半滑舌鳎食欲素A体外重组表达及活性分析

为了在蛋白水平上认识半滑舌鳎食欲素A(orexin A)的摄食调控作用及机制,利用原核表达载体pET32a成功构建了重组半滑舌鳎orexin A/pET32a质粒,转化至大肠杆菌BL21后经IPTG诱导获得了N端含6个组氨酸的半滑舌鳎orexinA重组蛋白。获得的重组蛋白大小为24.9 ku,32℃下用1.0 mmol/L的IPTG诱导6 h目的蛋白表达量最高,占菌体总蛋白的52.8%,并主要分泌在上清液中。Western blotting免疫印迹表明,获得的orexin A重组蛋白可被6×His抗体特异性识别。Ni~(2+)-NTA亲和层析柱纯化获得了高纯度的半滑舌鳎orexin A重组蛋白。下丘脑离体孵育实验表明,获得的orexin A重组蛋白能显著影响半滑舌鳎下丘脑NPY mRNA,orexin mRNA的表达水平和NPY肽的分泌,表明获得的重组蛋白具有生物活性。研究结果可为探究orexin A在半滑舌鳎摄食代谢中的作用机制及研制高效绿色的促摄食制剂提供基础资料。     

半滑舌鳎黑色素聚集激素重组制备与生物活性分析

根据半滑舌鳎黑色素聚集激素(MCH1)的c DNA序列设计特异性引物扩增成熟肽片段,利用原核表达载体p ET-32a成功构建了重组MCH1/p ET32a质粒,转化大肠杆菌BL21(DE3)后经IPTG诱导可产生N端含6个组氨酸的重组蛋白。半滑舌鳎MCH1重组蛋白大小为29.9 ku,32°C条件下以0.2 mmol/L IPTG诱导6 h时目的蛋白表达量最高,占菌体总蛋白的49.8%。Western blotting免疫印迹表明,MCH1重组蛋白可被6×His抗体特异性识别。经Ni2+-NTA亲和柱纯化,可获得高纯度的MCH1重组蛋白。采用垂体离体孵育方法测试蛋白活性,MCH1重组蛋白可有效刺激或抑制垂体MCH和MSH肽的分泌,MCH肽水平先上升后下降,在100 nmol/L达到峰值,MSH肽水平显著升高。随着外源MCH1重组蛋白浓度的增加,垂体MCH1和MCH2 m RNA表达都呈现先上升后下降的趋势,POMCa和PACAP m RNA表达都呈现明显下降趋势,而POMC-b、MCHR1、MCHR2、MITF基本没有变化,表明获得的半滑舌鳎MCH1重组蛋白具有调节垂体激素分泌和基因表达的生理功能。本研究可为研制半滑舌鳎无眼侧黑化调控的专用生物制剂提供理论与技术依据。     

半滑舌鳎两种leptin基因的体外重组表达和生物活性分析

根据半滑舌鳎lepa和lepb编码氨基酸序列合成开放阅读框ORF肽段。利用原核表达载体pEQ30成功构建了半滑舌鳎lepa/pQE30和lepb/pQE30重组质粒,分别转化至大肠杆菌M15后,经IPTG诱导获得了N端含6个组氨酸的半滑舌鳎LepA和LepB重组蛋白。获得的重组蛋白大小均为16 ku,37°C下用0.5 mmol/L的IPTG诱导4 h后目的蛋白表达量最高,主要以包涵体形式存在。检测半滑舌鳎LepA和LepB重组蛋白浓度分别为0.3和0.25 mg/mL。Western blot免疫印迹和质谱分析表明,获得的LepA和LepB重组蛋白均具有免疫活性且序列正确。Ni2+-NTA亲和层析柱纯化可获得高纯度的半滑舌鳎LepA和LepB重组蛋白。离体孵育实验表明,获得的半滑舌鳎LepA和LepB重组蛋白能显著抑制半滑舌鳎下丘脑lepa、lepb和gnrh3 mRNA的表达水平,表明获得的重组蛋白具有明显的生物活性。研究结果可为探究leptin在半滑舌鳎生长发育中的调控机制提供重要参考。     

半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis Günther)IGF-Ⅱ的体外重组表达

为在蛋白水平认识半滑舌鳎类胰岛素生长因子Ⅱ(IGF-Ⅱ)的生理功能,将IGF-Ⅱ成熟肽序列克隆到原核表达载体pET-28a中,成功构建了重组半滑舌鳎IGF-Ⅱ/pET28a质粒,导入到E. coli BL21(DE3)菌株后经IPTG诱导,获得了大小为11.4 kDa的重组IGF-Ⅱ蛋白,N端含6个组氨酸,可特异性地被6×His抗体识别。重组IGF-Ⅱ蛋白在最优诱导条件37℃诱导2 h,目的蛋白表达量占重组表达菌总蛋白的43.7%,重组蛋白主要以包涵体存在。将获得的重组蛋白包涵体经变性、纯化和复性后,获得了纯化的IGF-Ⅱ重组蛋白,其可在体外显著促进人乳腺癌MDA231细胞的增殖,表明IGF-Ⅱ重组蛋白具有体外细胞水平的生物活性。本研究结果可为认识鱼类IGF-Ⅱ生理功能及半滑舌鳎生长调控机制提供理论支撑。     

半滑舌鳎类胰岛素生长因子-Ⅰ的原核表达及活性分析

根据半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis Güther)类胰岛素生长因子-Ⅰ(IGF-I)基因的cDNA序列, 设计引物扩增编码IGF-I成熟肽序列, 此序列由210个碱基组成, 包括B-C-A-D 4个功能域。利用PCR方法将扩增片段克隆到原核表达载体pET-28a上, 得到重组质粒, 将重组质粒导入到大肠杆菌BL21( DE3)后经IPTG诱导产生N端含6个组氨酸的融合蛋白。以SDS-PAGE电泳检测和SigmaScan软件分析获得的多肽, 结果表明: IGF-I融合蛋白大小为11.4 kD, IPTG诱导3 h时目的蛋白表达量最高, 占细菌总蛋白的58.5%, 1 L菌液表达目的蛋白40.7 mg, 主要以包涵体形式存在。利用Western-blotting方法验证融合蛋白可特异性的被6×His抗体识别。诱导表达后的菌液沉淀经6 mol/L盐酸胍变性、Ni²⁺离子亲和柱纯化和尿素梯度复性, 获得大小为11.4 kD的纯化蛋白。细胞增殖实验表明, IGF-I融合蛋白可显著促进乳腺癌细胞MDA231细胞的增殖, 具有生物学活性。本研究通过原核表达技术获得了体外重组的具有生物活性的半滑舌鳎IGF-I融合蛋白, 结果可为半滑舌鳎生长调控技术研究提供基础资料。

     

半滑舌鳎颗粒酶B基因的克隆和表达分析

颗粒酶(granzyme, Gzm) B是免疫炎症反应必不可少的介质,可激活半胱天冬酶3,进而诱导靶细胞的凋亡。本研究通过PCR扩增和RACE技术获得了半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)颗粒酶B基因(CsGzmBl)的全长cDNA序列,并对其序列特征和表达水平进行了分析。结果显示,CsGzmBl cDNA全长为923 bp,开放阅读框长度为780 bp,编码259个氨基酸(前19个氨基酸残基为信号肽序列),5′非编码区为49 bp,3′非编码区为94 bp。CsGzmBl的基因组结构比较保守,由5个外显子和4个内含子组成。CsGzmBl蛋白包含2个N端糖基化位点、1个催化三联体“His63Asp112Ser207”、1个“PHSRPYMA”结构域及6个保守的半胱氨酸。荧光定量PCR结果显示,CsGzmBl在半滑舌鳎健康成鱼不同组织中均有表达,其中,在脾脏中表达量最高,头肾、中肾、肝脏和鳃中表达量次之,在肌肉中表达量最低。与对照组0 h相比,CsGzmBl在哈维氏弧菌(Vibrio harveyi)感染后的不同时间点的脾脏、肠、肝脏、皮肤、鳃和肾脏中的表达水平均有不同程度的上调。研究表明,CsGzmBl基因在半滑舌鳎抵御哈维氏弧菌感染过程中发挥重要作用。     

半滑舌鳎生长因子midkine的定点改造及原核表达

为进一步研究半滑舌鳎midkine(MK)成熟肽活性与功能,对半滑舌鳎生长因子MK成熟肽进行定点改造及原核表达.根据大肠杆菌偏爱密码子的特点,实验利用SOEing PCR法对半滑舌鳎MK成熟肽进行定点突变.将改造后的半滑舌鳎成熟肽MK克隆到载体质粒pET32a(+),构建原核表达载体pET32a(+)-MK,并转化至大肠杆菌BL21(DE3) pLysS菌株中.SDS-PAGE结果显示,与对照组相比,经IPTG诱导表达后半滑舌鳎重组蛋白MK存在于大肠杆菌上清液中,产物相对分子质量约为33 ku.研究表明,本实验对半滑舌鳎生长因子midkine成功进行了定点改造,原核表达质粒成功构建并在大肠杆菌中高效表达,且主要以可溶形式存在.     

半滑舌鳎染色体核型分析

The tonguefish Cynoglossus semilaevis (Giinther) is a rare fish species in Chinese offing, inhabiting in the warm water bottom. The metaphase chromosome preparation of the fries has been got from their fins by hot air drying methods, while the metaphase chromosomes of one year old young fish which has physiologically sex differentiation has teen got from their renal tissues by the method of PHA and colchicine injection. The karyotypes were examined. The result shows that there are 42 acrocentric chromosomes in diploid and their karyotype formula is 2n = 42t, and there existed heterotypic sex chromosome which belongs to ZW/ZZ type. The sex ratio in artificial bred stock is nearly 1 : 1.     

半滑舌鳎精子冷冻保存

半滑舌鳎精子冷冻保存对于人工繁殖育苗、杂交育种、雌核发育及其性别控制研究具有重要的意义,为此,本文对半滑舌鳎精子冷冻保存方法进行了研究。分别利用2．8mol／L的二甲基亚砜（DMSO）、甘油（Gly）和1,2-丙二醇（PG）冷冻保存该鱼精子。结果显示,DMSO冷冻保存精子的活力较高。利用MPRS＋2．8mol／L DMSO以1：0．5、1：1、1：1．5和1：2的比例稀释并冷冻精子,1：1比例在冻前能够抑制精子的运动,冻后活力可达82．50±3．54％,显著高于其他稀释比例（P〈0．05）。分别利用冷冻保存液A（MPRS＋2．8mol／L DMSO）和B（TS-2＋2．8mol／LDMSO）稀释平衡精子,精子在A中的冻前快速运动时间、寿命分别为37．75±6．45S和145．00±78．98S,与鲜精无显著差异（P〉0．05）。利用以上两种冷冻稀释液冷冻保存精子,精子在A液中的冻后活力和寿命分别可达53．50±6．69％和98．00±13．51s,冷冻效果优于B液（P〈0．05）。冷冻后精子的受精率和孵化率分别为55．00±5．00％和35．00±13．23％,受精率与鲜精无显著性差异（P〉0．05）,因此认为MPRS＋2．8mol／L DMSO可用于半滑舌鳎精子的冷冻保存。     

半滑舌鳎生长激素及其受体基因的原核表达

根据已克隆的半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)生长激素(GH)基因和生长激素受体Ⅰ(GHR-Ⅰ)基因的cDNA序列信息设计引物,用于扩增半滑舌鳎GH、GHR-Ⅰ基因序列。随后,分别利用表达载体pET-32a和pGEX-6P-1成功构建了包含半滑舌鳎GH、GHR-Ⅰ基因ORF全序列及不同ORF片段的6个重组质粒,并将获得的重组质粒在表达宿主菌大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(DE3)中,用IPTG诱导表达。SDS-PAGE电泳结果显示:重组GH的pET-32a-CSGH质粒在40 kD处有特异性的蛋白条带,重组GHR-Ⅰ胞内区的pGEX-6P-1-CSGHR1-2质粒在70 kD处发现诱导的蛋白条带,其表达量分别占细胞蛋白总量的37.6%和20.2%;而构建的pGEX-6P-1-CSGH重组质粒和含有GHR-Ⅰ基因跨膜区的重组质粒(pET-32a-CSGHR1-1、pET-32a-CSGHR1-2和pGEX-6P-1-CSGHR1-1)均未获得表达产物。由此可见,半滑舌鳎GHR-Ⅰ基因的跨膜区可能影响其在大肠杆菌中的表达。研究结果为实现半滑舌鳎GH、GHR-Ⅰ制剂的开发及应用于养殖生产实践奠定基础。     

哲罗鲑胰岛素样生长因子-I的原核表达及活性鉴定

为进一步了解哲罗鲑IGF-I,实验采用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)方法,从哲罗鲑肝脏的总RNA中扩增出胰岛素样生长因子-I(IGF-I)的c DNA开放阅读框(open reading frame,ORF)序列。利用原核表达载体p S构建重组表达质粒(IGF-I/p S),并将其转化到宿主大肠杆菌Rosetta后经IPTG诱导获得重组哲罗鲑IGF-I蛋白。经SDS-PAGE电泳检测,在35~50 ku有条带与预期相符,且重组蛋白以包涵体的形式存在。包涵体经变性/复性实验后,获得纯化的IGF-I融合蛋白。ELISA鉴定结果显示,目的蛋白能特异性识别抗鱼类IGF-I抗体,表明获得了具有免疫活性的哲罗鲑IGF-I蛋白。细胞增殖实验(MTT法)结果显示,重组IGF-I蛋白对大麻哈鱼胚胎细胞(CHSE-214)、鲤上皮细胞(EPC)及虹鳟性腺细胞(RTG-2)均有显著促增殖作用,表明获得的重组IGF-I蛋白具有细胞水平的生物活性。本研究为深入了解IGF-I在哲罗鲑生长发育中的调控机制及绿色高效促生长制剂的研发奠定基础。     

半滑舌鳎TRAF6 基因和TAK1 基因的克隆及表达分析

本研究通过同源克隆和RACE技术获得了半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)肿瘤坏死因子受体相关因子6(tumor necrosis factor receptor-associated factor 6,TRAF6)和转化生长因子β激活激酶1(transforming growth factor-β-activated kinase 1,TAK1)的c DNA全长,并分析了其在不同组织和早期胚胎发育时期的表达情况。结果表明,TRAF6 c DNA全长1956 bp,开放阅读框(ORF)为1731 bp,编码576个氨基酸。二级结构预测显示TRAF6具有保守的蛋白结构域:N端的RING结构,两个锌指结构以及C端的环–环(coiled-coil)α螺旋结构和高度保守的MATH同源结构。TAK1 c DNA全长2519 bp,ORF为1731 bp,编码576个氨基酸。TAK1的蛋白结构域包括丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶激活结构域和C端的环–环(coiled-coil)α螺旋结构域。系统进化树分析表明,半滑舌鳎TRAF6和TAK1分别与牙鲆(Paralichthys olivaceus)TRAF6和TAK1聚为一支,亲缘关系最近。荧光定量PCR结果显示,TRAF6和TAK1在所检测的8种组织中都有表达,TRAF6在鳃中的表达最高,肠中也有较高的表达;TAK1在心脏中的表达量最高,其次是肾。TRAF6和TAK1在鳃、肾等免疫器官中的高表达,与其在Toll样受体信号通路中的重要作用是一致的。对TRAF6和TAK1在早期胚胎发育时期的表达情况进行检测,结果显示,在未受精卵中可检测到TRAF6和TAK1,提示了这两种免疫分子的母源性m RNA遗传的可能性。免疫分子母源性m RNA可能参与发育过程,也可能参与构建免疫体系,以保护胚胎或仔鱼免受病原体的侵袭。     

近缘新对虾cyclin B基因的克隆与原核表达

采用RACE技术,克隆了近缘新对虾cyclinB基因,该序列全长1 667 bp,编码区1 209bp共编码402个氨基酸,所推导的氨基酸序列N端不存在信号肽.BLAST比对后发现,其氨基酸序列与刀额新对虾的同源性达90％.经RT-PCR检测,cyclin B基因在近缘新对虾的卵巢和肌肉中表达水平最高,胸神经节和心脏次之,鳃、眼柄神经节、肝胰腺几乎没有表达.推测主要与cyclin B在细胞周期中调控细胞分裂的功能有关.原核表达结果显示,pET32a表达载体在0.2 mmol/L IPTG、25℃诱导4h条件下可得到纯度较高的分子量约67 ku的蛋白.     

四个舌鳎育种群体表型性状及线粒体COⅠ和Cyt b基因比较分析

对半滑舌鳎、黑鳃舌鳎和短吻三线舌鳎2个自然群体(Ca1和Ca2)的21个可量性状进行了测定,利用单因素方差分析(One-Way ANOVA)和Student-Newman-Keuls多重比较法,对21个可量性状进行分析和比较。结果发现,短吻三线舌鳎2个群体之间无显著性差异性状达71.43%,半滑舌鳎与短吻三线舌鳎具有显著性差异性状达71.43%,黑鳃舌鳎与短吻三线舌鳎具有显著性差异性状达66.67%~71.43%,半滑舌鳎与黑鳃舌鳎具有显著性差异性状达57.14%。对4个舌鳎群体线粒体(mtDNA)细胞色素氧化酶Ⅰ亚基(COⅠ)和细胞色素b(Cyt b)基因进行克隆,在GenBank上未发现与黑鳃舌鳎同缘的COⅠ和Cyt b序列,说明黑鳃舌鳎COⅠ和Cyt b基因是首次被克隆,登录号分别为JQ937270 and JQ937271。3种舌鳎的COⅠ和Cyt b基因碱基含量分析显示,G含量最低,T含量均为最高,并且AT含量要高于GC。利用COⅠ和Cyt b序列分别检测舌鳎4个群体种内、种外遗传距离,并构建的NJ系统进化树,结果显示:半滑舌鳎与黑鳃舌鳎遗传距离分别为0.047~0.050和0.045,半滑舌鳎与短吻三线舌鳎分别为0.129~0.132和0.161~0.166,黑鳃舌鳎与短吻三线舌鳎分别为0.123~0.126和0.162~0.172,短吻三线舌鳎种内外遗传距离分别为0.002和0.002~0.004,半滑舌鳎与黑鳃舌鳎亲缘关系较近,它们与短吻三线舌鳎的亲缘关系较远,短吻三线舌鳎种内分化未达到种群分化的程度。研究表明,COⅠ和Cyt b基因完全可作为3种舌鳎种质鉴定的DNA条形码。     

半滑舌鳎白化现象的初步研究

通过建立半滑舌鳎家系对其白化现象进行了初步研究。实验共建立半滑舌鳎家系17个,首先对这17个家系白化率进行了抽样统计和方差分析,并对部分家系的白化个体的眼睛异常率进行了统计;其次,选取其中白化率较高的4个家系,对白化个体和正常个体的生长情况进行了对比;最后,对白化率较高的4个家系白化个体和正常个体的抗鳗弧菌病能力进行了比较。结果发现,不同家系个体白化率有较大的差别,3号家系白化率最高,高达94.50%,15号、33号和37号家系白化率为0.00%;父本为养殖群体的家系的平均白化率最高,为19.68%,父本为野生群体的家系的平均白化率最低,为3.21%,父本为选育群体的平均白化率为7.50%,但3者之间差异不显著(P0.05);3个家系的白化个体眼睛异常率较高,5号家系为48.48%、10号家系为45.83%和12号家系为88.89%。选取4个家系对其白化个体和正常个体的生长情况进行比较发现,同一家系中3~4月龄白化个体在全长、体宽和体质量方面均显著或极显著小于正常个体,但生长至12~13月龄时,这种差异基本不显著,1号和17号家系白化个体的全长、体宽和体质量甚至超过了同家系的正常个体;1号和17号家系白化个体的日增重分别超过了同家系的正常个体。对选取的4个家系的白化个体和正常个体进行鳗弧菌感染实验发现,白化个体的死亡率均低于同家系正常个体,1号和17号家系的白化个体的抗病性相对同家系正常个体较突出,死亡率分别比正常个体低24.92%和20.25%。研究表明,半滑舌鳎野生群体的后代白化率较低,白化现象会伴随一定比例的眼睛异常,白化个体初期生长较慢,后期生长加快,甚至会超过正常个体,并且同一家系中白化个体的抗病性要优于正常个体。     

草鱼天然抗性相关巨噬蛋白基因的表达特征与蛋白表达

为探讨Nramp基因在草鱼(Ctenopharyngodon idellus)免疫应答中的作用,采用实时荧光定量PCR技术,对比研究了Nramp基因在草鱼不同发育阶段、不同组织及嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)攻毒感染后4个组织不同时间的差异表达,并利用原核表达技术对草鱼Nramp基因ORF区642 bp的目的片段进行蛋白表达,获得40 k D的融合蛋白。实时荧光定量PCR分析结果表明,Nramp在草鱼胚胎发育过程中的表达量随着发育时间的增加而逐渐增强,在幼鱼期的表达量达到最大。成年健康草鱼不同组织中的表达量差异显著(P0.05),在肝中的表达量最高,其次是在脾、头肾、肠中的表达量较高,而在眼和鳔中的表达量最低。草鱼感染嗜水气单胞菌后,在头肾、肝、脾、肠中Nramp的表达量都显著上升(P0.05),在头肾中感染12 h后显著上升,48 h达到最大,在72 h和96 h时又显著下调,在7 d时表达量继续下调而逐渐回归到初始水平;在肝中Nramp基因的表达量在4 h时出现下调,在12 h又显著上调,随后在24 h出现下调,在48 h又上调,72 h达到最大并保持较高水平到7 d;在肠中m RNA表达量在12 h显著上调,48 h达到最大,在72 h和96 h显著下调,在7 d时表达量基本回归到初始水平;在脾中m RNA表达量在4 h开始上升,12 h达到最大,在24 h和48 h表达水平显著下调,在7 d时表达量回归到初始水平。草鱼感染致病菌可引起免疫相关组织中Nramp的表达量上升,说明Nramp在硬骨鱼类的天然免疫反应过程中发挥着重要作用。