3个品种鸡α干扰素基因的克隆与序列分析*

 根据GenBank中鸡α干扰素（IFN-α）基因序列设计1对引物,应用PCR技术直接从鸡肝组织基因组中扩增罗曼鸡、海兰鸡及固始鸡α干扰素基因,并进行克隆和测序。结果表明,获得了3个品种鸡IFN-α全基因序列,长度均为582bp,编码193个氨基酸残基。3个品种鸡IFN-α基因及推导的氨基酸序列比较结果显示,海兰鸡和罗曼鸡IFN-α基因序列完全一致,而固始鸡与海兰鸡和罗曼鸡IFN-α基因核苷酸同源性99.3%,有4个碱基发生非同义变异,氨基酸同源性为97.9％。克隆的3个品种鸡IFN-α基因序列与GenBank上发表的7条鸡IFN-α基因序列进行比较分析发现,核苷酸同源性在98.1%～100%之间,氨基酸同源性在96.9%～100%之间。     

Cytotoxic effects of leukocyres triggered by complement bound to target cells

Chromium-51-labeled chicken erythrocytes (E), treated with rabbit anti-Forssman antibody (A) and the first four (C1-4) or the first seven (C1-7) components of human complement (C), released isotope upon exposure to human leukocytes. Isotope release from EACJ-7 cells proceeded more rapidly and was more extensive than that from EACI-3 cells. Lysis of these cells was suppressed by pretreatment of leukocytes with antimycinA. Monocyte-enriched leukocyte preparations affected both types of target cell-complement intermediates, whereas purified lymphocytes lysed EACI-7 cells but not EACI-3 cells.     

小西葫芦黄花叶病毒dsRNA的原核表达及其对ZYMV的防治效果

【目的】小西葫芦黄花叶病毒（Zucchini yellow mosaic virus,ZYMV）是危害西瓜最为普遍的病毒,在西瓜上利用外源喷施病毒基因dsRNA的方法实现对ZYMV的预防和治疗。【方法】首先以实验室已有的ZYMV病毒序列为依据,针对其不同的基因片段,利用NCBI数据库找出与其相似的序列。随后利用软件DNAMAN8对序列进行多重比对分析,找出其保守区域,根据分析结果选择长度介于200—350 bp的ZYMV 3′UTR、6K2、HC-Pro、P3、NIb 5个基因片段,同时选择长度为190 bp的GUS基因片段作为对照。PCR扩增得到这6个片段后,利用同源重组的方法将它们插入到含有双T7启动子的L4440载体中,并利用RNAⅢ酶缺陷型大肠杆菌HT115建立原核表达系统生产dsRNA,采用超声波破碎的方法释放dsRNA,利用TE（10 mmol·L ^-1 Tris-HCl和1 mmol·L ^-1 EDTA）缓冲液溶解dsRNA,最后比较和分析IPTG使用浓度、诱导时间以及超声波破碎时间对dsRNA表达和释放的影响。在西瓜植株上采用喷施的方法施用dsRNA,设计先喷施dsRNA后接种病毒的预防试验和先接种病毒后喷施dsRNA的治疗试验,通过统计分析接种病毒后21 d发病率的方法评价dsRNA预防和治疗ZYMV的效果。【结果】针对ZYMV的3′UTR、6K2、HC-Pro、P3、NIb 5个基因片段以及GUS基因片段建立了能够高效稳定表达和释放dsRNA的生产体系。在IPTG诱导浓度为8 mmol·L ^-1,诱导时间为7 h,在宁波新芝牌超声波细胞破碎仪3ø的档位和60%的输出功率条件下破碎15 min,细胞可以有效产生和释放dsRNA。在对ZYMV的预防试验中发现,喷施GUS基因片段的dsRNA以及TE缓冲液的西瓜植株发病率均为100%的情况下,对ZYMV防治效果最好的是HC-Pro基因片段,接种ZYMV 21 d后防治效果可达到95%,防治效果相对较差的是NIb基因片段,但也可达到80%。在此基础上对HC-Pro片段预防和治疗ZYMV的效果进行了深入分析,结果发现在喷施HC-Pro片段的dsRNA后第3、5、7天接种ZYMV,植株发病率分别为16%、63%、63%,在接种ZYMV后第1、3、5、7天分别喷施HC-Pro片段的dsRNA,无明显的治疗效果,仅起到延迟植株发病的效果。【结论】建立了针对ZYMV不同基因片段的dsRNA原核表达体系,并发现基于HC-Pro基因片段产生的dsRNA对ZYMV防治效果最好,可显著降低植株的发病率、延迟植株发病时间,具有应用潜力。     

传染性法氏囊病病毒dsRNA核酸提取

用免疫沉淀法从感染鸡法氏囊组织中分离传染性法氏囊病病毒（ＩＢＤＶ），用差速离心法从感染的鸡胚成纤维细胞（ＣＥＦ）中分离ＩＢＤＶ，再从分离的ＩＢＤＶ中抽提ｄｓＲＮＡ。在ｄｓＲＮＡ提取物受ＤＮＡ降解产物影响时，可用ＤＮａｓｅⅠ消化去除，核酸再经琼脂糖凝胶电泳纯化。     

雏鸡感染网状内皮组织增殖病病毒后免疫病理的研究

 研究了 1日龄 SPF雏鸡感染网状内皮组织增殖病病毒 ( REV)后 ,胸腺和脾脏 T细胞增殖反应及 T细胞数量、法氏囊和脾脏 B细胞增殖反应和抗体生成细胞数量、胸腺和脾脏 IL- 2及 IFN诱生活性的动态变化。结果发现 ,雏鸡感染 REV后 ,胸腺和脾脏 T细胞增殖反应及数量、法氏囊和脾脏 B细胞增殖反应和 Ig G+、Ig M+、Ig A+抗体生成细胞数量均明显低于未感染对照雏鸡 ;胸腺和脾脏 IL- 2及脾脏 IFN诱生活性显著下降 ,表明感染 REV后雏鸡中枢和外周免疫器官细胞免疫和体液免疫降低及细胞因子 IL- 2及 IFN免疫调节减弱。     

鸡γ-干扰素基因在大肠杆菌中的表达

构建鸡γ-干扰素基因(lFN-γ)的融合表达质粒,并在原核系统表达。根据GenBank发表的鸡γ-干扰素核苷酸序列,使用prim er5设计一对特异性引物,通过RT-PCR技术从ConA诱导培养的鸡脾脏淋巴细胞中克隆出鸡γ-干扰素基因并对其进行测序。测序结果表明,鸡γ-干扰素基因全长495bp,具有一个完整的开放阅读框,编码164个氨基酸,与国外发表的序列同源性为100%。将序列连接到原核表达载体pET28 a(+)上,转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导后进行SDS-PAGE电泳分析。结果表明鸡γ-干扰素表达蛋白大小为20.8KD,并以包涵体形式表达。为鸡γ-干扰素生物制剂或疫苗佐剂的开发奠定基础。     

广西鸡源H9N2亚型禽流感病毒分离鉴定及遗传进化分析

[目的]明确广西鸡源H9N2亚型禽流感病毒(AIV)的分子遗传变异规律及其对公共卫生安全的影响,为H9亚型禽流感(AI)的防控提供参考依据.[方法]从广西某肉鸡养殖场采集病料,经SPF鸡胚接种进行病毒分离,对初步鉴定为H9亚型AIV分离株的HA、NA、PB2、PB1、PA、NP、M和NS等8个基因片段进行克隆测定及遗传进化分析,同时对分离毒株的生物学特性进行测定.[结果]从广西发病鸡群中分离获得一株H9N2亚型AIV,命名为A/chicken/Guangxi/BT1/2016(H9N2).分离毒株A/chicken/Guangxi/BT1/2016(H9N2)HA基因的裂解位点为PSRSSR↓GLF,具有典型的低致病性AIV(LPAIV)分子特征,在遗传进化关系上属于4.2.5分支,与国内常用H9N2亚型AIV疫苗株所属的4.2.3分支存在一定差异;其他7个基因也分别来源于不同的AIV亚型.分离毒株A/chicken/Guangxi/BT1/2016 (H9N2)同时具备与α-2,3唾液酸和α-2,6唾液酸受体结合的特性,且具有感染人类的潜在风险;其感染鸡群后病毒分布主要集中在气管、肺脏和脾脏,可通过呼吸道和消化道同时排毒,且在攻毒后第1d即开始排毒,第5d为排毒高峰.[结论]从广西发病鸡群中分离获得的A/chicken/Guangxi/BT1/2016(H9N2)属于LPAIV,是由不同亚型AIV重组产生的H9N2亚型新毒株,可导致鸡群疫苗免疫失败,且具有感染人类的潜在风险.     

Type I strain of Toxoplasma gondii from chicken induced different immune responses with that from human,cat and swine in chicken

In this study,four strains of Toxoplasma gondii with the same genetic type(Type I) originated from chicken,human,cat and swine were used to compare the immune responses in resistant chicken host to investigate the relationships between the parasite origins and the pathogenicity in certain host.A total of 300,10-day-old chickens were allocated randomly into five groups which named JS(from chicken),CAT(from cat),CN(from swine),RH(from human) and a negative control group(—Ve) with 60 birds in each group.Tachyzoites of four different T.gondii strains(JS,CAT,CN and RH) were inoculated intraperitoneally with the dose of 1×10~7 in the four designed groups,respectively.The negative control(-Ve) group was mockly inoculated with phosphate-buffered saline(PBS) alone.Blood and spleen samples were obtained on the day of inoculation(day 0) and at days 4,11,25,39 and 53 post-infection to screen the immunopathological changes.The results demonstrated some different immune characters of T.gondii infected chickens with that of mice or swine previous reported.These differences included up-regulation of major histocompatibility complex class Ⅱ(MHC Ⅱ) molecules in the early stage of infection,early peak expressions of interleukin(IL)-12(IL-12) and-10(IL-10) and long keep of IL-17.These might partially contribute to the resistance of chicken to T.gondii infection.Comparisons to chickens infected with strains from human,cat and swine,chickens infected with strain from chicken showed significant high levels of CD4~+ and CD8~+ T cells,interferon gamma(IFN-γ),IL-12 and IL-10.It suggested that the strain from chicken had different ability to stimulate cellular immunity in chicken.     

鸡外周血淋巴细胞培养及转移因子的提取

转移因子(TransferFactor,简称TF)是白细胞中具有免疫活性的T淋巴细胞所释放的一类小分子可透析物质。在传统转移因子制备方法的基础上,采用鸡外周血淋巴细胞培养法研制转移因子,并对制备转移因子中的核糖含量进行测定。结果表明:连续传代4次的淋巴细胞可以提取转移因子,转移因子的浓度较高。     

植物病毒源dsRNA原核表达条件的研究

利用PVYN-CP和PLRV-CP基因构建了dsRNA原核表达载体L4440RYl,转至大肠杆菌HT115(DE3),获得菌株HTRYl。绘制了菌株HTRYl的生长曲线,研究了IPTG浓度和诱导时间对该菌株dsRNA表达量的影响。结果表明,接种3.5h,菌体浓度OD600为0.6,加入终浓度为0.3～0.4mmol/L的IPTG,诱导4～5h时,dsRNA表达量最高。dsRNA表达条件的研究,为dsRNA的应用研究奠定了基础。     

应用dsRNA测序技术检测草鱼呼肠孤病毒的混合感染

从草鱼(Ctenopharyngodon idellus)出血病疑似病料提取物感染的草鱼肾细胞(CIK)中提取病毒基因组dsRNA,电泳显示出水生呼肠孤病毒基因组的典型特征。应用简化的FLAC(full-length amplification of cDNA)技术扩增得到病毒的4个全长基因组片段进行测序分析。核酸序列BLAST分析表明:其中3个基因组片段与GCRV-873第5、9、10片段高度同源,另外1个基因组片段与GCRV-HZ08第11片段高度同源;因此推测病料中同时存在两种不同的病毒核酸,但也可能存在一种杂合病毒。根据已发表的GCRV-HZ08第5、9、10片段设计了3对引物对分离的病毒总RNA进行RT-PCR检测并测序,结果显示这3个片段与GCRV-HZ08第5、9、10片段均具有99%同源性,表明是由于混合感染而存在两株不同病毒的核酸dsRNA,两株病毒分别命名为GCRV-JX01和GCRV-JX02。首次运用dsRNA测序法检测出了GCRV病毒的混合感染,为草鱼呼肠孤病毒的流行病学和防控提供了一种新的技术选择。     

双链RNA分析技术在鉴定RNA病毒中的应用

ｄｓＲＮＡ技术是以无ＲＮＡ病毒或类似病毒因子侵染的植物组织中不含有容易鉴定的同原大分子的ｄｓＲＮＡ（＞０．１×１０６）存在为前提。在植物体内ｄｓＲＮＡ是ＲＮＡ病毒和类病毒因子存在的迹象，ｄｓＲＮＡ包括ｄｓＲＮＡ病毒的基因或ｓｓＲＮＡ病的复制中间型。ｄｓＲＮＡ在寄主组织相当稳定，可以用物理和化学的方法分离出来。叙述了ｄｓＲＮＡ技术用于植物病毒群、成员、同一病毒的不同株系、感染作物的新病毒及其复合侵染、类病毒、卫星病毒等的鉴定。证明该方法使用广泛、快速准确，不需要贵重设备，在一般实验室中即可进行。该方法有重要应用和学术价值，已引起植物病毒和植物病理学工作者广泛兴趣。     

Interferon: lack of detectable uptake by cells

No interferon, or at most a small fraction of that applied, is taken up by cells during the period of induction of antiviral activity. The lack of detectable adsorption was not influenced either by the concentration of interferon or the volume. The results were similar in both chicken and mouse systems.     

藏鸡和隐性白羽鸡GH基因的SNP检测及其与生长性状间的关联分析

 利用改良等位基因特异性PCR（Modified Allele Specific PCR, M-ASP）结合PCR-RFLP以及直接测序方法对藏鸡和隐性白羽鸡生长激素（Growth Hormone, GH）基因内含子4 （Intron4）的一个位点进行了SNP检测，并进行了该基因与藏鸡生长性状的关联分析。检测结果显示，GH基因Intron4的这个位点同时具有M-ASP和SacI-RFLP多态。测序结果表明，该位点发生了C→G的碱基突变，产生了CC、CG和GG三种基因型。两个等位基因和三种基因型在两鸡种中的分布基本一致。其中，基因型CC和等位基因C的频率最高。χ2检验结果表明，基因型频率或者等位基因频率在两鸡种之间没有显著差异（P＞0.05），而分别在两鸡种内部却存在显著（P＜0.05）或极显著（P＜0.01）差异。方差分析结果表明，基因型与藏鸡的2周龄体重等12个生长性状有显著（P＜0.05）或极显著（P＜0.01）关联；基因型CC与藏鸡的7周龄体重存在显著关联（P＜0.05）。这暗示了GH基因是影响藏鸡生长的主效基因或者它与主效基因相关，而该位点的碱基突变可以作为筛选藏鸡高的7周龄体重的分子标记。     

草莓植株中病毒dsRNA的分离和鉴定

 【目的】病毒核酸分离是病毒基因组解析的基础，本研究旨在建立草莓病毒的dsRNA分离方法，获得草莓主要病毒的部分基因组序列。【方法】采用改进的dsRNA分离方法，对草莓病毒指示植物和栽培品种中的病毒dsRNA进行分离，通过琼脂糖凝胶电泳和RT-PCR来鉴定。【结果】不同草莓品种中病毒dsRNA的含量不同，试管苗叶片中dsRNA含量高于露地苗幼叶，而露地苗幼叶中dsRNA含量明显高于完全成熟叶。dsRNA对DNase Ⅰ具有很强的耐性；当酶解缓冲液中含0.5 mol·L-1 NaCl时，dsRNA对RNase A具有较强的耐性。利用DNA凝胶回收试剂盒，能够有效回收凝胶中的dsRNA片段。应用RT-PCR技术，从凝胶回收的dsRNA及DNase Ⅰ/RNase A两酶酶解处理后的dsRNA中分别扩增出草莓斑驳病毒和草莓轻型黄边病毒的特异片段。【结论】建立了从草莓植株中分离和鉴定病毒dsRNA的完整技术体系，为草莓病毒中国分离物的基因组解析奠定了重要基础。     

生长早期泰和鸡与AA鸡血清生长激素水平及生长激素结合蛋白活性的比较

比较泰和鸡和ＡＡ（Ａｒｂｏｒ Ａｃｒｅｓ）肉鸡血清生长激素（ＧＨ）含量和生长激素结合蛋白（ＧＨＢＰ）的结合活性,发现两品种鸡出雏时血清ＧＨ水平均较低,５日龄时ＧＨ均有显著上升（Ｐ＜０．０１）。此后泰和鸡保持上升趋势,在３５日龄ＧＨ达到最高值;而ＡＡ鸡在５日龄后血清ＧＨ水平上升幅度较小,日龄间差异不显著。１日龄和３５日龄时,泰和鸡血清ＧＨ水平显著高于同日龄的ＡＡ肉鸡,与两者体重的差异刚好相反。血液Ｇ     

Transport of dsRNA into cells by the transmembrane protein SID-1

RNA interference (RNAi) spreads systemically in plants and nematodes to silence gene expression distant from the site of initiation. We previously identified a gene, sid-1, essential for systemic but not cell-autonomous RNAi in Caenorhabditis elegans. Here, we demonstrate that SID-1 is a multispan transmembrane protein that sensitizes Drosophila cells to soaking RNAi with a potency that is dependent on double-stranded RNA (dsRNA) length. Further analyses revealed that SID-1 enables passive cellular uptake of dsRNA. These data indicate that systemic RNAi in C. elegans involves SID-1-mediated intercellular transport of dsRNA.     

干扰素脂质体凝胶剂体外透皮扩散的效果观察

目的比较干扰素脂质体凝胶与干扰素凝胶在离体皮肤渗透的效果。方法干扰素脂质体凝胶剂与干扰素凝胶剂分别涂抹于对称的离体大鼠背部皮肤(有效扩散面积为8.04cm2),并置于改良Franz扩散池上,透皮扩散24h后检测皮肤层、凝胶层中的药物含量和接受液中的累计透过量。结果干扰素脂质体凝胶组皮肤层中干扰素的含量高于干扰素凝胶组,差异有统计学意义(P<0.01)。脂质体凝胶中的干扰素在皮肤层的含量约占总量的39.5%,凝胶中的干扰素在皮肤层的含量约占总量的18.4%。结论脂质体有促进干扰素渗入皮肤的作用,干扰素脂质体凝胶剂有可能成为干扰素的一种外用剂型。