副猪嗜血杆菌抗体间接ELISA检测方法的建立与应用

本试验采用121 ℃高压处理副猪嗜血杆菌4型和5型耐热蛋白,混合作为包被抗原,建立了检测副猪嗜血杆菌抗体的间接ELISA方法。通过对试验条件进行筛选优化,确定了最佳反应条件:抗原包被浓度为10 μg/mL,37 ℃包被2 h;封闭液选择含20 g/L脱脂奶粉的PBST,封闭30 min;血清的稀释度为1∶80;抗原抗体反应时间为45 min;酶标二抗稀释度为1∶12000,作用时间为30 min;底物显色时间为15 min。特异性、重复性和敏感性试验及对200份送检血清的检测结果表明,建立的间接ELISA方法特异性和重复性良好,敏感性比间接血凝试验高,对已知阴阳性血清的临床样本检测结果与国外ELISA试剂盒一致,可用于副猪嗜血杆菌的血清抗体检测和血清流行病学调查。     

副猪嗜血杆菌血清5型间接血凝试验和间接ELISA抗体检测方法的建立

为建立副猪嗜血杆菌（HPS）的血清学诊断方法，通过探索HPS荚膜多糖产生的最适体外培养条件，提取了HPS血清5型菌株的荚膜多糖（CPS），并以之为抗原分别建立了间接血凝试验（IHA）和间接ELISA两种抗体检测方法，对其特异性、敏感性和符合率进行了比较研究。结果表明，两种检测方法的特异性良好，但ELISA的敏感性是IHA的5～10倍，二者的阳性符合率、阴性符合率和总符合率分别为79．7％、55．2％和65．3％。用这两种方法检测了320份临床送检猪血清，IHA和ELISA的阳性率分别为40％和59％。结果证实，这两种方法适用于不同实验室条件下HPS的诊断和流行病学调查。     

副猪嗜血杆菌抗体间接血凝检测方法的建立及应用

将副猪嗜血杆菌（Haemophilus parasuis，HPS）血清型4、5型分离菌株经超声波破碎处理后的产物致敏醛化红细胞，建立了检测HPS抗体的间接血凝试验方法。最适反应条件为绵羊红细胞30℃醛化5h，4、5型菌株浓缩抗原以1：8稀释致敏红细胞。免疫猪2周后检出率达89％。对15种HPS血清型阳性血清进行检测，结果均为阳性；对猪瘟病毒、口蹄疫病毒、猪圆环病毒、猪细小病毒、猪伪狂犬病病毒、猪生殖与呼吸综合征病毒、猪肺炎支原体、猪链球菌、猪肺疫巴氏杆菌、Ⅰ相支气管败血波氏杆菌及胸膜肺炎放线杆菌阳性血清进行检测，结果均为阴性。敏感性为琼脂扩散试验的16倍。对1665份猪血清进行检测，阳性率为47．1％。结果表明，该方法敏感性较高，特异性强，重复性好，可用于疫苗免疫后抗体水平的检测及副猪嗜血杆菌的流行病学调查。     

间接血凝方法检测副猪嗜血杆菌抗体

将副猪嗜血杆菌(Hps)4、5、13型分离菌株超声产物致敏经戊二醛和鞣酸处理的绵羊红细胞,建立了检测Hps抗体的间接血凝试验方法。对15种血清型Hps阳性血清进行检测,结果均为阳性,抗体效价达1∶2⁵~1∶2¹⁰,敏感性明显高于琼脂扩散试验。对其它16种病毒和细菌的阳性血清进行检测,结果除胸膜肺炎放线杆菌有凝集外,其余均为阴性。对620份临床血清进行检测,阳性率为67.58%。结果表明,该方法敏感性较高、特异性强,可用于Hps抗体水平的检测和流行病学调查。     

副猪嗜血杆菌AfuA-ELISA抗体检测方法的建立与应用

为建立一种特异性强、灵敏度高的副猪嗜血杆菌（Haemophilus parasuis,HPS）ELISA抗体检测方法,为副猪嗜血杆菌病的诊断及免疫抗体检测提供技术支撑,首先重组表达了HPS 2个具有免疫原性的蛋白（HbpA、AfuA）,随后对HbpA、AfuA进行初筛,选择AfuA作为最佳包被蛋白。通过优化AfuA-ELISA反应条件,确定了最佳抗原包被质量浓度为5μg/mL,最佳封闭液为5%脱脂乳溶液,最佳样品稀释液为2%BSA溶液,最佳样品孵育时间为30 min,最佳样品稀释度为1:25,最佳酶标二抗稀释度为1:20 000,最佳酶标二抗孵育时间为30 min,最佳底物孵育时间为10 min。特异性试验显示,建立的AfuA-ELISA方法对猪其他常见病原阳性血清的检测结果均为阴性,表明其具有良较好的特异性。对300份临床样品进行检测,AfuA-ELISA方法分别检出阳性、阴性血清177、123份,与商业化试剂盒的阳性、阴性符合率分别为90.0%、87.5%,总体符合率为89.0%。结果表明,本研究建立的AfuA-ELISA方法具有特异性强、灵敏度高,与商业化试剂盒符合率高的优点,可...     

副猪嗜血杆菌抗体间接血凝试验

副猪嗜血杆菌病的诊断是当前研究的热点和难点之一。本试验的目的是为建立间接血凝试验诊断HPS的方法，为检测该病提供依据。结果表明，间接血凝法在检测HPS抗体方面有较高的特异性和敏感性，具有操作简单、耗时少，直接测出抗体效价的高低，不需要复杂的仪器设备和熟练的技术人员等优点，具有良好的推广和应用价值。     

副猪嗜血杆菌ompP2基因的克隆、表达及间接ELISA抗体检测方法的建立

用PCR方法扩增副猪嗜血杆菌的外膜蛋白ompP2基因,序列测定结果表明扩增片段全长1 188bp。将扩增片段插入表达载体pET-32a,转化BL21进行诱导表达,SDS-PAGE电泳结果证实重组融合蛋白约为60 000,West-ern-blot结果表明重组表达蛋白具有免疫反应性。以纯化的重组蛋白ompP2作为抗原,建立副猪嗜血杆菌的抗体间接ELISA检测方法。通过试验确定最佳反应条件为抗原包被质量浓度4.75mg/L,4℃包被过夜,待检血清的稀释浓度为1∶40,阳性判断标准为D630大于0.383。特异性和重复性试验表明,建立的间接ELISA方法具有良好的特异性和敏感性,可用于副猪嗜血杆菌的检测。     

副猪嗜血杆菌抗体间接血凝试验

副猪嗜血杆菌病的诊断是当前研究的热点和难点之一.本试验的目的是为建立间接血凝试验诊断HPS的方法,为检测该病提供依据.结果表明,间接血凝法在检测HPS抗体方面有较高的特异性和敏感性,具有操作简单、耗时少,直接测出抗体效价的高低,不需要复杂的仪器设备和熟练的技术人员等优点,具有良好的推广和应用价值.     

副猪嗜血杆菌OMP P5间接ELISA抗体检测方法优化

利用副猪嗜血杆菌(HPS)OMP P5基因表达并纯化复性后蛋白作为包被蛋白,通过对最佳加样作用时间的确定和最佳酶标二抗反应时间等条件的探索优化,建立针对副猪嗜血杆菌外膜蛋白P5(OMPP5)的间接ELISA抗体检测方法,通过对进行和未进行HPS免疫的健康猪血清的检测,证实了建立的间接ELISA方法具有敏感性高、特异性强、反应快速准确等特点,可用于HPS的快速诊断     

副猪嗜血杆菌OMP5单克隆抗体的制备与鉴定

用副猪嗜血杆菌（HPS）血清5型灭活菌液免疫BALB/c小鼠,取其脾细胞与Sp2/0骨髓瘤细胞融合,以HPS外膜蛋白5（OMP5）为抗原,经间接ELISA法筛选阳性融合孔,并用有限稀释法对筛选的阳性孔进行亚克隆,获得2株分泌抗HPS OMP5单克隆抗体的杂交瘤细胞株1E2和8D9;间接ELISA法效价检测,1E2和8D9细胞培养上清抗体效价均为1∶2 560,纯化后腹水抗体效价分别为1∶204 800和1∶51 200;抗体型别鉴定,1E2和8D9分别分泌IgG2b、IgG2a型抗体;特异性检测表明,2株单抗均能特异识别OMP5。将2株杂交瘤细胞反复冻融3次复苏后仍能稳定分泌抗体。2株抗HPS OMP5单克隆抗体的成功制备,将为HPS感染快速检测方法的建立以及检测试剂的研制奠定基础。     

Development and Preliminary Application of Apd-ELISA Kit for Antibody Detection of Haemophilus parasuis

The present study aimed to develop an ELISA for detecting antibodies of Haemophilus parasuis by optimization of reaction conditions, determination of its cutoff value and evaluation of its application with autotransporter passenger domain (Apd) as the coating antigen. Firstly, the porcine sera from immunization and challenge experiments were used as HPS-positive and -negative control sera to optimize the Apd-ELISA reaction parameters and conditions. Next, the cutoff value was determined based on testing of the serum samples with confirmed background, and then the blocking solutions and the packing methods of plates were selected. Finally, Apd-ELISA was used to detect clinical serum samples and then compared with the Biocheck OppA-ELISA kit from Netherland. With the coating antigen at 0.5 μg·mL^-1, the tested sera being diluted at 1:200 and incubation for 45 min and HRP-labeled goat anti-pig second antibody being diluted at 1:15 000, Apd-ELISA displayed the improved discriminative capability and the reduced background signal. The cutoff value was determined to be 0.33 by calculation formula (S-N)/(P-N) and the OD_{630 nm} value of the 27 positive porcine sera and 40 negative porcine sera with the confirmed background. The blocking solution K and the vaccum package can preserve ELISA plates for 4 days at 50 ℃ (comparable to 22 months at 4 ℃). Detection of 1 179 clinical sera with Apd-ELISA indicated that the positive rates were 83.76%, 61.09% and 27.48% in sows, fattening pigs and piglets, respectively. Compared with the OppA-ELISA kit from Biocheck (OppA-ELISA), Apd-ELISA showed 100% identity to the results of OppA-ELISA kit in clinically negative sera and experimentally positive sera from the pigs immunized with the inactivated vaccine, but 4.76%(6/126)identity to the results in the sera from clinically positive sera. However, Apd-ELISA displayed 73.02%(92/126)identity to the results of OppA-Western blot in the sera from clinically and experimentally infected pigs. The present study obtained the Apd-ELISA kit that can effectively distinguish HPS-positive and -negative sera and can be stably preserved, which would be applied for antibody monitoring among pigs immunized with HPS-inactivated vaccine and subjected to infection of H. parasuis.     

副猪嗜血杆菌Apd-ELISA抗体检测试剂盒的制备和初步应用

旨在对副猪嗜血杆菌（Haemophilus parasuis,HPS）的黏附素蛋白（autotransporter passenger domain,Apd）ELISA抗体检测方法进行参数优化、临界值确定和应用评价,获得性能稳定的副猪嗜血杆菌病抗体检测试剂盒。首先通过猪的免疫攻毒试验获得HPS阴、阳性对照血清,优化Apd-ELISA的反应参数;然后用背景确认的阴、阳性血清确定其临界值,并对封闭液及酶标板的包装方式进行选择;最后用Apd-ELISA试剂盒对临床样品进行检测并与荷兰Biocheck的OppA-ELISA试剂盒进行比较。结果表明,抗原包被质量浓度为0.5 μg·mL^-1、被检血清以1：200倍稀释后反应45 min以及二抗稀释度为1：15 000时,Apd-ELISA的反应背景下降,区分度提高。根据背景确认的27份阳性和40份阴性血清的OD_{630 nm}值以及临界值计算公式（S-N）/（P-N）,得到Apd-ELISA的阴阳性临界值是0.33。证实用封闭液K封闭和真空包装的酶标板可以在50℃保存4 d（相当于在4℃保存22个月）。用Apd-ELISA试剂盒检测1 179份临床血清,表明母猪、后备和育肥猪以及仔猪的HPS血清阳性率分别为83.76%、61.09%和27.48%。与荷兰的Biocheck试剂盒进行比较,发现Apd-ELISA与Biocheck试剂盒（OppA-ELISA）对HPS临床阴性血清和疫苗免疫血清检测的符合率为100%,对HPS临床阳性血清的符合率仅为4.76%（6/126）。然而,Apd-ELISA与OppA Western blot的阳性符合率可达到73.02%（92/126）。本研究获得了能有效区分HPS阴、阳性血清和稳定保存的Apd-ELISA抗体检测试剂盒,可用于HPS灭活疫苗免疫后的抗体检测和副猪嗜血杆菌病的血清抗体检测。     

应用间接ELISA检测鸡痘病毒抗体方法的建立

应用鸡胚成纤维细胞(CEF)扩增鸡痘病毒(Fowlpox virus,FPV)并提纯后作为抗原建立了具有较高特异性和灵敏性的间接ELISA方法.通过方阵滴定法来确定抗原最佳包被浓度为2.7μg/孔,待检血清最佳稀释倍数为1:100,其阳性临界值为OD≥0.113.将400份FPV免疫实验鸡血清用本方法进行检测,其阳性检出率为81.25%(325/400).此外,将该方法与琼脂扩散试验进行比较检测血清样品,结果显示本方法的灵敏度比琼脂扩散试验灵敏400～800倍,而且还有特异性强,操作简便、快速等优点.     

副猪嗜血杆菌PCR诊断试剂盒的研制及初步应用

在特异性和敏感性试验的基础上,组装副猪嗜血杆菌PCR诊断试剂盒,进行批间和批内试剂盒的检测、试剂盒在不同温度条件下的保存期试验等.结果表明,试剂盒特异性好、敏感性高,批内和批间的试剂盒无差异,试剂盒在-20℃可保存30个月,4℃可保存12个月.适用于不同地区、不同条件的实验室快速检测副猪嗜血杆菌.     

丝状霉形体山羊亚种血清抗体间接ELISA检测方法的建立

利用丝状霉形体山羊亚种标准株PG3制备抗原,经纯化后作为包被抗原建立了间接ELISA方法,用于检测丝状霉形体山羊亚种血清抗体。经方阵滴定确定最佳抗原包被浓度为1.09μg/mL,血清样品最佳稀释度为1∶64,兔抗羊IgG辣根过氧化物酶结合物的最佳稀释度为1∶40 000,抗原抗体最佳结合时间为1 h。判定标准为样品D490 nm值与标准阴性血清D490 nm值之比（P/N）≥3为阳性,≤2.5为阴性,介于二者之间的为可疑。重复性和稳定性试验证明,建立的间接ELISA的稳定性和重复性良好,与间接血凝试验相比,其敏感性较高。     

马冠状病毒抗体的间接ELISA检测方法的建立

将含有马冠状病毒N蛋白(ECV-N)的重组杆状病毒rBac-ECV-N感染Sf9昆虫细胞,以表达的ECV-N蛋白作为抗原,以酶标记的鼠抗马IgC特异性单抗为二抗,建立了检测马冠状病毒抗体的ELISA方法.研究结果表明,ECV-N蛋白最佳包被浓度为10μg/mL初提重组蛋白,马血清以1:100稀释,酶标记的抗马IgG单克隆抗体工作浓度1:5 000.可以检出抗马冠状病毒血清抗体.利用该方法对来自3个国家的1064份马血清进行了检测,检测结果表明:国内711份马血清中检测出13份阳性;澳大利亚335份马血清中检测出31份阳性;瑞典18份马血清均为阴性.该间接ELISA方法的建立,为马冠状病毒感染的预防和控制,出入境检验检疫提供了一种新的检测方法.