的活性分析

吡哆醛激酶（Pyridoxal Kinase, PLK）是维生素B₆（VB₆）代谢关键酶。从茶鲜叶中直接提取含PLK的粗酶液,经过硫酸铵沉淀、透析处理后,采用苯肼衍生化方法检测定PLK活性,并对其基本酶学性质进行分析。结果表明,提取时加入100%茶鲜重的PVPP,效果最佳。纯化后的茶鲜叶PLK比活力为0.737 nmol/(min·mg),纯化倍数为4.0;当有二价金属离子存在时,PLK才具有催化活性,其中Zn²⁺对其催化作用最强。该酶的最适反应温度为60℃;在pH6.0左右酶活力最高。在最适反应条件下,测得反应底物ATP和PL的Km值分别为19.3 μmol/L和53 μmol/L。     

毛细管电泳分析茶黄素的方法研究

研究了毛细管电泳分析茶黄素类组分的最佳条件。结果表明：在250βmmol/L H₃BO₄、10βmmol/L KH₂PO₄、0.75βmmol/L SDS和20％(v/v)乙腈组成的pH7.5电泳介质中,选择25βkV电压、20℃柱温和200βnm波长检测,可在10βmin以内将茶叶中的四种主要茶黄素单体分离,并获得较高的检测灵敏度。四种茶黄素单体浓度与峰面积值之间的相关系数r=0.9945~0.9990,检测下限在0.53~0.64βμg/ml之间,加标回收率为92.50%~108.36%,变异系数≤2.67%。本方法快速、准确,可用于实际样品的测定。     

儿茶素组成和理化条件对茶黄素酶催化合成的影响

利用梨果实多酚氧化酶,在单因素试验基础上,设计正交试验,进行酶性合成茶黄素,研究儿茶素组成和理化条件对茶黄素合成的影响,以确定最佳反应条件。结果表明,以儿茶素混合物C(EGC>200mg/g,EGCG>200mg/g,儿茶素总量>500mg/g)为材料,茶黄素酶促合成的最佳条件为:反应体系的最佳pH值为5.5,温度为30℃,底物浓度为5mg/ml,酶添加量为75ml/1000mg,最佳反应时间40min。pH值和儿茶素浓度是反应体系中两个重要的影响因子(P<0.05)。     

EGCG甲基化衍生物酶促合成的反应条件研究

以EGCG-O-甲基转移酶催化EGCG生成EGCG3′′Me、EGCG4′′Me和EGCG3′Me等3种主要的EGCG甲基化衍生物的生成量为主要指标,考察了EGCG甲基化衍生物酶促合成的反应条件。结果表明,EGCG甲基化衍生物的酶促合成最佳反应条件为：温度35℃,pH7.5,DTT和Mg²⁺的浓度为2mmol/L;在该反应条件下,反应体系中EGCG3′′Me、EGCG4′′Me以及EGCG3′Me的生成量分别可达到386.39μg/mL、23.40μg/mL和107.01μg/mL。     

茶氨酸的衍生化及毛细管电泳定量技术

采用胶束电动力学毛细管电泳技术定量茶氨酸,以2,4-二硝基氟苯为衍生化试剂,建立茶氨酸定量的新方法。运行缓冲液为pH9.8的0.03βmol/L四硼酸钠缓冲液体系,分离电压为28kV,分离温度为17℃,在360βnm下进行检测。研究了不同pH、反应时间、反应温度、缓冲液浓度对衍生化反应的影响,确立了衍生化反应的最佳条件。证实了4℃和25℃环境下衍生化产物可以稳定保存5天。测定了茶氨酸衍生化方法的性能指标：线性范围为0.2~5βmmol/L（r²=0.993）,最低检测限为0.05βmmol/L。     

茶氨酸酶促生物合成研究进展

茶氨酸系茶树（Camellia sinensis）特征性成分,具有放松镇静、增强记忆、保护神经、化疗调节等诸多生理活性。目前发现能催化茶氨酸生物合成的酶有7种,它们分别是茶氨酸合成酶、谷氨酰胺合成酶、γ-谷氨酰甲胺合成酶、谷氨酸合成酶、γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶、谷氨酰胺酶和γ-谷氨酰转肽酶。茶氨酸生物合成反应有两种代表类型：（1）谷氨酸和乙胺为底物的连接合成反应（需ATP供能）;（2）谷氨酰胺和乙胺为底物的酰基转移反应。本文对茶氨酸酶促合成途径进行了综述,以此为茶氨酸微生物合成技术的开发应用提供参考依据。     

茶毛虫核型多角体病毒对茶毛虫的致病性研究

研究了茶毛虫核型多角体病毒（Euproctis pseudoconspersa nuclear polyhedrosis virus,简称EpNPV）的室内外增殖、分离粗提,以及对茶毛虫（Euproctis pseudoconspersa Strand）室内毒力测定、田间防治效果和病毒电镜检测。采用室内离体茶树嫩枝水培,106βPIB/ml EpNPV喷雾接种2~3龄茶毛虫,或大田直接喷雾处理2~3龄茶毛虫,在罹病幼虫液化前及时收集虫尸,完成病毒增殖。106βPIB/ml、107βPIB/ml、108βPIB/ml EpNPV室内处理第12天致病率分别为43.60％、76.13％和64.68％;第14天致病率分别为59.17％、95.71％和95.70％。大田试验107βPIB/ml喷雾处理第15天防治效果达78.11%。经透射电镜观察田间防治大量感病茶毛虫虫尸,证实为EpNPV致病死亡。     

儿茶素体外氧化制备茶黄素的研究

对儿茶素通过体外酶促氧化和化学氧化定向制备茶黄素进行了研究,并对两种制备途径进行了比较。酶促氧化结果表明,发酵80分钟时,茶黄素的生成量最高(为15.05%)。化学氧化结果表明,以大叶儿茶素为材料,浓度为10βmg/ml, 氧化剂的比例为2:3:1（儿茶素: K₃Fe(CN)₆:NaHCO₃）时,有利于茶黄素类物质的形成。     

茶树鲜叶中叶黄素循环组分的高效液相色谱法测定研究及其光保护功能鉴定

采取酮提取茶树鲜叶中的叶黄素循环组分,分别在15℃、22℃和30℃下,用Spherisorb C18（5μm,250βmm×4.6βmm）色谱柱,乙腈︰甲醇（85︰15）和甲醇︰乙酸乙酯（68︰32）为流动相,线性洗脱,在445βnm下检测。结果表明,不同温度条件下,高效液相色谱法都能够从茶树鲜叶提取物中检测到紫黄素、环氧玉米黄素和玉米黄素,而且分离效果好,重现性和精密度也很高。强光下,叶黄素循环库和紫黄素脱环氧化程度皆明显增加,表明其在茶树中有重要的光保护作用。     

茶多酚体外氧化产物颜色稳定性及对PC-3细胞生长的影响

以红茶中提取的茶黄素粗提物、绿茶多酚为对照,利用紫外扫描技术、UV-Vis法及MTT法研究了绿茶多酚纳米固定化多酚氧化酶体外氧化产物的颜色稳定性、自由基清除能力和对前列腺癌细胞PC-3生长的抑制作用。在不同pH值条件下,茶黄素粗提物和绿茶多酚纳米固定化酶体外氧化产物的紫外吸收光谱的变化趋势相似,碱性增加,吸光度增加;绿茶多酚、茶黄素粗提物及绿茶多酚纳米固定化酶体外氧化产物对DPPH·自由基均有明显清除作用,绿茶多酚纳米固定化酶体外氧化产物清除效果较绿茶多酚和茶黄素粗提物强;茶黄素粗提物及绿茶多酚纳米固定化酶体外氧化产物对PC-3细胞的生长都有抑制作用,绿茶多酚纳米固定化酶体外氧化产物优于茶黄素粗提物。因此,绿茶多酚纳米碳酸钙固定化酶体外氧化产物中茶黄素保持了红茶中茶黄素所具有的良好生物学活性。     

茶树鲜叶中维生素B6代谢酶PNPO的活性分析

采用液氮研磨、Tris-HCl+KPO₄缓冲液(pH8.5)浸提法和硫酸铵沉淀法从茶树鲜叶中提取磷酸吡哆醇氧化酶（PNPO）粗酶液,并通过苯肼法研究其酶学性质。结果表明,以磷酸吡哆胺（PMP）为底物,PNPO催化反应的最佳时间为30 min,最适温度为50℃,最适pH6.5。在pH6.0~9.0,温度10~40℃的条件下,此酶稳定。在最适条件下测得反应底物PMP的Km值为2.34 mmol/L。     

红茶色素形成机理的研究

在茶鲜叶匀浆悬浮发酵体系中, 加入铜酶抑制剂NaDDC可使茶黄素(TFs) 的总量下降,而其各组分的消长趋势则各异, 然而对茶红素(TRs) 的形成似乎并无明显的影响( 高浓度的NaDDC除外) , 表明TRs 的形成存在多条平行途径; 在发酵体系中加入不同比例蒸青叶( 酶已钝化) 的试验表明, 对TFs 和TRs 的形成量未产生影响, 说明酶浓度不是红茶发酵的限制因子; 降低发酵体系的pH (pH=4-0) , 虽然使多酚氧化酶(PPO) 和过氧化物酶(POD) 的稳定性明显下降, 且PPO活性降幅大于POD, 但由于减缓了TFs 的非酶性氧化消耗速率, 因而TFs 的含量显著增加。     

酶促合成茶黄素的茶鲜叶酶源筛选

通过对不同季节、不同采摘标准的20个茶树品种鲜叶的多酚氧化酶(PPO)活性及其同工酶分析,筛选出了3种PPO活性较高的茶鲜叶原料,然后以其匀浆液以及在匀浆液中添加速溶绿茶的方法,以催化速溶绿茶酶促合成茶黄素的效率为标准筛选了酶促合成茶黄素的茶鲜叶酶源。结果表明,各茶树品种茶鲜叶PPO活性以夏季一芽二叶较高,酶活性较高的3个品种依次为政和大白茶、福云6号及桃源大叶;不同品种茶鲜叶的PPO同工酶在谱带数目、迁移率和谱带染色深浅3个方面有差异,20个品种有2条相同的同工酶带,其Rf值分别为0.27和0.53,政和大白茶、桃源大叶、福云6号均有5条明显的同工酶带,且以政和大白茶的谱带染色最深;单位质量的政和大白茶鲜叶匀浆液自身酶促合成茶黄素的量高于桃源大叶与福云六号;参加酶促反应合成茶黄素的儿茶素主要为EC、EGCG和ECG;添加速溶绿茶作为底物合成茶黄素的量远高于茶鲜叶自身酶促合成茶黄素的量,其中政和大白茶反应体系中茶黄素的质量浓度达212.01mg/L,为自身酶促合成茶黄素质量浓度(39.05mg/L)的5.43倍。     

茶多酚固定化酶体外氧化产物茶黄素组成及其化学发光分析

以红茶中提取的茶黄素粗提物和氧化前的茶多酚为对照,利用HPLC技术分析了纳米CaCO3固定化多酚氧化酶氧化产物的茶黄素组成;利用化学发光法进行了抗氧化活性研究。结果发现,固定化酶体外氧化产物中茶黄素组成以TF2A为主,茶黄素粗提物中四种茶黄素单体均占一定的比例;利用CuSO4-Vc-H2O2-酵母体系和Fe2+-H2O2-酵母体系进行化学发光研究,发现固定化酶体外氧化产物抗氧化活性较茶黄素粗提物和茶多酚强。     

茶多酚双液相氧化制取茶色素参数优化

应用二次回归旋转组合设计,研究茶多酚双液相(TLPS)氧化参数对制取茶色素的综合效应,以茶黄素(TFs)和茶红素(TRs)为目标建立茶多酚双液相氧化制取茶色素参数模型。结果表明:茶多酚浓度、温度、酯比例及pH值对TFs和TRs形成与积累均有显著影响,反应时间对TFs影响显著,氧化剂对TRs影响显著;单因素效应显示:较低的茶多酚和氧化剂浓度、适当的低温和较短的时间、低的酯比例和pH较有利于TFs形成与积累,而有利于TRs形成与积累的参数则相反。运用计算机模拟优化,得到茶多酚双液相氧化制取茶色素参数综合优化方     

茶叶多酚氧化酶及其同工酶的研究进展

多酚氧化酶（PPO）是茶树生理与茶叶加工中的一类重要氧化还原酶,也是茶黄素及其组分酶促合成中的关键酶。从PPO结构分类、同工酶、PPO与茶叶品质关系、PPO分离纯化及酶促合成茶黄素等方面进行综述,以期为茶树品种适制性评价、茶黄素及其组分高效制备以及PPO同工酶酶源筛选与利用提供科学依据。