异育银鲫对嗜水气单胞菌灭活菌苗的免疫应答

采用神尔马林灭活的嗜水气单胞菌（Aeromondas hydrophila)菌苗免疫接种异育银鲫，通过测定受免鱼血清中凝集抗体效价，溶菌酶活性，血液中吞噬细胞的吞噬活性，杀菌活性并通过鱼体攻毒试验，探讨了异育银鲫对福尔马林灭活的嗜水气单胞菌菌苗的免疫应答状况，结果表明，接种28d后，受免鱼血清中凝集抗体效价和溶菌酶活性均值分别为1：18.89和156.36U/dml，相应的对照组则为1：0.83和138.68dU/ml；受免鱼血中白细胞吞噬百分比和吞噬指数分别为63.38%和6.02，而对照组的分别库存47.95%和5.08；免疫组和对照组白细胞的杀菌指数分别为1.59和1.15，受免鱼的免疫保护力达到73.7%。     

嗜水气单胞菌灭活疫苗对鲫鱼的免疫效果

随着食品安全等问题日趋严重,寻找良好而安全的防治细菌性疾病的方法迫在眉睫。本研究利用从患病鲫鱼体内分离的嗜水气单胞菌制备灭活疫苗,用(50±5) g的健康鲫鱼作为试验对象,免疫组腹腔注射制备的疫苗,对照组腹腔注射等量的磷酸缓冲液。二次免疫后1、7、14、21、28 d检测血清凝集效价、血清中溶菌酶活性和酸性磷酸酶活性;二次免疫28 d后,对免疫组和对照组同时腹腔注射嗜水气单胞菌进行攻毒,观察鲫鱼生长状况,记录死亡量。结果表明,免疫组血清凝集效价在免疫后逐渐升高,在21 d达到峰值,明显高于对照组;血清中溶菌酶活性和酸性磷酸酶活性都于免疫后14 d达到峰值,明显高于对照组;攻毒结果显示,免疫组死亡率10.0%,对照组死亡率83.7%,相对保护率达到88.5%。说明制备的嗜水气单胞菌灭活疫苗可以诱导鲫鱼产生免疫应答反应,对嗜水气单胞菌的感染具有较好的免疫保护作用。     

嗜水气单胞菌毒素研究

嗜水气单胞菌近年引起我国养殖鱼类暴发性鱼病的大面积流行，给我国渔业生产造成了极大损失。溶血毒素是该菌致病的主要因子，该毒素是一条链的多肽，分子量５２０００道尔顿左右，与红细胞膜上的血型糖蛋白结合形成寡聚体，进而在膜上成洞，溶血。ＤＮＡ序列分析结果显示该毒素基因与典型的原核基因相符。由于该菌的抗药性等问题，应用基因工程的方法改造病原菌是防治暴发性鱼病的有前途的手段之一。     

嗜水气单胞菌灭活苗的研制

选取具有HEC毒素的致病性菌株AH3，按照最佳培养条件制成AH3灭活全菌苗。免疫接种小鼠和鲫鱼，小鼠获得完全免疫，鲫鱼注射免疫组保护率为75％，浸泡免疫组保护率为33％，对照组保护率为0％。     

团头鲂对嗜水气单胞菌的免疫应答

从患有细菌性出血病的团头鲂内脏分离到嗜水气单胞菌,采用0.2%福尔马林25℃灭活24 h和0.5%福尔马林4℃灭活24 h两种不同方法制备疫苗作为抗原,于胸鳍基部注射免疫团头鲂.通过测定受免团头鲂血清中抗体凝集效价、血液中NBT阳性细胞数量、吞噬细胞活性以评估免疫效果.结果表明.两种方法制备的灭活菌苗均可刺激鱼体产生较强的免疫应答,而采用0.2%福尔马林灭活的免疫效果优于0.5%福尔马林灭活,但二者无显著差异.活菌攻毒的结果表明团头鲂对嗜水气单胞菌产生了较强的免疫能力.     

嗜水气单胞菌、爱德华氏菌灭活菌苗免疫保护及药物治疗试验

嗜水气单胞菌、爱德华氏菌培养物经甲醛灭活后,制成灭活油乳剂苗、灭活菌苗、饵料吸附型疫苗,免疫罗非鱼2周后,分别以嗜水气单胞菌、爱德华氏菌活菌液攻毒,结果显示,注射型疫苗均优于口服型,其中嗜水气单胞菌以腹腔注射0．1mL嗜水气单胞菌灭活菌苗＋0．3mL生理盐水的效果最佳,免疫保护率为85．0％;而爱德华氏菌以腹腔注射0．4mL灭活油乳剂苗效果最佳,免疫保护率为90．0％。两者的药物治疗试验结果显示,以氟苯尼考、恩诺沙星、环丙沙星、氟哌酸治疗罗非鱼嗜水气单胞菌病、爱德华氏菌病均有一定效果,对减少发病率及死亡率、控制病情具有较好作用,其中以氟苯尼考的疗效最佳,其用量为20mg／kgH2O。     

嗜水气单胞菌的拮抗菌及其拮抗物质测定

为探索利用有益微生物防治嗜水气单胞菌引起的鱼类细菌性疾病的途径，从田边水沟污泥中筛选到１５株强抗气单胞菌的菌株，通过一系列提取和测定，从中进一步分离出３种拮抗类型菌侏：Ａ．能分泌拮抗蛋白的有４株（Ｋ１、Ｋ１１、Ｋ１９、Ｋ３７）；Ｂ．在生长中分泌非蛋白拮抗物质的有９株（Ｋ７、Ｋ８、Ｋ９、Ｋ１２、Ｋ１４、Ｋ２９Ｋ、Ｋ３０、Ｋ６０、Ｋ６１）；Ｃ．生长到一定阶段后分泌非蛋白拮抗物质的有２株（Ｅ１６、Ｅ４３     

注射嗜水气单胞菌灭活菌的齐口裂腹鱼外周血免疫指标的变化

齐口裂腹鱼Schizothoraxprenanti 是我国重要的冷水鱼类之一,为我国长江上游名贵经济鱼类.该研究在 免疫组和对照组齐口裂腹鱼胸鳍基部分别注射0.2mL体积单位为1.0×108 CFU/mL福尔马林灭活的嗜水气单胞 菌苗(F-AH)和0.65%灭菌生理盐水,在免疫后第1,2,4,7,14,21,28天,测定外周血液血细胞数量及组成比例,血 细胞吞噬活性和血清抗体效价.结果显示注射灭活菌苗后红细胞、白细胞、淋巴细胞、中性粒细胞和单核细胞的数 量逐渐增加,显著高于对照组;血栓细胞的数量逐渐降低,在第4天和第7天显著低于对照.吞噬百分比(PP)和吞 噬指数(PI)迅速上升,第2天达峰值,PP第2,4天显著或极显著高于对照组;PI第2,4和7天极显著高于对照组. 血清抗体效价逐渐升高且在第7天和第14天达到最高值.结果表明单次注射灭活菌苗后齐口裂腹鱼可以产生良好 的免疫应答.     

团头鲂对嗜水气单胞菌的免疫应答水产

从患有细菌性出血病的团头鲂内脏分离到嗜水气单胞菌,采用0．2％福尔马林25℃灭活24h和0．5％福尔马林4℃灭活24h两种不同方法制备疫苗作为抗原．于胸鳍基部注射免疫团头鲂,通过测定受免团头鲂血清中抗体凝集效价、血液中NBT阳性细胞数量、吞噬细胞活性以评估免疫效果。结果表明,两种方法制备的灭活菌苗均可刺激鱼体产生较强的免疫应答．而采用0．2％福尔马林灭活的免疫效果优于0．5％福尔马林灭活．但二者无显著差异。活菌攻毒的结果表明团头鲂对嗜水气单胞菌产生了较强的免疫能力．     

鳖的嗜水气单胞菌的分离及其特性鉴定

从杭州市某甲鱼养殖场发生后咱持续性慢性不明传染病病死甲鱼中，分离到多株细菌。用玻板凝集试验筛选出与嗜水气单胞菌抗血清发生强阳性反应的两株细菌，经形态、染色、生长特性研究及生化反应鉴定，确定这两株细菌均为嗜水气单胞菌，但其中一株具毒力，在血琼脂上呈β－溶血，能在４小时内致死小白鼠，而另一株无毒力，不溶血。     

香叶木素对嗜水气单胞菌气溶素表达的抑制作用

为筛选出抗嗜水气单胞菌感染的天然化合物,以嗜水气单胞菌和香叶木素为研究对象,通过最小抑菌浓度测定、生长曲线、溶血试验、免疫印迹、荧光定量PCR和细胞毒性试验研究了香叶木素对嗜水气单胞菌气溶素表达的抑制作用。结果发现,对嗜水气单胞菌生长没有影响的香叶木素能在较低浓度下通过抑制气溶素的表达降低共培养物上清液的溶血活性;荧光定量PCR试验发现香叶木素能剂量依赖性地降低气溶素编码基因aerA 的表达。此外,通过活/死细胞染色发现香叶木素可减轻气溶素介导的细胞损伤。以上结果表明,香叶木素通过降低aerA的转录水平降低了嗜水气单胞菌的体外致病力,可作为一种抗嗜水气单胞菌感染的候选药物。     

团头鲂SOCS家族基因的分子特征及其对嗜水气单胞菌胁迫的响应

为探究团头鲂细胞因子信号转导抑制因子（suppressor of cytokine signaling,SOCS）家族基因的序列特征和功能,从NCBI数据库获取socs1、socs2、socs3a、socs3b、socs4、socs5a、socs5b、socs6、socs7、socs9共10个socs基因的cDNA序列,利用ExPASy、SMART等在线网站对其进行生物信息学分析,预测团头鲂10个SOCS的理论分子质量、理论等电点与结构域等分子特性。系统进化（MEGA 6软件）分析结果显示,10个SOCS可分为2个亚族：Ⅰ型亚族包括SOCS4、SOCS5a、SOCS5b、SOCS6、SOCS7与SOCS9,Ⅱ型亚族包括SOCS1、SOCS2、SOCS3a与SOCS3b。半定量PCR结果显示,健康团头鲂10个socs基因在被检测组织中具有明显的组织特异性,socs1、socs2、socs3在多个组织中表达量较高。在嗜水气单胞菌感染后,采用实时定量PCR检测团头鲂socs基因在脾脏、体肾、头肾中的表达量,其中socs1、socs2、socs3a、socs3b表达量均显著上调。结果表明,团头鲂SOCS家族基因的表达模式各不相同,预示其功能的多样性,其中socs1、socs2、socs3在免疫应答中发挥重要作用。     

嗜水气单胞菌性鲫败血症的盐酸沙拉沙星用药方案研究

【目的】研究盐酸沙拉沙星在鲫鱼体内的药代学、药效动力学联合参数,确定盐酸沙拉沙星治疗鲫鱼细菌性疾病的防耐药突变用药方案。【方法】测定盐酸沙拉沙星对嗜水气单胞菌的体外最小抑菌浓度(MIC)、最小杀菌浓度(MBC)、抗菌后效应(PAE)、防耐药突变浓度(MPC)和防耐药突变选择窗(MSW);给鲫经口灌服不同剂量(20,30,40mg/kg)的盐酸沙拉沙星,于给药后0.5,1,2,4,6,8,10,12,16,24,48h取血清及肌肉样品,研究盐酸沙拉沙星在鲫鱼体内的药代动力学,然后结合药代动力学和药效动力学结果,确定盐酸沙拉沙星防治嗜水气单胞菌引起的鲫鱼细菌性败血症的合理给药方案。【结果】盐酸沙拉沙星对嗜水气单胞菌的MIC为0.5μg/mL,MBC为2.0μg/mL,MPC为2.5μg/mL,MSW为0.5~2.5μg/mL。按20,30,40mg/kg剂量给鲫鱼经口灌服盐酸沙拉沙星后,鲫鱼体内的血药质量浓度大于MPC的维持时间分别为0,4.0,24.0h;AUC24/MIC分别为8.44,78.20,164.96;Cmax/MIC分别为4.496,6.662,15.294。【结论】40 mg/kg灌服剂量能使鲫的血药浓度维持在MPC以上的时间≥(24-PAE)h、AUC24/MIC≥100或Cmax/MIC8,因此建议盐酸沙拉沙星防治嗜水气单胞菌引起的鲫鱼细菌性败血症的防突变用药方案为:给药剂量40mg/kg,每日给药1次,休药期不低于10d。     

碳酸氢钠对嗜水气单胞菌致病性及其主要毒力相关基因表达的影响

为探讨碳酸氢钠对嗜水气单胞菌毒力基因表达的影响,利用荧光定量PCR技术,以未添加碳酸氢钠的嗜水气单胞菌为对照组,添加0.024、0.048、0.072、0.096和0.120 mol/L碳酸氢钠的嗜水气单胞菌为实验组,对嗜水气单胞菌的3个主要毒力基因——溶血素基因(AHH-1)、气溶素基因(Aer A)和弹性蛋白酶基因(ahyB)进行相对表达分析。结果表明,5个实验组嗜水气单胞菌的AHH-1、AerA和ahyB表达量均显著低于对照组。且随着碳酸氢钠浓度的增加,基因表达呈逐渐下调趋势。人工感染结果表明,添加碳酸氢钠培养的嗜水气单胞菌对斑马鱼的半致死量明显比对照组高,而且随着碳酸氢钠浓度的增加,嗜水气单胞菌对斑马鱼的半致死量呈现逐渐加大的趋势,表明毒力逐渐减小。     

鱼类致病嗜水气单胞菌外膜蛋白P5的原核表达、免疫保护及抗血浆杀菌作用研究

研究鱼类致病嗜水气单胞菌外膜蛋白P5的免疫学功能,为相关疫苗开发奠定理论基础.采用生物信息学方法分析P5的理化性质;分子克隆构建P5表达菌株并确定其最佳诱导表达条件,包涵体洗涤和SDS-PAGE电泳切胶纯化P5蛋白,并免疫小鼠制备P5抗血清;Western blotting检测抗血清特异性与效价,免疫酶联法模拟P5抗血...     

江苏地区渔源嗜水气单胞菌流行病学调查

以江苏地区主要淡水渔业养殖品种为研究对象,无菌采集样品肝、脾、肾、腹腔积液和血液增菌纯化后,用API20E试剂条检测嗜水气单胞菌阳性样品92份,阳性率为17.79%。同时用PCR方法对92株初筛阳性进行验证核对,得到60株可鉴定到种的嗜水气单胞菌,其余32株可以鉴定到气单胞菌属。同时对92株阳性菌株进行溶血性试验,其中60株菌具有溶血性,32株不具有溶血性。对采样数据进行综合分析,在12个采样地区样品中均有携带,携带率最低为金坛的10%,最高为大丰的30.77%。在3(-1)0月采样期内均有检出,其中从6月份开始增加,7-9月份较其他月份具有比较明显的增加。从病原生物侵染品种上看,此次调查的主要淡水养殖品种嗜水气单胞菌平均品种检出率为17.79%。     

中华鲟源维氏气单胞菌的分离鉴定及其药敏特性

以自然患细菌性败血症的子二代中华鲟(Acipenser sinensis)幼鱼为研究对象,无菌操作从濒死病鲟体内分离到1株致病菌(zhx20120301)。结合传统细菌学鉴定及分子生物学鉴定方法,对其形态、生理生化特性、16S r DNA序列及系统发育分析等方面进行研究,研究结果显示这株细菌为维氏气单胞菌(Aeromomas veronii)。回归感染试验证实分离菌株具有较强的致病性,能导致健康杂交鲟(西伯利亚鲟Acipenser baerii♂×施氏鲟Acipenser schrenckii♀)死亡,并呈现与自然条件下相似的临床症状,且再分离菌株各种生理生化特性与原分离菌株相同。药敏试验结果表明该菌株对头孢氨苄、头孢唑啉、庆大霉素、四环素、强力霉素、氟苯尼考、多粘霉素B、恩诺沙星、氟哌酸和左氧氟沙星敏感。     

鳙鱼维氏气单胞菌的分离鉴定及其毒力基因检测

从患病鳙鱼中分离纯化得到一株优势菌株AH-YS,通过革兰氏染色、氧化酶试验、生化鉴定以及16S r RNA基因扩增、测序和系统进化分析等操作,结果显示,分离到的细菌为维氏气单胞菌。药敏试验显示,在使用的11种抗菌药物中,该菌株对氧氟沙星、诺氟沙星和恩诺沙星等9种药物敏感,对甲氧苄氨嘧啶和氨苄西林耐药。对9种毒力基因的扩增结果显示,可以检测到气溶素、细胞毒性肠毒素、鞭毛、弹性蛋白酶和酯酶5种。     

草鱼源致病性维氏气单胞菌的鉴定及其黏附特性分析

采用表型鉴定与细菌16S rRNA基因序列分析对从患病草鱼体内分离的病原菌株16-1进行分类鉴定,综合该菌株的表型特征与16S rRNA基因序列,确定其为维氏气单胞菌。随后,对该菌株的细胞黏附特性及其携带的黏附素基因进行检测与分析。结果显示,分离菌株能以聚集性方式黏附于鲤鱼上皮瘤细胞（EPC）周围,平均黏附菌数随共孵育时间延长而增加,90 min达到峰值,说明该分离株具有良好的细胞黏附性。黏附因子检测表明,该菌株同时携带ompAI、ompAII和ahl13种黏附素基因,这些黏附素基因在分离菌株与不同来源参考株之间的核苷酸序列和氨基酸序列同源性分别介于95.8%～99.5%和95.0%～100%（ompAI）,96.3%～99.1%和97.9%～100.0%（ompAII）,78.6%～99.6%和75.5%～99.4% （aha1）,说明所携带的ompAI和ompAII黏附素基因在不同来源的维氏气单胞菌之间具有较高的保守性。     

杀鲑气单胞菌杀藻作用的初步研究

为了研究几丁质酶对硅藻杀灭作用,以杀鲑气单胞菌(Aeromonas salmonicida)和其几丁质酶敲除菌为研究对象对牟氏角毛藻(Chaetoceros muelleri)进行共培养并探究其作用差异。结果表明:杀鲑气单胞菌野生株和缺失株分别与牟氏角毛藻共培养48 h后,野生株对牟氏角毛藻的杀藻率达到9.18%,而缺失株无明显杀藻活性;通过扫描电镜进一步发现野生株细菌能够裂解牟氏角毛藻的细胞壁,而缺失株不能。结果证实杀鲑气单胞菌因具有几丁质酶而对藻类具有杀灭作用。