仔猪人工感染猪囊尾蚴后外周血中淋巴细胞亚群的动态变化研究

试验研究了仔猪人工感染猪囊尾蚴后外周血中CD_3~ 、CD_4~ 、CD_8~ T淋巴细胞的变化规律。将10头仔猪随机分为2组,即攻虫组和对照组,每组5头,用流式细胞仪检测攻虫后10,20,30,40,70 d试验猪外周血中T淋巴细胞亚群的变化情况。结果显示整个检测过程中CD_3~ T细胞比例一直处于较低水平。在感染初期CD_4~ T细胞和CD_8~ T细胞比例明显降低,且CD_4~ T细胞比例明显高于CD_8~ T细胞;感染中期CD_8~ T细胞数量有所增加,但仍以CD_4~ T细胞比例占优势;感染后期CD_4~ T细胞和CD_8~ T细胞数量都有所恢复。     

重组猪γ—干扰素在毕赤酵母中的表达及其生物学活性研究

采用RT-PCR从猪外周血液淋巴细胞中克隆出猪γ-干扰素基因cDNA,构建了重组酵母表达载体(pPICZα-PoIFN-γ),并在巴斯德毕赤酵母X33株中实现了高效分泌表达,经SDS-PAGE和Western-lot证实猪γ-干扰素分子量为18 kD,细胞培养试验结果表明,莺组猪γ-干扰素能抑制水泡性口炎病毒(VSV)对猪肾传代细胞(PK-15)的攻击;而在动物试验中,重组猪γ-干扰素可明显提高猪伪狂犬疫苗的免疫效果.     

重组鸡α-干扰素对鸡外周血T淋巴细胞亚类的影响

重组鸡α-干扰素(rChIFN-α)静脉注射4~6周龄SPF鸡,24 h后采血分离淋巴细胞,通过流式细胞术测定不同时间外周血中CD4+和CD8+T淋巴细胞的百分率。结果显示,rChIFN-α可以在48~72 h内明显提高CD4+T淋巴细胞的百分率,并下调CD8+T淋巴细胞的百分率,证明rChIFN-α具有显著的免疫调节作用。     

弓形虫代谢分泌抗原对仔猪IL-2、IL-4、IFN-γ和TNF-α表达水平的影响

通过免疫后攻毒的方法研究了弓形虫代谢分泌抗原(E/SA)免疫后对不同免疫组仔猪机体白细胞介素-2(IL-2)、白细胞介素-4(IL-4)、干扰素-γ(IFN-γ)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)含量的影响.结果表明:免疫后各免疫组仔猪的IL-2、IL-4、IFN-γ含量均不同程度的升高;其中E/SA组IL-2、IL-4和IFN-γ的水平显著升高,与对照组差异显著(P0.05),其含量分别由免疫前的105.05、105.33、67.50pg.mL-1升高到免疫后的194.03、342.50、296.50pg.mL-1;TNF-α水平变化不显著.试验证实弓形虫代谢分泌抗原疫苗能够促进仔猪IL-2、IL-4、IFN-γ的分泌,并引起宿主抗弓形虫感染的免疫应答.     

猪γ干扰素的表达及抗病毒活性研究

利用RT-PCR技术从有丝分裂原刀豆素(ConA)诱导的长白猪外周血淋巴细胞总RNA中扩增出猪γ干扰素的成熟肽基因(mPolFN-γ),并将其亚克隆到原核表达载体pET-28a中,构建重组表达载体pET-mPoIFN-γ.经PCR、酶切及测序鉴定后,转化到大肠杆菌BL21(DE3)进行IPTG诱导表达,经SDS-PAG...     

脂多糖刺激对断奶仔猪脾脏、胸腺和外周血白细胞PPARγ蛋白表达的影响

 【目的】研究免疫应激对断奶仔猪脾脏、胸腺和外周血白细胞过氧化物酶体增殖物活化受体γ（PPARγ）蛋白表达水平的影响。【方法】选取12头健康断奶仔猪,分成2组,每组6个重复。试验组注射100 μg•kg-1 BW的脂多糖（LPS）建立免疫应激模型,对照组注射等量生理盐水。注射后3 h,采血分离血浆和白细胞待测,然后立即屠宰仔猪,取脾脏和胸腺,通过Western blot 测定脾脏、胸腺和白细胞中PPARγ蛋白表达水平。【结果】LPS刺激仔猪,导致血浆白细胞介素-6﹑肿瘤坏死因子-α、皮质醇和前列腺素E2含量显著升高（P＜0.05）,胰岛素、类胰岛素生长因子-1含量显著降低（P＜0.05）;LPS刺激导致血浆葡萄糖、总蛋白、白蛋白和球蛋白含量显著降低（P＜0.05）;LPS刺激导致脾脏（P＜0.05）、胸腺（P＜0.1）和白细胞（P＜0.05）PPARγ蛋白表达水平升高。【结论】脂多糖剌激可提高仔猪脾脏、胸腺和外周血白细胞PPARγ蛋白的表达,显示PPARγ可能参与仔猪免疫应激的调控,可能成为缓解仔猪免疫应激的一个新靶点。     

重组猪α干扰素急性毒性研究

［目的］研究小白鼠体内重组猪α干扰素急性毒性反应,为临床安全用药提供依据。［方法］依据急性毒性实验原则,将小白鼠分为2大组：腹腔注射组和肌肉注射组,每组又分高、中、低3个剂量组,同时设正常对照组。给药后14 d内连续观察小鼠行为活动等指标和毒性反应程度,取血作血液学检查和生化检查,以获得重组猪α干扰素初步毒性资料,并在实验结束时处死小白鼠进行剖检。［结果］各组小鼠外部表现及行为特征均正常,体温和体重的变化也在正常范围之内,内脏病理解剖无器官病变情况,血液、生化指标与正常对照组无明显差异。［结论］该实验设定的猪α干扰素最高剂量（5.0×10^5 IU/只）及其以下剂量,均对小白鼠无明显毒性作用,在临床上应用重组猪α干扰素是安全的。     

猪γ干扰素基因真核重组表达质粒的构建及活性测定

以含有全长猪γ干扰素基因的质粒为模板,通过PCR方法扩增猪γ干扰素并引入酶切位点,酶切后与PCI真核表达载体连接在一起,测序后经比较,所扩增序列同Genebank报道的IFN-γ序列同源性为99·8%.将重组质粒转染PK细胞,检测所转染的pIFN-γ的抗病毒活性.试验结果表明,转染pIFN-γ试验组与正常细胞接毒对照组比较有显著差异,说明所构建的重组质粒转染后具有抗病毒作用.     

重组猪干扰素α的纯化工艺研究

[目的]研究重组猪干扰素α的纯化工艺,为进一步研究该蛋白的分子结构及rPoIFN-α标准品的制备奠定基础。[方法]将含重组菌E.coliBL21诱导表达后得到的粗制rPoIFN-α,分别用2种方案进行纯化。方案1,依次用GST亲和层析法、DEAE阴离子交换法及分子筛法层析三步法进行纯化;方案2,依次用GST亲和层析和分子筛法层析两步法进行纯化。纯化结果用SDS-PAGE及Western-blot进行纯度检测及鉴定。[结果]诱导表达后的表达产物经SDS-PAGE检测,发现在45Kd分子量处有目的条带,Western-blot检测有特异性条带。通过两步法纯化后的rPoIFN-α纯度达96%,蛋白得率为42.8%,三步纯化纯度为98.8%。[结论]两步法得到的蛋白纯度非常接近三步法,但与三步法相比工艺更为简单方便。     

乙型肝炎患者外周血IL-2、可溶性IL-2受体、IFN-γ检测的意义

目的：探讨乙型肝炎患者外周血白细胞介素2（IL-2）、可溶性IL-2受体（sIL-2R）和γ-干扰素（IFN-γ）变化与肝功能的关系。方法：测定乙型肝炎患者72例（肝功能正常者33例,异常者39例）和健康成年人35例血清IL-2和sIL-2R及IFN-γ。结果：乙型肝炎患者肝功能异常组和对照组的IL-2、sIL-2R、IFN-γ差异有统计学意义（P〈0.01）,而肝功能正常组与健康对照组比较,差异无统计学意义。结论：乙型肝炎肝功能异常患者存在一定程度的T细胞功能障碍与缺陷,这种障碍与缺陷与其肝功能状态有密切关系。     

猪γ干扰素的基因克隆、改造、表达及活性测定

提取经ConA诱导培养的猪外周血白细胞总RNA ,RT -PCR扩增出猪IFN -γ基因并克隆到pGEM -T -easy载体 ,测序结果表明扩增片段是含有信号肽的猪IFN -γ的完整基因。设计 1对引物亚克隆猪IFN -γ成熟蛋白基因并对其5′端前 2个稀有密码子进行大肠杆菌偏嗜性改造。经测序鉴定后插入原核表达载体pRLC ,并实现在大肠杆菌中的高效表达。表达产物以包涵体形式存在 ,经 7mol·L-1盐酸胍的变性液溶解及 0 5mol·L-1盐酸胍复性液复性处理 ,表达产物进行脱盐、凝胶层析纯化。细胞病变抑制法测定结果表明 ,重组猪IFN -γ具有较高的干扰素活性 ,约为 4 5× 10 6U·mg-1。     

仔猪痢清对猪外周血T淋巴细胞增殖的影响

研究仔猪痢清口服液对猪外周血T淋巴细胞增殖的影响.以MTT法测定仔猪痢清口服液对淋巴细胞增殖的影响,结果表明,仔猪痢清口服液具有良好的促进ConA诱导的猪外周血T淋巴细胞增殖作用.     

猪α干扰素重组腺病毒的构建与鉴定

猪的病毒性疾病种类多且危害大,因此研发具有广谱抗病毒作用的猪α干扰素制剂具有重大意义.为了研制重组猪干扰素类制剂防制猪病毒性传染病,构建了携带猪IFN-α基因的重组腺病毒.应用PCR方法从猪肝组织基因组中扩增得到猪IFN-α基因后,直接克隆入腺病毒载体穿梭质粒中,构建出腺病毒重组穿梭质粒pAd-CMV-IFN-α,经Pme Ⅰ线性化后转化BJ5183感受态细胞,获得同源重组腺病毒质粒,Pac Ⅰ酶切后回收,脂质体介导下转染AD-293细胞,PCR检测表明成功构建了携带猪IFN-α基因的复制缺陷性重组腺病毒.     

猪α、γ干扰素的原核表达、纯化及抗病毒活性初步研究

提取猪白细胞DNA、猪脾脏RNA,特异性引物扩增猪IFN-α、IFN-γ基因,将IFN-α和IFN-γ基因分别插入原核表达载体pET-30构建重组表达质粒pET-30-IFN-α和pET-30-IFN-γ,转化大肠杆菌B121,在IPTG诱导下表达猪IFN-α及IFN-γ,SDS-PAGE分析重组表达蛋白;用细胞病变抑制法检测重组表达蛋白的抗病毒活性.结果表明成功构建重组表达质粒pET-30-IFN-α和pET-30-IFN-γ;SDS-PAGE可检测到相对分子质量为21.3 Ku和19.4 Ku的蛋白条带,表达产物主要以包涵体形式存在;经Ni2+-NTA亲和层析纯化,获得高纯度重组蛋白;纯化的猪IFN-α和IFN-γ抗星状病毒复制的活性分别为3.15×103 U·mg-1和2.48×103 U·mg-1.     

胸膜肺炎放线杆菌感染对猪外周血T淋巴细胞亚群及增殖影响

为研究感染APP对猪外周血免疫功能影响,将24头健康杜洛克、长白猪和约克夏三元杂交(DLY)仔猪按性别、体重分为2组,分别用生理盐水(对照组CG)和含3.8×107CFU.mL-1猪放线杆菌(APP)稀释液(试验组TG)喷雾鼻腔。结果表明,TG猪血液中白细胞总数(WBC)、中性粒细胞数(GRA)、中间细胞数(MID)均极显著升高(P<0.01),淋巴细胞数(LYM)却极显著降低(P<0.01)。TG猪外周血CD3+T细胞降低(P>0.05),CD3+CD4+T细胞极显著降低(P<0.01),CD3+CD8+T细胞及CD4+/CD8+值显著降低(0.010.05)。结果表明,感染放线杆菌后,猪整体防御机能和呼吸道粘膜局部免疫功能增强,而机体整体免疫功能下降。     

鸡干扰素γ（c-IFNγ）重组蛋白的稳定性研究

以保护鸡胚成纤维细胞（CEF）抵御新城疫病毒（NDV）侵袭的能力为主要检测指标,考察鸡干扰素γ（c-IFNγ）的热稳定性、酸碱稳定性及冻融耐受性。在37℃及以上的热处理中,c-IFNγ样品迅速失活,其中60℃处理1h活性即降低约70％;酸性环境中的样品极不稳定,在pH-2的液体制剂中1h,蛋白质全部失活,但在碱性制剂中...     

猪γ干扰素基因的克隆表达及其抗原性的初步研究

在人类文明发展中,人与自然的关系经历了人类对自然的顺从、依附到人类对自然的主宰。工业文明时期,人与自然的关系是对立的,人类把自然看成是掠夺的对象,致使生态危机日益严重。生态文明蕴含着人与自然和谐统一的关系。它承认自然具有内在价值,它以生态科技作为物质基础,实行生态化的生产方式和消费方式。     

猪γ干扰素基因的克隆表达及其抗原性的初步研究

为研究猪γ干扰素(poIFN-γ)的生物学活性及其在机体免疫应答中的作用机理,克隆并表达了猪IFN-γ基因。首先应用RT-PCR方法通过一对自行设计的引物从猪脾脏淋巴细胞中扩增了猪γ干扰素基因片段,分别将其定向插入原核表达载体pGEX-4T-1和pET-32 a中,经测序表明与已报道的核苷酸序列同源性为100%。接着将重组质粒pGEX-poIFN-γ和pET-poIFN-γ分别转化大肠杆菌BL21株,经IPTG诱导,得到高效表达。所表达的融合蛋白均以不溶性的包涵体形式存在,分子量分别为43.0和35.0 ku,与理论推算值相符。为研究IFN-γ在表达中结构的变化,采用上述2种融合蛋白分别作为免疫抗原和检测抗原。结果用GST-poIFN-γ免疫小鼠所诱导的抗体可与poIFN-γ产生特异性结合,表明不同原核质粒表达的猪IFN-γ仍保持其特有的结构。     

萨福克羊发育过程中外周血IFN-γ、IgG和IL-2质量浓度的变化

为分析萨福克羊生长发育中部分免疫分子的分泌特点,探讨萨福克羊的免疫学特征。以萨福克羔羊为研究对象,应用ELISA方法检测全年12个月和全天24h绵羊外周血中γ干扰素(IFN-γ)、免疫球蛋白G(IgG)和白细胞介素-2(IL-2)的质量浓度,分析其年周期和昼夜节律变化。结果表明,从初生到周岁的17个时间点,萨福克羔羊外周血中IFN-γ质量浓度变化不显著(P0.05);羔羊吮吸初乳以后外周血中IgG和IL-2质量浓度迅速升高;IgG质量浓度在羔羊吮吸初乳以后显著高于2月龄、3月龄、4月龄、5月龄、6月龄、8月龄、10月龄、11月龄和12月龄(P0.05);IL-2质量浓度在7月龄显著高于羔羊初生未吮吸初乳、7日龄、1月龄、2月龄、3月龄、4月龄、5月龄和12月龄(P0.05);全年羔羊外周血中IgG和IL-2质量浓度变化趋势一致。在6月龄羔羊全天4个时间点,其外周血IgG、IFN-γ和IL-2的质量浓度变化均不显著(P0.05)。说明,初乳能显著提高羔羊的免疫水平,季节转换影响羔羊免疫分子的分泌,萨福克羊免疫分子的分泌具有年周期和昼夜节律变化特征。     

CLA对仔猪外周血T淋巴细胞的细胞毒活性影响

【目的】研究日粮中添加共轭亚油酸(Conjugated linoleic acid,CLA)对仔猪外周血T淋巴细胞的细胞毒活性影响,为将CLA作为免疫调节剂调控动物机体的免疫力和应用于畜禽乃至人类的营养实践提供参考。【方法】30头21日龄杜长大断奶健康仔猪按体质量相近、性别比例一致原则两两配对,随机分为对照组和CLA日粮组,分别喂给基础日粮和2%CLA日粮,每组5个重复,每个重复3头猪,63日龄时用肝素抗凝真空管前腔静脉采取血样,测定外周血T淋巴细胞亚群、细胞毒活性、穿孔素和颗粒酶B mRNA表达及脂肪酸组成。【结果】日粮添加CLA不影响仔猪外周血T淋巴细胞CD3+、CD4+的数量(P0.05),但可显著提高CD8+T细胞总数(P0.05);与对照组相比,CLA组仔猪外周血T淋巴细胞细胞毒活性、穿孔素和颗粒酶B mRNA表达分别提高29.98%(P0.01),32.87%(P0.01)和43.36%(P0.01);未添加CLA时,仔猪外周血T淋巴细胞几乎不含CLA,但CLA组仔猪外周血T淋巴细胞中CLA含量达到0.24%(P0.01)。【结论】日粮添加2%CLA可提高仔猪外周血CD8+T淋巴细胞数,增强仔猪外周血T淋巴细胞细胞毒活性。