甘蓝型油菜磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的研究分析

为了解甘蓝型油菜(Brassica napus)中磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPC)基因的表达和分布情况,文章首先分析了油菜和拟南芥中PEPC基因之间的关系,同时参照拟南芥中4条PEPC基因扩增了针对甘蓝型油菜的探针,Southern blot结果表明,甘蓝型油菜中PEPC基因肯定多于4条,而RT-PCR分析了不同时期种子中的PEPC基因的表达情况,表明PEPC基因在种子成熟过程中油脂、储藏蛋白质等贮存物质的积累有一定作用。     

甘蓝型油菜雄性不育基因BnaX.MS1.a的克隆及其amiRNA载体的构建

根据拟南芥MS1基因已知保守序列设计特异性引物,分离克隆甘蓝型油菜中与拟南芥MS1基因同源的基因片段。应用PCR-Walking技术获得甘蓝型油菜核雄性不育基因BnaX.MS1.a,其全长3 424 bp。BnaX.MS1.a基因与拟南芥MS1基因全长序列同源性为60.3%,编码序列同源性为89.5%。根据基因序列比对结果推测开放阅读框长2 004 bp,编码667个氨基酸,分子量为765 kD,等电点为8.01。BnaX.MS1.a基因编码的氨基酸序列与已知拟南芥MS1基因编码的氨基酸序列同源性达93%。构建BnaX.MS1.a基因的amiRNA载体转化甘蓝型油菜,旨在研发核不育基因工程油菜。     

野桑蚕细胞色素P450氧化酶活性测定及CYP9家族基因的诱导转录

采用酶标板酶活性动力学法检测了氯氰菊酯诱导苏大野桑蚕中肠和脂肪体的PNOD活性。结果表明：氯氰菊酯诱导24 h,脂肪体、中肠PNOD活性分别增加了18.7%,12.2%。根据野桑蚕CYP9A20基因(GenBank登录号：FJ378716)、CYP9A21基因(GenBank登录号：FJ265741)、CYP9A22基因(GenBank登录号：EF535806) 和CYP9G3基因片段设计引物,用半定量RT-PCR方法分析了氯氰菊酯诱导野桑蚕CYP9家族基因的表达水平。结果表明,氯氰菊酯诱导24 h,CYP9A21基因在中肠的mRNA表达量是对照的2.1倍,CYP9A20,CYP9A21,CYP9G3基因在脂肪体的mRNA表达量是对照的1.9,3.5,1.4倍。推测野桑蚕CYP9A21等基因的过量表达可能导致野桑蚕对氯氰菊酯氧化解毒代谢的增强。     

玉米质膜内在蛋白ZmPIP2;6响应渗透、盐和 干旱胁迫的功能鉴定

【目的】质膜内在蛋白（plasma membrane intrinsic proteins,PIPs）广泛存在于植物细胞的膜系统上,在植物体内水分运输和水分平衡的过程中至关重要。对ZmPIP2;6在植物水分胁迫耐性中的功能进行探究,为玉米培育抗旱耐盐新品种提供优秀基因资源。【方法】分析并比对ZmPIP2;6与其他物种中报道参与水分胁迫的PIPs的氨基酸序列,构建ZmPIP2;6-GFP载体并通过PEG介导转化玉米原生质体,对ZmPIP2;6进行亚细胞定位。采集玉米的不同组织样品,包括根、茎、叶、未成熟雄穗、未成熟雌穗、胚和胚乳;对玉米进行PEG或NaCl处理,在处理的不同时间点采集玉米的根和叶样品。提取总RNA并通过qRT-PCR调查ZmPIP2;6在玉米不同组织以及在水分胁迫下的表达模式。构建ZmPIP2;6超表达载体,发展并鉴定ZmPIP2;6超表达拟南芥材料,观察转基因植株对渗透、盐及干旱胁迫的耐性生理表型,并测量其根长、叶片水分散失率等性状。检测在干旱或盐胁迫条件下,拟南芥胁迫信号通路上的相关基因在ZmPIP2;6超表达植株中的表达。【结果】氨基酸序列分析比对结果显示ZmPIP2;6具有PIP蛋白的典型结构与并且其他物种的PIP蛋白具有很高的同源性。转化玉米原生质体试验结果显示ZmPIP2;6蛋白定位在细胞质膜。qRT-PCR结果显示ZmPIP2;6在玉米未成熟雄穗中表达量最高,并且在玉米受到渗透和盐胁迫后根和叶中的ZmPIP2;6表达受到显著诱导。在MS固体培养基上进行渗透胁迫处理和盐胁迫处理以及进一步的土培试验中进行干旱胁迫处理,ZmPIP2;6超表达拟南芥植株相对野生型都显示出更强的胁迫耐性。在干旱或盐胁迫条件下,拟南芥胁迫信号通路上的相关基因在ZmPIP2;6超表达植株中的表达受到不同程度的影响。【结论】玉米内在质膜蛋白基因ZmPIP2;6在渗透或盐胁迫下表达上调,在拟南芥中超表达ZmPIP2;6会增强植株对渗透、盐和干旱胁迫的耐性,并且在盐或干旱胁迫条件下会影响拟南芥中胁迫相关基因的表达。ZmPIP2;6可能参与植物水分胁迫响应过程。     

水稻1,3,4-三磷酸肌醇5/6-激酶基因的电子克隆及表达

利用电子克隆的基因克隆策略,以拟南芥1,3,4-三磷酸肌醇5/6-激酶AtITL1的cDNA序列为信息探针,在水稻基因组数据库搜索到高度同源的水稻基因组序列,通过人工序列拼接及RT-PCR方法克隆得到了水稻编码1,3,4-三磷酸肌醇5/6-激酶类似物的基因OsITL1的全长cDNA序列。RNA凝胶印迹分析表明,OsITL1基因的表达在转录水平上受NaCl、干旱及ABA的诱导,OsITL1可能参与了一些非生物胁迫的应答过程,在逆境条件下的基因转录和磷酸肌醇信号转导途径的调控中起重要作用。     

水稻OsHOX6启动子的组织特异性表达

【目的】研究水稻HD-ZipⅠ转录因子家族的成员OsHOX6基因启动子的表达。【方法】通过构建水稻OsHOX6基因启动子与GUS基因融合表达载体,利用农杆菌(Agrobacterium)介导,以未成熟水稻胚作为试验材料,转化到水稻IR64,通过PCR检测和潮霉素抗性筛选出阳性的转基因植株,从不同组织取样品,进行X-Gluc染色并观察。【结果】转基因植株的叶、根、茎、花等器官经过X-Gluc染色后,主要在侧根、花粉以及组织损伤部分出现蓝色斑点,其它组织均未检测出蓝色斑点,观察根解剖结构,绿色斑点集中在根内皮层。【结论】 水稻OsHOX6基因启动子能够驱动GUS基因,在转基因水稻侧根和花粉上特异表达。     

大豆GmbZIP16的抗旱功能验证及分析

【目的】通过分析干旱条件下大豆的转录组数据,筛选获得大豆锌指蛋白GmbZIP16,对其进行功能验证,确定GmbZIP16参与大豆抵抗干旱的分子机理。【方法】大豆干旱转录组数据分析得到上调倍数较高的锌指蛋白GmbZIP16,以大豆cDNA为模板克隆获得GmbZIP16。并通过In-Fusion连接酶技术,构建pCAMBIA1302- GmbZIP16和pCAMBIA3301-GmbZIP16表达载体。通过液氮冷冻法将重组载体pCAMBIA1302- GmbZIP16和pCAMBIA3301-GmbZIP16分别转入农杆菌GV3101和大豆发根农杆菌K599的感受态细胞中,通过农杆菌侵染拟南芥花序以及大豆子叶节技术,产生过表达拟南芥植株以及过表达大豆毛状根复合体植株。通过半定量RT-PCR和qRT-PCR分析,确定GmbZIP16在转基因拟南芥和大豆毛状根中能够超表达。分别将正常条件下生长2周龄的转基因和野生型拟南芥植株转移至含有不同PEG浓度（6% PEG和8% PEG）的MS0培养基上继续培养7 d,观察转基因拟南芥和对照野生型拟南芥之间的生物量差异;利用qRT-PCR分析转基因拟南芥和野生型拟南芥植物体中胁迫相关的基因表达情况。将生长良好的转GmbZIP16大豆毛状根复合体施加25% PEG处理1周后,分别采取转GmbZIP16大豆毛状根复合体和转空载体大豆毛状根复合体的叶片,用酶标仪测定植株的脯氨酸、丙二醛和叶绿素的含量。【结果】通过PCR技术扩增得到正确的GmbZIP16序列,通过农杆菌转化技术得到2个稳定过表达的转GmbZIP16拟南芥株系。通过对转基因拟南芥的表型鉴定发现转基因拟南芥在干旱处理下的生物量（鲜重和根长）及存活率比野生型显著提高。在过表达GmbZIP16拟南芥植株中,一些与胁迫相关的基因的表达要高于在野生型,如RD29B、DREB2A和P5CS。转GmbZIP16大豆毛状根复合体植株在25% PEG处理1周后,大豆毛状根复合体叶片中叶绿素和脯氨酸的含量要显著高于转空载体大豆毛状根复合体叶片中叶绿素和脯氨酸的含量,而转GmbZIP16大豆毛状根复合体叶片中丙二醛的含量显著低于转空载体大豆毛状根复合体叶片中丙二醛的含量。【结论】在拟南芥中过表达大豆GmbZIP16提高了转基因拟南芥的抗旱性。过表达GmbZIP16可以提高转基因大豆毛状根复合体对干旱的抗性。GmbZIP16提高植物的抗旱性主要是通过影响与抗逆相关基因的表达来实现的。     

玉米MATE基因在植物生长发育和下胚轴伸长中的调控作用

【目的】研究玉米多药及有毒化合物外排家族(multidrug and toxic compound extrusion,MATE)基因ZmMATE884(GRMZM2G423884)在植物生长发育阶段的功能。【方法】以玉米全基因组DNA为模板克隆玉米MATE蛋白家族基因ZmMATE884,通过蛋白同源比对,预测其可能的跨膜结构域,并通过定量RT-PCR分析该基因的表达模式;构建ZmMATE884融合荧光蛋白瞬时表达载体,转化拟南芥叶肉细胞原生质体,进行亚细胞定位分析;通过农杆菌侵染技术,构建ZmMATE884基因的拟南芥转基因过表达系,观察表型;将ZmMATE884基因的拟南芥转基因过表达系与野生型种子分别种植于含质量分数1%蔗糖和不含糖的1/2 MS固体培养基上,分别黑暗培养6d和光照培养7d后,观测统计下胚轴的伸长情况。【结果】ZmMATE884基因在玉米根、上枝叶、下枝叶和胚中有较高表达;ZmMATE884蛋白部分定位于高尔基体/内体上;ZmMATE884基因的拟南芥过表达转基因植株表现为莲座叶发生速率加快且开花提前;在无糖和含质量分数1%蔗糖的1/2 MS固体培养基上黑暗生长6d及光下生长7d后,ZmMATE884基因的拟南芥转基因过表达系下胚轴明显短于野生型。【结论】玉米ZmMATE884基因参与了植物生长发育的调控,可加快莲座叶发生,促使植物提前开花,同时还参与下胚轴伸长的负调控。     

植物LHP1同源基因研究进展

拟南芥LIKE HETEROCHROMATIN PROTEIN 1 (LHP1)/TERMINAL FLOWER 2(TFL2)基因被认为是后生动物HP1的同系物.在动物中,HP1通常参与异染色质形成及基因沉默.与HP1不同,LHP1定位于常染色质并抑制位于常染色质中众多基因的表达.拟南芥LHP1/TFL2突变体表现出多重表型,如早花、降低对光周期敏感性、顶端花序和植株矮小.目前对LHP1的研究特别是在单子叶植物水稻中的研究,仅限于蛋白表达谱差异,而未在基因序列及基因表达调控水平上作深入的研究.鉴于拟南芥LHP1的重要功能,今后需对LHP1同源基因在不同物种特别是单子叶植物水稻中的功能进行深入研究;此外,还应加强不同物种LHP1进化的关系分析、LHP1在不同物种整个生育期的表达谱、单子叶植物水稻中lhp1突变体的功能表达及LHP1在开花调控网络中的定位等方面的研究.     

浙江省水稻产量构成差异调查与合理种植密度分析

对浙江省23个水稻主栽品种、236块稻田产量的实际调查情况表明,水稻的产量差异普遍存在于品种和田块间,从变异系数看,每穗粒数和有效穗数的变异系数均显著大于千粒重,是导致品种间和田块间产量差异的主要因素。相关分析表明,不同类型水稻的产量均与每穗粒数的相关性最大,其中双季晚籼稻和单季常规粳稻分别达极显著和显著正相关,大穗品种的产量相对较高。水稻的产量随种植密度的增加先增加后下降,对单季籼稻,种植密度在（1.00～1.20）万丛/667m²时,出现产量>650 kg/667m²的概率较大,而种植密度在（1.20～1.40）万丛/667m²时,出现产量<500 kg/667m²和>650 kg/667m²的概率均较小,稳产的把握较高;对双季晚稻,种植密度以（1.10～1.40）万丛/667m²为宜。     

OsWAX2基因的植物表达载体构建及遗传转化

利用拟南芥的WAX2基因序列,BLAST检索出3个水稻同源基因,分别命名为OsWAX2-1,OsWAX2-2,OsWAX2-3,与拟南芥WAX2基因的同源性分别为56.0%,55.2%,52.0%;其预测的编码蛋白与WAX2蛋白的同源性分别为61.5%,60.5%,64.7%.这3个蛋白都存在4个跨膜结构和2个固醇去饱和酶的保守区,说明这3个蛋白质都属于跨膜蛋白,并可能与角质层的蜡质合成有关.从全长cDNA数据库检索获得了3个OsWAX2的全长cDNA.以pCAMBIA-1300-multi为载体,构建了CaMV35S启动子驱动的3个OsWAX2的过表达载体pOEOSW2-1,pOEOSW2-2,pOEOSW2-3及3个RNAi表达载体pCROSW2-1,pCROSW2-2,pCROSW2-3,并通过冻融法将6个表达载体转化到根癌农杆菌EHA105,LBA4404和GV3101中,采用农杆菌介导法进行水稻日本晴品种的遗传转化,得到了具有Hyg抗性的水稻转基因苗,PCR检测到阳性植株.     

2个水稻PLT基因启动子的克隆及其表达分析

为研究水稻中PLT基因的表达及功能,利用同源序列分析,在水稻基因数据库中检索到2个与拟南芥PLT基因高度同源的基因序列,命名为OsPLT7和OsPLT11。根据进一步预测的PLT启动子序列设计引物,以水稻品种中花11的基因组DNA为模板,用PCR方法扩增得到PLT7、PLT11的启动子片段,克隆至含有报告基因的表达载体上并转化水稻。通过GUS染色观察T1代转基因阳性植株,发现OsPLT7和OsPLT11在水稻根部干细胞小生境和中柱部位表达,表达模式类似于其同源基因在拟南芥中的表达谱。     

柑橘大实蝇气味结合蛋白BminOBP6与其气味配体的互作机制

【目的】通过构建柑橘大实蝇(Bactrocera minax)BminOBP6的C末端截短突变体(TOBP6),比较野生型BminOBP6和突变体TOBP6对气味配体的结合能力,检测在不同pH条件下二者对气味配体结合能力的差异,为揭示BminOBP6与配体的互作机制提供参考。【方法】通过在线工具SWISS MODEL对BminOBP6进行同源建模,根据构建的3D模型确定将被切除的BminOBP6第6个α螺旋(α6)之后的C末端序列;设计特异性引物扩增BminOBP6的C末端截短突变体(TOBP6)的编码序列,即TOBP6;构建重组表达载体pET32a/TOBP6,将此重组载体与实验室保存的重组载体pET32a/BminOBP6分别转入原核细胞BL21(DE3)中,异源表达野生型BminOBP6及其突变体TOBP6;以1-NPN为荧光探针进行荧光竞争结合试验,检测BminOBP6和TOBP6在两种pH环境(pH 7.4和pH 5.0)下对1-十一醇和(+)-柠檬烯的结合能力。【结果】序列比对结果显示,BminOBP6与致倦库蚊(Culex quinquefasciatus)CquiOBP...     

腐殖酸对金华佛手生长和品质的影响

研究了不同浓度腐殖酸对盆栽金华佛手生长和品质的影响,结果表明：不同浓度的腐殖酸对佛手的影响效果不同,喷施4次150 mg/L腐殖酸后,佛手叶片面积、叶绿素a和叶绿素（a+b）的含量以及可溶性蛋白、可溶性糖含量都显著高于没有喷施腐殖酸的对照,并且不同程度的高于其他浓度处理;而腐殖酸处理8次后,以浓度为100 mg/L的处理效果较好。佛手在浓度为150 mg/L的腐殖酸处理4次后,生理代谢活跃,生命活动和抗逆能力得到提高,最终形成较高的品质。     

Cloning and Characterization of Putative Hd6 Ortholog Associated with Zea mays L.Photoperiod Sensitivity

The photoperiod response of fowering is critical to the survival and successful reproduction in crops.The Hd6 gene,encoding a protein similar to the Arabidopsis α-subunit of CASEIN KINASE2α(CK2α)has been reported to affect flowering time through the photoperiodic pathway in rice.In this study,the maize ortholog,ZmHd6,has been cloned and its role in the photoperiodic pathway was investigated.ZmHd6 encodes 332 amino acids with six distinct domains: two CK2 active domains,a nuclear localization signal sequence,a N terminal domain,an ATP binding site,and an active site of serine/threonine protein kinase.ZmHd6 was constitutively expressed in the leaves and shoot apical meristem(SAM)with the highest expression in SAMs of plants with seven leaves under long and short day conditions.Delayed flowering time under long day(LD)conditions were observed in ZmHd6 overexpression transgenic Arabidopsis plants compared to the wild type.In transgenic Arabidopsis plants,ZmHd6 was expressed in a circadian oscillatory pattern,TOC1 peak expression was delayed,new G1,CO,and FT expressions reached to peak after 3 h while entering illumination period and oscillatory expression patterns of CO and FT were created during the dark phase.These results suggested that ZmHd6 might negatively regulate flowering time under LD conditions by delaying TOC1 peak expression and disrupting CO and FT expression in transgenic Arabidopsis plants.     

番茄黄化曲叶病病株及传毒介体烟粉虱的空间分布型

对18个越冬大棚番茄定植初期番茄黄化曲叶病病株和其中14个大棚内烟粉虱进行了调查和抽样技术研究,以明确番茄黄化曲叶病病株及传毒介体烟粉虱的空间分布型。研究结果表明,番茄黄化曲叶病病株和烟粉虱在田间的空间分布型一致,均呈聚集分布。Iwao的m*-m模型分别为：m*=－0.209060+1.3659m和m*=－0.299134+1.4171m。同时得出番茄黄化曲叶病的最适理论抽样公式为n=t²/D²(0.79094/m+0.3659);烟粉虱的最适理论抽样数公式为：n=t²/D²(0.79848/m+0.4171)。     

擎天凤梨GAPDH基因的克隆及序列分析

管家基因GAPDH(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase)常被用作定量、半定量PCR试验的内参,以确定目标基因的相对表达量。基于前期从全长cDNA文库中获得GAPDH基因的EST单克隆,进行Primer Walking测序,获得一个GAPDH的全长cDNA序列,序列长1 790 bp,编码421个蛋白氨基酸,命名为GoGAPDH1。采用Blast,ExPASy,ProtParam,SPOMA,Find Conserved Domains(NCBI),ClustalX, MEGA等生物信息学软件对cDNA 序列、氨基酸序列、保守区、亲缘关系等特征进行分析。结果表明,GoGAPDH1与玉米的细胞质GAPDH基因源性最高,为82%。初步推断GoGAPDH1可能是一个胞质型GAPDH。