黄牛和水牛种间核移植研究初报

本实验探讨了将体外培养成熟的水牛卵母细胞去核后 ,作为体外受精生产的黄牛胚胎细胞核移植的受体进行种间核移植的可能性。结果表明 ,黄牛与水牛进行种间核移植的重组卵有 54.2 %的融合率 ,显著地低于黄牛种内核移植的结果 ( 75.0 % ,P<0 .0 5) ;而卵裂率两者之间差别不大 (分别为 65.4 %和 71 .2 % ,P>0 .0 5)。但来自种间核移植的早期胚胎体外发育潜能很低 ,体外囊胚发育率只有 5.9% ,很显著地低于种内核移植的结果 ( 50 .0 % ,P<0 .0 1 )。用作种间核移植受体的体外成熟水牛卵母细胞质量较差可能是造成重组胚体外发育能力低的主要因素之一。     

不同发情周期阶段和不同体积卵泡的卵母细胞对体外受精及其发育的影响

根据母牛卵巢黄体发育状态将实验用卵巢相应地划分为早期黄体(ELP)、功能黄体(LP)和退化黄体(LLP)三个试验组(实验1);实验2则按实验卵巢上卵泡的表面直径大小划分为小于2mm,2～6mm 和大于6mm 三组.采用注射器抽取法采集卵泡里的卵母细胞,然后按 Lu 等报导的方法进行体外成熟培养和体外受精。受精卵继续在体外条件下培养到囊胚阶段。实验2还进一步观察了囊胚体外发育到孵化囊胚的比率。结果表明,来自不同发情周期阶段的牛卵母细胞,经体外成熟培养后,各组体外受精分裂率(74.3%～78.4%)及体外囊胚发育率(27.7%～31.3%)均无显著差异;而来自表面直径小于2mm 卵泡的卵母细胞,其体外受精分裂率和体外囊胚发育率均显著地低于2～6mm 及大于6mm 组(P<0.01);来自直径大于6mm 卵泡的卵母细胞受精后的早期胚胎体外囊胚发育率均显著高于其余两组(p<0.01)。表明卵泡及其卵母细胞在体内的发育程度对其后体外受精及早期胚胎进一步发育的能力只有一定的影响。     

重离子束辐照对绵羊卵母细胞及体外受精卵早期发育的影响

试验探索重离子束辐照对绵羊卵母细胞的体外成熟及体外受精卵早期胚胎发育的影响。用不同剂量的重离子束辐照绵羊卵母细胞和精液,观察卵母细胞体外成熟率及体外受精后早起胚胎的卵裂率、桑椹胚率及囊胚率。试验结果显示:与对照组相比,1.0、1.5Gy辐射可以明显提高绵羊卵母细胞的体外成熟率(p0.01);重离子辐照绵羊精液和卵母细胞并做体外受精后,早期胚胎发育有着显著变化。当用0.5、1.0Gy剂量辐照精液时,绵羊早期胚胎的卵裂率和桑葚胚率显著升高(p0.05),囊胚率无显著变化,1.5 Gy剂量,卵裂率显著提高(p0.05),2.0 Gy剂量,卵裂率、桑葚胚率、囊胚发育率均极显著降低(p0.01);当重离子束辐照卵母细胞时,0.5、1.0Gy剂量组的卵裂率、桑葚胚率和囊胚发育率显著升高(p0.05),而2.0Gy剂量组的卵裂率和桑葚胚发育率极显著降低(p0.01),而囊胚发育率为0。结果表明低剂量的重离子辐照绵羊精液、卵母细胞,对体外受精和早期胚胎发育具有明显的促进作用,而高剂量辐照则抑制细胞的生长发育。     

水牛和黄牛种间体外受精的研究

将从屠宰母牛卵巢上采集的水牛和黄牛的卵母细胞经 2 0～ 2 4 h体外成熟培养后 ,分别用么拉水牛或奶牛精液进行种间和种内体外受精。受精卵在体外条件下继续培养到囊胚和孵化囊胚阶段。结果表明 ,用黄牛精子受精水牛卵母细胞 (黄×水 )或用水牛精子受精黄牛卵母细胞 (水×黄 )的种间体外受精均有较高的卵裂率 (分别为 4 6.5%和 68.4 % )。但其体外囊胚发育率分别只有 3.5%和 8.7% ,显著低于种内受精组(水×水组为 1 9.9% ,黄×黄组为 2 8.0 % ,P<0 .0 5)。在受精后 2 0 h对受精卵进行固定、染色 ,发现种间受精的黄×水和水×黄组 ,分别有 36.8%和 75.0 %的受精卵形成有 1个以上原核 ,且这些受精激活卵中大部分含 2个原核以上 (分别为 80 .9%和 80 .0 % ) ,说明种间受精的精子已进入到卵母细胞内受精并形成了雄性原核。     

胰岛素和葡萄糖对水牛体外受精早期胚胎发育的影响

探讨了不同浓度的胰岛素和葡萄糖对水牛体外受精早期胚胎体外发育的影响。结果表明,添加胰岛素浓度为5μg/mL时,水牛早期胚胎的囊胚发育率、囊胚细胞数及冷冻-解冻后胚胎的孵化率都显著高于对照组及其他浓度组(P<0.05);加入葡萄糖的浓度大于6 mm o l/L时显著影响水牛早期胚胎发育到囊胚及孵化囊胚的阶段(P<0.05);联合添加胰岛素和葡萄糖时能显著提高水牛早期胚胎的孵化囊胚率、总囊胚率和囊胚细胞数(P<0.05)。实验证实,浓度为5μg/mL胰岛素能促进水牛体外受精早期胚胎的发育;在TCM-199中单独添加葡萄糖是不必要的,联合添加葡萄糖和胰岛素能促进水牛体外受精早期胚胎的发育。     

OPS法玻璃化冷冻牛卵母细胞和囊胚

本文报道了利用拉细开口型细管 (Open Pulled Straw,OPS)方法进行玻璃化冷冻保存体外成熟(IVM)的牛卵母细胞及体外生产 (IVP)的牛囊胚的实验结果。实验 1的牛卵母细胞冷冻处理分 2组 ,组 1(G1 )是将卵母细胞在 IVM2 1 h时去除部分卵丘细胞后马上进行冷冻处理。组 2 (G2 )卵母细胞在 IVM6h时去除部分卵丘细胞 ,然后继续培养至 2 2 h冷冻 ;冷冻后的卵母细胞在液氮中保存 0 .5～ 2 h后解冻再继续 IVM1 h后与正常 IVM2 4h的对照组卵母细胞一起进行体外受精 (IVF)处理。实验 2则冷冻了来自IVP的 6、 7日龄的牛囊胚。结果显示 ,G1的卵母细胞 IVF后 8d的囊胚率 (2 2 .8% ,2 6/1 1 4)和孵化囊胚率 (1 4.9% ,1 7/1 1 4)都极显著地高于 G2 (分别为 2 .9% ,5 /1 71和 0 .5 % ,1 /1 71 ,P<0 .0 0 1 ) ;但两处理组的受精卵裂率差别不大 (分别为 48.2 %和 41 .5 % ,P>0 .3 )。冷冻第 6d和第 7d的体外囊胚 ,其冻后存活率和囊胚孵化率分别为 92 .7%、 89.2 %和 83 .6%、 66.7%。结果表明 ,利用 OPS法玻璃化冷冻经体外培养成熟的牛卵母细胞及体外生产的牛囊胚均能获得良好的效果     

牛生发泡期裸卵体外成熟培养体系的建立

本研究通过牛(Bos taurus)卵母细胞体外成熟培养不同时间(0和10 h),剥除卵母细胞外周的颗粒细胞后继续培养,观察其与不脱颗粒细胞正常体外成熟培养卵母细胞之间的差异.研究结果显示:成熟培养0脱颗粒细胞的卵母细胞,与正常成熟培养的卵母细胞在成熟率(19.51%vs.80.14%,P<0.05)、卵裂率(27.08%vs.82.61%,P<0.05)和孤雌激活胚胎囊胚率(7.69%vs.21.71%,P<0.05)差异显著;成熟培养10 h后脱颗粒细胞的牛卵母细胞,与正常体外成熟培养的卵母细胞相比,在成熟率(82.71%vs.80.14%,P>0.05)、卵裂率(83.01%vs.82.61%,P>0.05)和孤雌激活胚胎囊胚率(19.30%vs.21.71%,P>0.05)无显著差异.向成熟培养10h脱颗粒细胞的卵母细胞内注射pVenus-Hlfoo mRNA,pVenus,pDsRed1-N1和重组质粒pDsRedl-Hle都能够得到表达.非功能标记基因显微注射组与对照组在卵母细胞成熟率(81.42%vs.82.03%,P>0.05)、卵裂率(75.24%vs.78.15%,P>0.05)和孤雌激活胚胎囊胚率(17.42%vs.18.82%,P>0.05)上差异不显著.研究结果提示:在成熟培养10 h,剥离颗粒细胞不会影响牛卵母细胞的发育潜能,这一技术平台可以用于牛卵母细胞体外成熟分子机制的研究.     

水牛卵母细胞成熟时间对核移植效果的影响

主要探讨水牛卵母细胞的成熟时间对其体细胞核移植效果的影响,结果表明,在体外成熟(IVM16～24h)期间,不同的去核时间对水牛卵母细胞核移植后的融合率、分裂率和囊胚发育率都没有显著影响(P>0.05),但卵母细胞去核后的注核存活率,IVM16～18h组与IVM22～24h组有极显著差别(P<0.01)。经6-二甲氨基嘌呤(6-DMAP)抑制成熟培养的卵母细胞,再成熟培养16～18h后,与直接在体外成熟培养16～18h的卵母细胞的融合率、分裂率和囊胚发育率相比,均无显著影响(P>0.05)。水牛卵母细胞的成熟时间对其核移植效果无明显影响,6-DMAP可用于调整水牛卵母细胞的去核操作时间。     

受精液、咖啡因、精液和抗菌素对猪卵母细胞的体外受精及早期胚胎发育的影响

探讨精液的不同处理、抗菌素、受精液种类和咖啡因对体外成熟猪卵母细胞的体外受精和早期胚胎发育的影响。结果表明：(1)受精液中抗菌素添加与否对体外成熟猪卵母细胞的体外受精无显著影响，而且不添加抗菌素的受精液也无严重微生物污染；(2)用猪冷冻精液与新鲜精液进行猪卵母细胞的体外受精对早期胚胎发育无显著影响；(3)在受精液mTBM中添加5mmol／L咖啡因对猪卵母细胞体外受精后的早期发育是最好的；(4)用mTBM进行猪卵母细胞体外受精的卵裂率明显高于用mBO进行体外受精的卵裂率，但其第8d囊胚率明显低千用mBO进行体外受精的，mTBM和mBO各有优势；(5)在洗精子液含有高浓度咖啡因(15mmol／L)的情况下，无咖啡因的受精液也可进行猪卵母细胞的体外受精并发育到囊胚阶段，在受精液中添加不同浓度(0～10mmol／L)的咖啡因对猪卵母细胞体外受精后的卵裂率和第8d囊胚率都无显著影响，受精液中咖啡因对猪卵母细胞体外受精后的第6d桑椹胚 囊胚率的影响因浓度而异．其中以添加5mmol／L为最佳，随着浓度上升效果开始下降。     

丁内酯-I对绵羊卵母细胞体外成熟和受精的影响

绵羊卵母细胞经丁内酯-I(BL-I)抑制培养,然后转入成熟培养液培养不同时间,进行体外受精并观察胚胎发育情况。结果：解除8h抑制再培养8h组处于MⅡ期卵母细胞比率6.38％显著低于其它组别（P<0.01）。继续培养16h、20h的卵母细胞成熟率与对照组差异不显著,培养24h组卵母细胞成熟率(70.83%)稍高于对照组(66.18％),但差异不显著(P>0.05)。培养16h、20h组囊胚率分别为2.99%、13.64％与对照组24.39%差异显著(P<0.05),培养24h组的囊胚率20.33％与对照组差异不显著(P>0.05)。结论：BL-I对绵羊卵母细胞的成熟抑制作用是可逆的,经BL-I处理后未能提高绵羊卵母细胞体外受精和胚胎的整体发育能力。     

牛卵泡液对牛卵母细胞体外成熟的影响

本研究系统探讨了牛卵泡液（ＢＦＦ）对牛卵母细胞体外成熟的影响。在成熟培养液中添加１０％的ＢＦＦ，明显提高牛卵母细胞体外成熟后的囊胚发育率（４５．１％比２８．２％，Ｐ＜０．０５），虽然该处理对牛卵母细胞体外成熟后的受精分裂率无明显影响（８７．５％比８７．５％）。然而，当ＢＦＦ在成熟培养液中的浓度提高到４０％时，卵母细胞体外成熟后的受精分裂率（６８．６％）和囊胚发育率（１６．６％）均明显下降（Ｐ＜０．０５）。来自不同大小卵泡（２～５ｍｍ，５．１～８ｍｍ和大于８ｍｍ）ＢＦＦ的卵母细胞体外成熟培养效果无明显差异，只是来自大于８ｍｍ卵泡的ＢＦＦ将卵母细胞粘在一起，明显地降低成熟培养后的可用卵母细胞数。在成熟培养液中加入激素（２．５×１０３ｉｕ／Ｌ促性腺激素（ＨＣＧ），５０ｉｕ／Ｌ促乳素，０．０５ｍｇ／Ｌ胰岛素、睾酮和雌二醇）对ＢＦＦ的卵母细胞成熟培养效果无影响。这些结果表明，在成熟培养液中添加一定浓度的ＢＦＦ可促进牛卵母细胞获得胚胎发育能力，ＢＦＦ的这一作用与其来源的卵泡大小和激素的存在与否无关。     

体细胞因子对牛卵母细胞体外受精的影响

本研究系统探讨了体细胞因子对牛卵母细胞体外受精的影响。在受精液中添加５％或１０％的牛卵泡液（ＢＦＦ）明显降低牛卵母细胞受精后的分裂率（３８．３％和４０．４％比对照８７．５％，Ｐ＜０．００１）和囊胚发育率（１７．４％和８．３％比对照４０．４％，Ｐ＜０．００１）。然而，在受精液中加入５０％的内膜细胞受精条件液明显提高牛卵母细胞受精后的囊胚发育率（４３．１％比３４．８％，Ｐ＜０．０５），虽然该处理对牛卵母细胞受精后的分裂率无明显影响。在体外受精系统中加入颗粒细胞的受精条件液，新鲜的输卵管细胞，输卵管细胞的单层细胞或输卵管细胞的受精条件液对牛卵母细胞的分裂率及囊胚发育率均无明显影响。相反，新鲜输卵管细胞组获得较低的分裂率（８１．７％）和囊胚发育率（３２．２％）。这些结果表明：ＢＦＦ对牛卵母细胞的体外受精具抑制作用，而内膜细胞的条件液则具促进效应。ＢＦＦ的这种受精抑制因子可能来自血清而不是卵泡细胞。     

无卵丘的水牛卵母细胞体外成熟方法的研究

卵母细胞生长发育和成熟调控机理的研究,是生殖生物学领域研究的热点和难点。研究发现,卵丘细胞的存在与否严重影响卵母细胞的体外成熟质量,且小鼠无卵丘的卵母细胞经体外成熟并常规体外受精后未能得到“试管后代”,表明常规体外培养方法明显降低无卵丘的卵母细胞发育潜能。可能的原因是:(1)卵母细胞与颗粒细胞间的间隙连接丢失,这种连接对卵母细胞的胞质成熟是至关重要的。(2)皮层颗粒的减少或继续生成路径的障碍。(3)卵母细胞易于贴底,造成变形,从而可能引起卵母细胞内细胞器机械性移位,造成损伤,且贴底后可能影响卵母细胞与培养基的物质交换。因此,探明卵丘细胞在卵母细胞体外成熟的作用及机制,探索培养无卵丘的水牛卵母细胞的新方法,对于今后进一步提高卵母细胞成熟质量具有重大的指导意义。本研究针对去卵丘细胞的卵母细胞体外培养存在的问题,以卵巢组织、卵丘细胞为介质来模拟卵母细胞在体内的状态,试验分为5组:M1,直接培养法(对照组);M2,与单层卵丘细胞共培养法;M3,未扩展卵丘细胞包围法;M4,扩展卵丘细胞团支撑法;M5,卵巢组织薄片包围法。培养24 h后计算第一极体(PB1)排出率,随后对这些卵母细胞进行孤雌激活。结果发现:成熟24 h时,M4组的第一极体排出率明显高于M1组和M5组,其他各组间没有显著差异(P>0.05);孤雌激活结果显示M5组的卵裂率显著低于M1组(P<0.05),而M2组与M1组间没有差异(P>0.05);但M3和M4两组的囊胚发育率显著高于M1组和M5组(P<0.05)。结论:(1)扩展卵丘细胞团支撑法支持无卵丘的水牛卵母细胞的体外核质成熟,而未扩展卵丘细胞包围法促进卵母细胞胞质的成熟,这可能是通过重新构建卵丘-卵母细胞间的间隙连接实现的;(2)与单层卵丘细胞共培养法并不能促进无卵丘的水牛卵母细胞的核成熟及其发育潜力;(3)用卵巢组织包围不能模拟体内卵巢的环境,且卵巢组织可能分泌抑制卵母细胞胞质成熟的因子。目前对无卵丘卵母细胞的培养方法的研究甚少,而我们建立的卵丘细胞团包围/支撑法及卵巢组织包围培养法未见类似的报道。本研究初步建立了水牛无卵丘卵母细胞的有效培养方法,将为研究卵母细胞生长发育和成熟调控机理提供新的模型,为利用无卵丘的水牛卵母细胞提供理论和技术支持。     

水牛体细胞核移植相关影响因素的研究

主要是探讨水牛卵母细胞的体外成熟与供体的年龄和性别对其核移植效果的影响。体外成熟培养22～24h的水牛卵母细胞,在含有5μg／mL细胞松弛素的操作液中进行去核,然后将经0．1μg／mL蚜栖菌素（Aphidicolin,APD）培养处理24h,再用0．5％胎牛血清（FBS）培养2d的水牛耳皮成纤维细胞注射到去核的卵母细胞卵周隙中,再经电融合形成重构胚。重构胚经5μmol／L离子霉素激活处理5min并在2mmol／L的二甲氨基嘌呤（6-DMAP）中培养3h后,在含有颗粒细胞单层细胞的微滴中（30μL）培养7d,观察其卵裂和胚胎发育情况。结果显示：在添加有10ng／mL上皮生长因子（EGF）成熟液中培养的受体水牛卵母细胞的融合率和重组胚卵裂率与对照组无显著差异（P〉0．05）,但其囊胚发育率明显高于对照组（18．53％vs．7．56％,P〈0．05）。来自胎儿（3个月）或成年（一头5～6岁,另一头22岁）水牛的耳皮成纤维细胞核移植后重组胚的卵裂率差异不显著（P〉0．05）,但水牛胎儿体细胞构建的重组胚囊胚率显著高于成年体细胞（22．55％vs．10．77％和8．09％,P〈0．05）。雌性水牛成纤维细胞构建的重组胚的囊胚发育率（20．23％）显著高于雄性水牛体细胞的囊胚率（10．16％,P〈0．05）。以上结果表明：（1）成熟液中添加EGF能提高受体卵母细胞核移植后的胚胎发育率;（2）水牛体细胞核移植效果受供体的个体年龄和性别的影响：胎儿成纤维细胞的核移植效果优于成年的成纤维细胞,而且以雌性的效果较好。     

山羊卵母细胞无血清体外成熟培养

为研究无血清培养系统对山羊卵母细胞体外成熟及孤雌激活胚胎早期发育力的影响,分别以0.3%牛血清蛋白(BSA)(mV)、1%聚乙烯醇(PVA)(mV)和1%胰岛素转铁蛋白亚硒酸钠(ITS)(VV)代替成熟培养液中胎牛血清(FBS),以添加5?S的OM为对照组,对来源于屠宰场的卵巢卵母细胞复合体(COCs)进行体外培养。成熟率PVA添加组(50.00%)显著低于FBS组(83.23%)(P<0.01)、BSA组(71.19%)和ITS组(76.79%),与FBS组无显著差异(P>0.05);成熟卵母细胞用离子霉素联合6-DMAP激活,在SOFaa中进行孤雌胚培养,BSA、PVA、ITS及FBS各组的卵裂率依次为61.90%、46.97%、79.07%和83.58%,囊胚率分别为25.00%、19.70%、55.81%和60.45%。结果表明:在OM基础培养液中添加BSA或PVA,卵母细胞的成熟率明显低于添加FBS,且卵裂率和囊胚发育率也低于对照组(P<0.05或P<0.01);添加ITS,卵母细胞成熟率虽低于对照组,但孤雌胚卵裂率和囊胚发育率与对照组接近(P>0.05)。表明以ITS代替FBS,可用于山羊卵母细胞体外成熟培养。     

不同血清种类及其浓度对牛卵母细胞体外受精的影响

以３个试验探索能否用自行采集、价廉的成年牛血清（发情母牛血清ＯＣＳ和阉公牛血清ＳＳ）来代替犊牛血清（ＦＣＳ）。试验１，比较ＯＣＳ和ＦＣＳ及其２种浓度（１０％和２０％）对牛卵母细胞体外成熟的影响。结果表明，ＯＣＳ影响牛卵母细胞体外成熟的效果与ＦＣＳ的效果无显著差异（均达到９０％以上）。同时，２种浓度间亦无显著差异。试验２，比较不同浓度的ＯＣＳ（０，１％，５％，１０％，２０％，５０％）对牛早期胚胎体外发育的影响。结果表明，早期胚胎的总囊胚率及７天龄囊胚率随着ＯＣＳ浓度从０到２０％的增加而提高。但当浓度增至５０％时囊胚率则有下降之趋势，然而与２０％浓度比较，差异不显著。试验３，探讨能否利用采集简单且价廉的ＳＳ来代替ＯＣＳ，进行了ＳＳ与ＯＣＳ在卵母细胞体外成熟及早期胚胎体外培养两阶段的效果比较。结果表明，ＳＳ亦完全可以替代ＯＣＳ。     

血清添加时间及胚胎培养模式对产业化生产牛胚胎的影响

在利用体外受精技术产业化生产牛胚胎的体系中,体外受精卵一开始就培养在已加入犊牛血清（FBS）的改良SOF液的实验组,其卵裂率（80.6%,253/314）和可冷冻胚胎率（20.8%,129/620）与在体外受精（IVF）3 d后才往胚胎培养体系中加入FBS的结果差异不显著（相应为83.4%,262/314和24.4%,151/620,P〉0.05）;而囊胚率差异显著（分别为41.8%,259/620和 48.5%,301/620,P〈0.05）.在IVF后第3天将培养体系中的未受精卵及发育迟缓的2-细胞阶段胚胎剔除与否的不同胚胎培养模式对其后囊胚的产量和质量均无显著影响.     

幼畜繁殖（JIVET）技术在性成熟前奶牛上的应用

本实验旨在建立高效的性成熟前奶牛幼畜繁殖(JIVET)技术体系.建立了有效的对性成熟前犊牛进行促性腺激素处理的方法,平均每只犊牛可获得卵母细胞31枚:卵母细胞在体外成熟和体外受精过程中,受精率达到63.2%,与成年牛(59.7%)差异不显著.胚胎体外培养后犊牛胚胎囊胚率达到31.6%,仍显著低于成年牛(48.0%).对3头同期发情受体母牛进行胚胎移植,其中2头受孕,1头完成全程妊娠,受孕率达到66.7%.