噬菌体展示技术

噬菌体展示技术在天然蛋白表达方面应用广泛,常用的噬菌体表面展示系统主要有:丝状噬菌体、λ噬菌体和T4噬菌体等,目前用的较多的是T4噬菌体。T4噬菌体结构较大,遗传结构复杂,具有容量大、拷贝数高,可以展示的多肽或蛋白质范围广等优点,目前已经有多种蛋白采用T4噬菌体展示系统得到了表达。     

一株副溶血弧菌噬菌体的分离与鉴定

分离到2株副溶血弧菌噬菌体,筛选出其中具有强裂解性的1株.该噬菌体的噬菌斑中心清亮,边缘有晕环.12 h观察,噬菌斑直径约3 mm,效价为1011pfu/ml.该噬菌体的核酸为线型双链DNA,大小约4 kb.电镜观察显示,头部为正二十面体,直径约110 nm,有尾,尾长约270 nm,底部有3个刺突.按国际病毒分类委员会第五次报告的分类标准,该噬菌体具肌尾噬菌体科的特征,与其他副溶血弧菌噬菌体比较显示,该噬菌体可能是一种新型的副溶血弧菌噬菌体.     

噬菌蛭弧菌、噬菌体和细菌素（四）

秦生巨老师1979年开始研究以“噬茵蛭弧菌、弧菌噬菌体为主的微生物生态制剂”。至今已经30多年，是我国噬菌蛭弧菌、弧菌噬菌体及其微生物生态制剂研究的创始人。     

噬菌蛭弧菌、噬菌体和细菌素（一）

秦生巨老师1979年开始研究以“噬菌蛭弧菌、弧菌噬菌体为主的微生物生态制剂”至今已经30多年，是我国噬菌蛭弧菌、弧茵噬菌体及其微生物生态制剂研究的创始人。     

体外分子展示技术的原理与应用

体外分子展示技术是一种新兴的体外筛选多肽和蛋白质的有力工具。为了避免噬菌体展示系统等体内展示技术中体内过程对展示效果的影响，人们陆续开发了多种以基因表达产物与自身DNA模板或mRNA模板特异结合为基础的体外分子展示技术，它具有建库简单、库容量大、分子多样性强和筛选效率高、操作过程简捷方便等优点，应用前景十分广阔。     

2株溶藻弧菌烈性噬菌体的分离鉴定及其生物学特性

为寻找并丰富溶藻弧菌噬菌体资源,实验以溶藻弧菌VAHN1为宿主菌,采用双层平板法从海南虾塘水样及福建海产品样本中分离溶藻弧菌噬菌体。通过透射电镜、限制性内切酶及构建发育树等方法对所获溶藻弧菌噬菌体进行分类鉴定;同时分析其生理生化性能。结果显示,本研究分离获得2株溶藻弧菌噬菌体VAP9与VAP21,其噬菌斑均清晰透亮,直径约1.5～2.0 mm。2株噬菌体核酸均为双链DNA,于透射电镜下可见其头部均呈正二十面体结构,2株噬菌体均属肌尾噬菌体科。噬菌体VAP9与VAP21对理化环境具有良好的耐受性;VAP9最适pH为6～8,VAP21最适pH为7～11;2株噬菌体可耐受通用杀菌浓度的过氧乙酸,且对氯仿与乙醚不敏感,同时对紫外线具有一定耐受性。2株噬菌体的最佳感染复数均为0.001,对供试溶藻弧菌的裂解率达95.2%,可裂解部分副溶血性弧菌,但无法裂解除溶藻弧菌与副溶血性弧菌外的弧菌属、葡萄球菌属、假单胞菌属等其他种属的供试细菌。噬菌体VAP9与VAP21可高效抑制溶藻弧菌VAHN1的生长,且2株噬菌体的混合制剂对溶藻弧菌的抑制效果优于单株噬菌体。将噬菌体VAP9及VAP21保守蛋白序列于N...     

三株AHPND致病型副溶血性弧菌烈性噬菌体的分离鉴定及其生物学特性

为分离获得AHPND致病型副溶血性弧菌烈性噬菌体,并鉴定及研究其生物学特性,本研究以AHPND致病型副溶血性弧菌为宿主菌,采用双层平板法分别从中国福建及墨西哥海水样本中对其噬菌体进行分离;通过噬菌斑形态、限制性内切酶、全基因组测序构建系统发育树及透射电镜观察对所获噬菌体进行分类鉴定;同时对供试噬菌体裂解谱及其生物学特性进行测定,包括最佳感染复数(MOI)、pH稳定性、热稳定性、过氧乙酸稳定性及不同储存温度下的存活稳定性等。结果显示,本研究分离获得3株AHPND致病型副溶血性弧菌烈性噬菌体P46、P48及VP7,3株噬菌体的噬菌斑均呈透亮圆形,P46噬菌斑直径4～5 mm,P48与VP7噬菌斑直径5～6 mm。3株噬菌体核酸均为双链DNA,电镜下观察其头部均呈二十面立体结构,直径约60 nm,尾部宽约8 nm,长约18～20 nm,属于短尾噬菌体科。3株供试噬菌体对AHPND型副溶血性弧菌裂解率达91.5%,对非AHPND型副溶血性弧菌裂解率为92.3%,且无法识别除副溶血性弧菌外其他种属的细菌;噬菌体P46、P48及VP7感染AHPND致病型副溶血性弧菌的最佳MOI分别为0.001、0.1及0.001;P46与VP7最适pH为6～8,P48最适pH为6～9;3株噬菌体对60°C的温度耐受力较强,在4°C条件下存放50周后仍具有较高的存活率;对通用杀菌浓度的过氧乙酸具有一定耐受性。将噬菌体P46、P48及VP7保守蛋白序列在NCBI数据库中比对后发现,3株供试噬菌体与其他噬菌体同源性较低,因此,噬菌体P48与P46及VP7很可能为3株新发现的短尾科噬菌体,这是中国首次报道AHPND致病型副溶血性弧菌短尾科噬菌体。本研究丰富了AHPND致病型副溶血性弧菌噬菌体的菌种资源,并为其应用于噬菌体生物防治制剂的开发奠定了理论基础。     

两株副溶血弧菌噬菌体的分离鉴定及裂解性能

为探究副溶血弧菌的生物防治方法,自水产品市场污水排放处及青岛岸边海水中分离出两株副溶血弧菌噬菌体VPp2、VPp3.借助噬菌斑形态、电镜、酶切等技术对其进行了分类鉴定,测定了其裂解谱、最佳感染复数、一步生长曲线并研究其裂解性能.分类鉴定结果表明,VPp2、VPp3分别属于2株不同的噬菌体.其核酸均是线型双链DNA,均具有正二十面体的头部及较长的尾部,且均属肌尾科噬菌体.VPp2头部直径约64 nm,尾长约114 nm.VPp3头部直径约89 nm,尾长约106 nm.裂解性能研究结果表明,VPp2、VPp3在双层平板上均能形成清晰透亮的噬菌斑.其裂解谱相同.最佳感染复数均较小,潜伏期均较短,VPp2的裂解量只有11.1,而VPp3的裂解量可达45.3,是符合条件的潜伏期短裂解量大的噬菌体,可进一步应用于噬菌体治疗及检测等.     

体外分子展示技术的原理与应用

体外分子展示技术是一种新兴的体外筛选多肽和蛋白质的有力工具。为了避免噬菌体展示系统等体内展示技术中体内过程对展示效果的影响,人们陆续开发了多种以基因表达产物与自身DNA模板或mRNA模板特异结合为基础的体外分子展示技术,它具有建库简单、库容量大、分子多样性强和筛选效率高、操作过程简捷方便等优点,应用前景十分广阔。     

一株沙门氏菌烈性噬菌体的分离纯化与生理特性研究

自水产品市场的污水中采用双层平板法分离纯化出一株烈性沙门氏菌噬菌体S P3。利用电镜观察其形态特征,SDS-PAGE电泳和琼脂糖凝胶电泳分析其结构蛋白和核酸成分,并测定其生理特性。包括一步生长曲线、热和p H稳定性、抑菌活性和最适保存条件。结果显示该烈性噬菌体S P3为双链DNA ,属于长尾噬菌体科,结构蛋白为43．0～66．2 ku。该株噬菌体潜伏期5 min ,裂解期为75 min ,最适培养温度和p H分别为30～40℃和7～9,在液体环境中能够高效抑制沙门氏菌的生长。不同的保存方法显示,S P3在-20℃低温保存条件下活性保持较好。     

红螯光壳螯虾细胞自噬过程中自噬体与微管相互作用

昆虫方面研究提示自噬在病毒侵染增殖中发挥了重要作用,而虾类自噬研究报道极少,了解虾类细胞自噬将为虾病害免疫研究开辟新的思路。自噬相关蛋白LC3是自噬过程的标志性蛋白,存在于自噬体膜上,前期生物信息学分析发现,红螯光壳螯虾自噬相关蛋白LC3(CqLC3)和微管蛋白α-tubulin (Cqα-tubulin)具有互作关系。为深入揭示红螯光壳螯虾细胞自噬体的运输途径,本实验通过体外重组构建了蛋白表达载体pET-HISCqLC3和pET-GST-Cqα-tubulin,并诱导表达,利用亲和层析法分别纯化获得HIS和GST融合表达蛋白HIS-CqLC3和GST-Cqα-tubulin,利用GST pull-down实验验证发现,CqLC3与Cqα-tubulin存在相互作用。微管抑制剂长春新碱解聚微管后,利用MDC染色法检测自噬体发现,红螯光壳螯虾细胞微管解聚破坏后自噬体积累增多,细胞不能正常完成自噬反应,因此可知,红螯光壳螯虾细胞自噬体可通过CqLC3与微管相互作用,微管在红螯光壳螯虾细胞自噬过程中对自噬体的运输具有重要作用。本文首次揭示了虾类细胞自噬反应中自噬体的运输途径,研究结果为虾类细胞自噬的研究奠定了基础。     

霍乱弧菌SWBC—a为靶细菌筛选宽裂解弧菌噬菌体

以舟山赤潮海水为样品,以SWBC-a为靶细菌,分离出4株噬菌体,检测了噬菌体的效价、RTD值、对26株弧菌(副溶血孤菌、霍乱弧菌、溶藻弧菌)的裂解范围,其中SWBC-a-3能裂解3株弧菌,裂解范围较宽,而且显示出跨种属裂解的能力,对这株噬菌体进行了初步的生物学特性研究,包括电镜下的形态,pH值稳定性和热稳定性,钙、镁离子对噬菌体吸附的影响.这2株噬菌体对弧菌的裂解能力较强,有潜在的实用价值.     

对虾发光病生物防治技术的初步研究

本文探讨了应用哈维氏弧菌噬菌体对致病菌哈维氏弧菌(Vibrio harveyi)的特异性噬菌作用防治对虾发光病的必要性和可行性.实验表明:从对虾育苗场分离的对虾发光病致病菌哈维氏弧菌对46种抗菌药物的敏感性逐年减弱,1993年尚有28种敏感药物,其中中度以上敏感的有12种;而到了2003年敏感药物则只剩下9种,中度敏感的仅为头孢三嗪和壮观霉素2种,在养殖生产中常用的几种药物几乎都变为不敏感.在试验水体中添加该噬菌体可使哈维氏弧菌的数量减少2～3个数量级,可以相对减少对虾发光病的发生和虾苗的死亡.实验还显示试验虾苗的死亡与噬菌体的效价高低无关,而与加入的噬菌体上清液的有机质含量有关.     

一种快速分离λ噬菌体DNA的方法

大肠杆菌噬菌体λ(Lambda phage)是一种具有基因组约为50kb双链DNA的噬菌体。自1974年Murray，Thoma使用λDNA作为一种克隆载体以来，λDNA的制备方法有过不少报道。最近Silhavy等介绍了一种较好的方法，我们加以改进，先用差速沉降离心法浓缩噬菌体，然后用氯化铯(CsCl)不连续梯度沉降(Rate-Zonal Sedimentation)和氯化铯不连续梯度漂浮(Rate-Zona1 Floatation)两步离心法纯化噬菌体。     

VP10—一株海洋噬菌体的分离及特性研究

以河流弧菌-Ⅱ(Vibrio fluvialis-Ⅱ)为指示菌,从大连沿海水域中分离到了一株海洋噬菌体-VP10.电镜分析表明,VP10具有典型的廿面体头部及带尾鞘的尾部,为蝌蚪形噬菌体.此外,还进行VP10的热稳定性、pH稳定性及紫外照射稳定性等生物学特征的初步研究.     

噬菌体在水产养殖业中的研究进展

随着水产养殖业的发展,养殖密度越来越高,细菌性疾病暴发频繁。现如今主流抗菌手段是抗生素,但其大规模且不规范的使用使得细菌耐药性问题越发严重。为了有效防治水产细菌性疾病,加快推进水产养殖业绿色发展,促进产业转型升级,人们亟需寻求新的抗菌手段来缓解当今的局面。噬菌体是一种感染细菌和古细菌的病毒,具有专一性强、不易产生抗性、代谢快、易开发及成本低等优点。在国内外被广泛研究,同时也被应用于多种疾病的防控,其相关产品也获得认可,但其本身存在的限制也不容忽视。本文首先综合介绍了噬菌体治疗的原理和优势,然后对噬菌体治疗在水产养殖动物细菌性疾病中的研究进展进行综述,并对噬菌体治疗现存的困难和应对策略进行讨论,最后在此基础上作出展望,期望能够为后续噬菌体在水产上的应用研究提供参考。     

用噬菌体AH1对鱼类病原嗜水气单孢菌（Aeromonas hydrophila）的生物防治

噬菌体对于养殖鱼类鱼病作为一种有效的防治剂是基于如下理由：(Ⅰ)噬菌体的生长速率要比细菌快得多；(Ⅱ)噬菌体的感染发生在水溶液状态中；(Ⅲ)在噬菌体的寄主方面，噬菌体的感染的宿主是很特异的；(Ⅳ)不存在像用化学治疗那样有药物残留和药物中毒的问题。     

大黄鱼ATG5基因的分子特征及促进病毒增殖的作用研究

自噬是维持真核细胞稳态的重要过程，在细胞分化、发育、免疫等生理过程中发挥作用。目前，人们对于自噬相关基因（Autophagy related gene，ATG）在鱼类免疫应答中的功能仍知之甚少。本研究从大黄鱼（Larimichthys crocea）中克隆得到了自噬相关基因ATG5（LcATG5），其开放阅读框（ORF）全长828个核苷酸，编码275个氨基酸的蛋白质，预测的分子量为32.3 kD，等电点为5.7。氨基酸序列比对和系统进化分析结果显示，LcATG5与其他物种ATG5之间的序列一致性较高，含有1个高度保守的APG5结构域，并且与棘头梅童鱼（Collichthys lucidus）ATG5的亲缘关系最近。荧光定量PCR结果表明，LcATG5在所检测的11个组织或器官中均有表达，在血液中表达量最高，在脾脏中表达量最低；LcATG5在来源于大黄鱼头肾组织的原代粒细胞、淋巴细胞和巨噬细胞以及细胞系LYCK细胞中也均有表达，在原代粒细胞中表达量相对较高，而在巨噬细胞中相对较低；病毒类似物poly(I:C)刺激后，这4种免疫细胞中LcATG5的表达水平都显著上调，其在LYCK细胞中变化最为显著，刺激后12 h上调了3.93倍。过表达LcATG5的鲤上皮瘤（Epithelioma papulosum cyprinid, EPC）细胞受鲤春病毒血症病毒（Spring Viremia of Carp Virus, SVCV）感染48 h后，细胞病变效应（Cytopathic effects, CPE）明显高于对照组，细胞培养上清中SVCV的滴度为1013.82 TCID50/Ml，高于对照组109.27 TCID50/mL，同时细胞内SVCV标志基因SVCV-G、SVCV-M和SVCV-P的表达量分别上调了13.77倍、15.72倍和11.39倍，表明LcATG5过表达促进了EPC细胞中SVCV病毒增殖，这些结果为深入研究自噬和自噬相关基因在鱼类病毒感染过程中的作用及机制奠定了基础。     

蛋鸡禽致病性大肠杆菌分离鉴定及噬菌体制剂体外杀菌研究

为研究噬菌体制剂对蛋鸡禽致病性大肠杆菌病的治疗效果,从某蛋鸡养殖场采集疑似禽致病性大肠杆菌感染的病料,进行病原的分离鉴定、生物学特性分析和药物敏感试验等操作,选择其中代表性菌株开展噬菌体制剂体外杀菌试验。结果可见有深紫黑色且带金属光泽细菌生长;镜检可见呈红色两端钝圆的短杆菌;生化鉴定,符合大肠杆菌的生化特性;PCR检测和序列分析结果表明为大肠杆菌。累计从152份样品中分离到大肠杆菌49株,药敏试验结果显示49株分离菌对环丙沙星、阿莫西林、头孢他啶、强力霉素、复方新诺明、林可霉素等耐药率分别高达89.8%、89.8%、93.6%、98.0%、85.7%、100%,临床耐药情况严重。选用5株代表性菌株开展噬菌体制剂体外杀菌试验,与氟苯尼考相比,噬菌体制剂体外杀菌效果更优。复合噬菌体制剂可用于蛋鸡禽致病性大肠杆菌病的治疗。     

噬菌蛭弧菌及其微生物生态制剂在水生动物养殖上的应用——噬菌蛭弧菌及其微生物生态制剂在水生动物养殖上的应用

近几年，随着水产品健康养殖理念的不断深入人心，健康养殖技术的逐步推广以及政府有关部门对渔药使用监管力度的日益增大，抗生素及其它化学合成药物在水产养殖中的使用已经受到并将进一步受到严格禁止或限制。与此同时，与水域生态环境相对友好的微生物生态制剂因其具有改善养殖水体的水质和底质、提高养殖水生动物对疾病的抵抗能力、减少药物的使用量和残留等特点，在水生动物养殖中得到越来越广泛的应用。其中有一个发展迅速、异军突起的微生物生态制剂，那就是噬菌蛭弧菌微生物生态制剂。跟其它微生物生态制剂相比，噬菌蛭弧菌具有“寄生”和“溶解”细菌的特性，噬菌蛭弧菌微生物生态制剂的生产工艺特殊，但它对生产的工艺技术和应用等都有较高的要求，如果生产或应用不当，效果往往会适得其反。为此，本刊特约长期从事噬菌蛭弧菌及其微生态制剂研究，原中国医学细菌保藏管理中心弧菌噬菌体专业研究室主任秦生巨研究员就噬菌蛭弧菌的基本特性、研究概况、作用机制以及生态制品的应用等内容进行系统、详尽的论述，并以连载的方式刊出。期望能对广大读者比较全面、系统地了解和正确应用噬菌蛭弧菌及其微生物生态制剂有所帮助。[编者按]