刚毛柽柳Dof基因的克隆及盐胁迫表达谱

Dof蛋白是植物所特有的一类DNA结合蛋白,参与多个生物学过程.通过对7个柽柳转录组分析,获得14个Dof全长基因序列,这些基因推导蛋白氨基酸残基数为263～507,编码蛋白的相对分子质量为27.52～55.24 kD,理论等电点为5.94 ～9.51.对7个柽柳转录组中Dof基因表达的分析表明,ThDof3、ThDo...     

柽柳ThGSTT1基因的抗旱耐盐表达分析

[目的]研究柽柳ThGSTT1基因的抗旱耐盐表达.[方法]通过对柽柳7个转录组分析,克隆获得一条谷胱甘肽转移酶基因,通过Blast比对及进化分析其结构,并采用qPCR分析基因的抗旱耐盐表达.[结果]该基因为谷胱甘肽Theta家族基因,因此命名为ThGSTT1基因;该基因编码的蛋白氨基酸残基数为231,分子量为26.1 kDa,理论等电点为7.14.表达谱分析显示,ThGSTT1在柽柳根和叶中的表达不同,具有一定的组织表达特异性.qPCR分析结果表明,盐胁迫明显诱导了ThGSTT1基因的表达,叶中胁迫7d表达量为对照的7.48倍,根中胁迫9d时最大.PEG胁迫下ThGSTT1基因的表达明显受抑制,根中胁迫第3天的表达仅为对照的23.7％,而叶中胁迫第5d表达量最低,为对照的12.7％.[结论]谷胱甘肽转移酶是一种重要的抗逆保护酶类,进行抗旱耐盐表达分析具有重要意义.     

柽柳THWRKY12基因的克隆及表达分析

[目的]克隆柽柳THWRKY12基因,并对其进行表达分析。[方法]分别用400 mmol/L NaCl溶液、20%PEG及100μmol/L ABA对柽柳幼苗进行胁迫处理后,用RT-PCR技术研究THWRKY12基因在各组织中的表达情况。[结果]在NaCl和PEG处理下,THWRKY12基因在柽柳幼苗各组织中表达总体呈上调趋势,表明该基因与柽柳的抗盐碱及抗旱过程有关;且ABA处理后THWRKY12基因的表达模式与前两者大致相同,表明该基因可能通过ABA调控的信号通路参与柽柳的抗盐碱及抗旱调控。[结论]该研究为研究WRKY基因在柽柳抗逆性中的作用奠定了基础。     

柽柳甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因的克隆与表达分析

从柽柳(Tamarix hispida)cDNA文库中分离出甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因(ThGAPDH)全长cDNA序列,该基因全长1294bp。其中:5′非翻译区84bp,3′非翻译区184bp,开放阅读框1206bp,编码含341个氨基酸的蛋白质,编码蛋白的相对分子质量为37200,理论等电点(pI)为6.97。采用实时定量RT-PCR方法研究了刚毛柽柳在PEG、NaCl、NaHCO3及CdCl2胁迫下不同时间该基因ThGAPDH的表达模式。结果表明:PEG、NaCl及CdCl2处理均能诱导ThGAPDH基因在根中的表达而抑制其在茎和叶中的表达,而NaHCO3处理均能诱导该基因在根、茎、叶中的表达。基因ThGAPDH的cDNA序列在GenBank中的登录号为GQ478708。     

柽柳金属硫蛋白基因的克隆及分析

应用生物信息学技术从柽柳cDNA文库中分离出了一种金属硫蛋白全长cDNA序列,去除PolyA后该基因全长517bp。其中,5′非翻译区31bp,3′非翻译区267bp,开放读码框(ORF)长219bp,编码72个氨基酸,含13个半胱氨酸Cys,分布在蛋白质的N端和C端,呈CXC形式排列,基因编码蛋白的分子量为7.1kD,等电点为4.71。疏水性分析表明,蛋白的30～50个氨基酸之间有较强的疏水性,经过Pfam15.0(St.Louis(USA))分析证明,为金属硫蛋白家族基因。金属硫蛋白基因参与了植物的发育、胚胎发生、抵抗逆境胁迫等多种生理过程,是一种重要的功能基因。此基因的Genbank登录号为AY620987(基因),AAT39518(蛋白)。     

辣椒ASR基因的克隆与表达分析

【目的】克隆辣椒ASR（ABA-stress-ripening）基因进行生物信息学分析并探究其在不同组织和非生物胁迫处理下的表达模式,为深入研究ASR基因家族在辣椒果实发育和逆境胁迫中的作用机制提供参考。【方法】以遵辣1号辣椒为材料克隆其ASR基因,对该基因家族成员进行生物信息学分析和系统进化分析,运用实时荧光定量PCR检测其在不同组织及在ABA、高温、高盐和干旱胁迫处理下的表达模式。【结果】克隆的2个辣椒ASR基因分别命名为CaASR2和CaASR3,基因全长分别为987和938 bp,最长开放阅读框（ORF）分别为333和339 bp,分别编码110和112个氨基酸,蛋白分子量分别为12.45和12.73 kD,理论等电点（pI）分别为7.47和6.50,均为亲水性蛋白。结合前人克隆的辣椒CaASR1基因分析,结果显示,CaASRs预测位于细胞核,均含有ABA/WDS特征结构域;基因结构分析结果显示,辣椒ASR基因均含有2个外显子和1个内含子,启动子区域均包含ABA响应元件ABRE。CaASR1、CaASR2和CaASR3氨基酸序列分别与番茄（Solanum lycopersicum）基因组中的ASR蛋白氨基酸序列NP_001269248.1（80.20%）、NP_001307920.1（91.30%）和NP_001234137.1（96.43%）有非常高的相似性,表明其进化的相对保守性。3个ASR基因在辣椒花中表达量最低,在根、茎、叶和种子中表达量中等,但均随着果实的发育表达量逐渐升高,特别是在转色和成熟果实中。ABA、高温、高盐和干旱胁迫处理下,基因的表达量均显著升高（P<0.05）,其中以CaASR3响应最快,且上调表达量高于其他同源基因。【结论】辣椒基因组中3个ASR基因具有ASR基因家族的典型特征,并在辣椒不同组织和非生物胁迫响应中发挥重要作用。     

香樟CcCBFs基因的克隆及表达模式

CBF转录因子又称为DREB1,在增强植物抵御非生物胁迫(低温、干旱和盐胁迫)方面具有重要的作用。利用同源克隆的方法结合RACE PCR技术,从香樟中获得2个CBF类似基因的c DNA全长序列,命名为Cc CBFa和Cc CBFb,其c DNA序列全长分别为909和941 bp,分别包含一个714和729 bp的开放阅读框,编码237和242个氨基酸;g NDA序列分析结果显示,Cc CBFa和Cc CBFb基因均不含有内含子。一系列生物信息学分析表明,Cc CBFa和Cc CBFb基因属于DREB家族的CBF/DREB1亚家族,将所获得香樟CBF基因c DNA全长序列提交到NCBI(登录号:KJ958932和KJ958933)。此外,实时定量PCR结果表明,Cc CBFa和Cc CBFb基因在香樟不同器官中的表达量存在一定差异,并且均能被低温、干旱、盐以及ABA强烈诱导。这些结果表明,Cc CBFa和Cc CBFb可能在香樟应对低温、干旱和盐等非生物胁迫时发挥重要作用,并且可能与ABA信号通路有关。     

刚毛柽柳水通道蛋白ThPIP基因启动子的克隆及其活性分析

[目的]研究刚毛柽柳水通道蛋白ThPIP基因启动子的克隆及其活性分析.[方法]采用染色体步移技术,克隆到刚毛柽柳ThPIP基因起始密码子上游1241bp启动子序列,并通过PLACE和HantCARE预测启动子序列中所包含的主要顺式作用元件.将该启动子替换pCAMBIA1301上的35S启动子,构建融合表达基因proThPlP∷GUS,通过基因枪瞬时转化烟草,并进行GUS组织化学染色.[结果]该启动子具有活性,能够驱动GUS基因的表达.[结论]为进一步鉴定该启动子中的顺式作用元件及相互作用的调控因子奠定基础,从而为揭示刚毛柽柳ThPIP基因的分子调控机制提供依据.     

柽柳cDNA文库的构建及ThAQP基因的表达

【目的】构建NaCl胁迫下柽柳根部cDNA文库,在盐胁迫下检测柽柳水通道蛋白(Aquaporins,AQPs)基因的表达,探讨AQPs与柽柳耐盐性的关系。【方法】以0.4mol/LNaCl胁迫处理的刚毛柽柳(Tamarix hispida)根部组织为试材,分别构建未经盐胁迫及胁迫24,48h的cDNA文库,并测定文库滴度。对从文库中获得的EST序列进行拼接,获得刚毛柽柳AQP(ThAQP)的单一序列,对其进行生物信息学分析。采用实时荧光定量PCR方法,研究ThAQP基因在盐胁迫后的刚毛柽柳根和叶中的表达情况。【结果】构建的NaCl胁迫0,24,48h3个文库的初始滴度分别为1.0×106,1.4×106和1.2×106pfu/mL,插入片段的平均长度分别为0.8,0.9和0.85kb,平均重组率为98.2%。文库克隆随机测序获得了刚毛柽柳的7条ThAQP基因单一序列,这7条ThAQP基因分别与水通道蛋白的4个亚家族成员基因具有很高的同源性。在根和叶中,这7条ThAQP基因表达对盐胁迫的响应不同,在根部ThAQP1～ThAQP4相对表达量增多,而其他基因的相对表达量变化不明显;在叶部,ThAQP7在胁迫24h时相对表达量出现小幅度上升,而其他6条ThAQP的相对表达量则明显下降。【结论】ThAQP基因可能与柽柳抵御盐胁迫有关。     

水稻CCCH型锌指蛋白亚家族Ⅰ基因的表达分析

CCCH型锌指蛋白是一类生物体中广泛存在的转录因子,与植物的抗逆性密切相关。水稻CCCH锌指蛋白家族包括67个成员,分为8个亚家族。本研究采用实时定量PCR技术分析水稻CCCH亚家族Ⅰ基因的组织表达模式以及盐、干旱、低温、高温等多种非生物胁迫和脱落酸(ABA)对CCCH基因表达水平的调节。结果表明,多数CCCH基因都不同程度地受到这些非生物胁迫及ABA的诱导或抑制,其中C3H10、C3H24、C3H33、C3H37和C3H67的表达量在不同胁迫处理后表现出不同程度的升高,C3H35、C3H50和C3H52在盐、干旱、ABA、低温和高温处理后表达水平呈下降趋势,表明这些CCCH锌指蛋白可能参与水稻的非生物胁迫响应。     

柽柳类锌指基因ThZFL的功能分析

为了研究柽柳ThZFL基因的功能,将ThZFL基因过表达转入烟草后,对转基因烟草进行盐胁迫、干旱胁迫,并利用酵母双杂交及染色体步移技术,获得柽柳ThZFL基因的互作蛋白与启动子。结果表明:柽柳ThZ-FL基因能显著提高转基因烟草盐胁迫下种子的发芽率、离体叶片的分化和植株的生长能力;通过酵母双杂交筛选出两个与ThZFL蛋白互作的蛋白;ThZFL基因启动子驱动GUS活性显示,在幼苗的整体、叶脉和毛状体中表达显著,但在幼叶和茎尖处表达微弱。     

柽柳类锌指基因ThZFL酵母诱饵表达载体的构建及其表达验证

利用PCR技术从柽柳cDNA文库中克隆出ThZFL目的基因序列,连接到pMD18-T载体,转化大肠杆菌DH5α感受态,经检验后提取质粒,用BamH I和EcoR I限制性内切酶双酶切pMD18-T-ThZFL载体和pG-BKT7-BD空载体,并将酶切产物胶回收后,用T4 DNA连接酶连接过夜后转化大肠杆菌DH5α感受态...     

柽柳硫氧还蛋白过氧化物酶(ThPrx1)基因转入酵母的抗逆能力分析

从柽柳(Tamarix hispida)中克隆到了一个硫氧还蛋白过氧化物酶(Peroxiredoxin,Prx)家族基因(ThPrx1).为了研究ThPrxl的抗逆功能,将ThPrx1基因构建到酵母表达载体pYES2中,转化到酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中,获得重组酵母,并用转空pYES...     

柽柳转录因子基因ThbZIP1的原核表达及重组蛋白纯化

柽柳是重要的抗逆植物,提取柽柳总RNA,克隆了柽柳的16.5 k D b ZIP转录因子基因Thb ZIP1,构建原核表达载体p GEX-Thb ZIP1,导入宿主菌获得重组菌株BL21-Thb ZIP1,用异丙基-β-D-硫代半乳糖(IPTG)进行重组蛋白r Thb ZIP1诱导表达。试验结果表明:IPTG浓度为1.0 mmol/L,诱导温度为37℃条件下,诱导4 h,大肠杆菌提取液提取50 min时,所获得重组蛋白r Thb ZIP1表达量最大,占总蛋白的76.42%;经过10%SDS-PAGE电泳检测,发现重组蛋白r Thb ZIP1主要以包涵体的形式存在;并利用电纯化法成功获得纯化的目的蛋白。     

柽柳液泡膜微囊蛋白的分离

采用差速离心和不连续蔗糖密度梯度离心法分离和纯化柽柳液泡膜微囊,通过western杂交对获得的微囊蛋白进行检测,获得ThVHAc1蛋白目的条带,表明分离的液泡膜微囊中含有有效的V-ATPase成分,进一步测定液泡膜微囊对NaNO3、Na3VO3、NaN3的敏感性及V-ATPase的水解活性和翻转比例。结果表明：液泡膜微囊主要分布在0~25%蔗糖梯度界面上,且研磨法提取液泡膜微囊具有较高的水解活性和较大的原位比例,表明液氮研磨结合差速离心及不连续蔗糖密度梯度离心法能有效提取柽柳液泡膜微囊。