转拟南芥NPR1基因可增强棉花对真菌病害和肾形线虫的抗性

<正>NPR1(non-expressor of pathogenesis-related genes1)基因是从拟南芥中克隆得到的控制系统获得性抗性(SAR)的重要调节基因。过表达NPR1基因可提高拟南芥等多种植物的抗病性,但对植物生长无不良影响。棉     

稻瘟病抗性基因Pita~2候选基因多位点编辑载体的构建

Pita2是定位于水稻第12号染色体着丝粒区域的稻瘟病广谱抗性基因,前期研究中通过精细定位得到了5个候选基因,其功能及作用原理还不清楚。本研究利用CRISPR/Cas9系统构建Pita2候选基因的多位点编辑载体。首先在候选基因外显子区域找到2个含有PAM序列的特异性靶位点序列,并构建候选基因入门载体SK-gRNA,然后利用同尾酶将SK-gRNA重组载体上的目的片段gRNA酶切,采用一步法将2个gRNA连接到双元表达载体p C1300-Cas9。质粒PCR鉴定以及测序的结果表明,以上5个多位点编辑载体构建成功。后期通过遗传转化并鉴定候选基因表达量与抗病性之间的关系,为水稻稻瘟病抗性基因Pita2功能研究奠定基础。     

NPR1和Cry1Ab13-1基因双价植物表达载体的构建及在玉米中的转化

单一的抗病、抗虫品种已经不能满足需求,因此,本研究通过基因工程技术构建同时具有抗病基因 NPR1 基因和抗虫基因 Cry1Ab13-1 基因并以 bar 基因为筛选标记的植物双价表达载体并进行遗传转化,以获得优良的特点同时兼具抗病抗虫的新株系。通过农杆菌介导法、花粉管通道法和超声波介导法将构建好的植物表达载体在玉米中进行遗传转化,并对 T₂代转基因植株进行 PCR 检测、Southernblotting 整合度检测、实时荧光定量 PCR 转录水平检测、室外抗虫以及室内抗病初步鉴定。结果表明：共获得 T₂代 PCR 阳性植株 14 株。Southern Blot 结果表明,NPR1 和 Cry1Ab13-1 双价基因已经分别以单拷贝形式整合到玉米受体中。实时荧光定量 PCR 结果表明 NPR1 和 Cry1Ab13-1 双价基因在不同组织间相对表达量均高于阴性对照,NPR1 基因在根、茎、叶中相对表达量均值分别为 3.302、1.45、9.75;Cry1Ab13-1 基因在根、茎、叶中相对表达量均值分别为 3.15、1.61、9.89。室外接虫...     

过量表达拟南芥NPR1基因提高小麦纹枯病的抗性

拟南芥NPR1基因是植物重要的抗病调控因子,转基因过表达该基因可以赋予植物广谱抗性.为明确该基因在小麦抗纹枯病基因工程中的应用潜力,本研究构建了由玉米ubiquitin启动子驱动的拟南芥NPR1表达载体,采用基因枪介导法导入到小麦品种扬麦12号中,获得20株转基因植株.对14个外源基因纯合株系的半定量RT-PCR和测序分析结果显示,外源拟南芥NPR1基因已经导入转基因小麦并有不同水平的表达,部分转基因株系拟南芥NPR1基因发生重排;纹枯病抗性鉴定结果表明,转基因株系中拟南芥NPR1基因的正确表达可以减轻纹枯病菌引起的病症发展,提高转基因小麦的纹枯病抗性.     

含异位表达花生AhNCED1基因的拟南芥提高耐渗透胁迫能力

AhNCED1是干旱胁迫下调控花生ABA生物合成的关键基因。以pCAMBIA1301为基本双元表达载体,分别构建CaMV35S启动子和拟南芥AtNCED3基因启动子(AtNCED3p)驱动花生AhNCED1基因的2个植物双元表达载体p35S::ORF和pAtNCED3p::ORF,通过根癌农杆菌介导法将上述两个表达载体分别转化野生型和129B08/nced3突变体拟南芥,经潮霉素筛选和PCR鉴定分别获得35S::ORF-WT和A3p::ORF-B08转基因植株,RT-PCR证实花生AhNCED1基因已在转基因植株中稳定表达,并对野生型、129B08/nced3突变体和转基因拟南芥进行外源ABA敏感性和耐渗透胁迫能力分析。结果表明,129B08/nced3突变体对外源ABA的敏感性下降,而花生AhNCED1基因在拟南芥中的异位表达提高了对外源ABA的敏感性。在山梨醇胁迫下,129B08/nced3突变体种子的相对萌发率明显低于野生型的,而A3p::ORF-B08转基因拟南芥种子的相对萌发率与野生型的相当,显著高于129B08/nced3突变体的,且300mmolL–1山梨醇胁迫下,35S::ORF-WT转基因拟南芥种子的相对萌发率明显高于野生型的。在300mmolL–1山梨醇胁迫下,129B08/nced3突变体幼苗叶片高度黄化,根的形成和幼苗生长受到严重抑制,而A3p::ORF-B08转基因突变体与野生型相似,叶片仅轻度黄化,幼苗生长势良好;35S::ORF-WT转基因植株幼苗生长未受明显影响。这些结果说明,拟南芥129B08/nced3突变体对山梨醇诱导的非离子渗透胁迫有超敏性,异位表达花生AhNCED1基因能恢复该突变体对山梨醇的超敏性,提高拟南芥的耐渗透胁迫能力。     

转苦瓜几丁质酶基因McCHIT1水稻及其稻瘟病抗性

稻瘟病是危害水稻的最严重病害之一,探索利用外源基因提高水稻抗稻瘟病水平对现代育种具有重要意义。本研究从T₂代起逐代增加抗性选择压,采用苗期人工混合接种和病圃田自然诱发等鉴定方法,对转基因水稻后代进行稻瘟病抗性鉴定和筛选,在T₅代获得了7个稻瘟病抗性极显著增强的转McCHIT1基因水稻稳定株系。通过7个生理群26个生理小种的115个稻瘟病有效单孢菌株苗期抗谱测定,这7个株系的抗病频率为52.2%~61.4%,比受体对照缙恢35 (36.8%)高16个百分点以上,主要增加了对ZE群生理小种的抗性,提高了对ZG群、ZF群和优势种群ZB群生理小种的抗性。C36-2-1、C21-6-2、C21-3-1等3个株系的结实率达80%以上,是丰抗结合较好的转McCHIT1基因株系。McCHIT1基因具有广谱抗性,将其遗传转化水稻,采用“逐代增加选择压,抗中选抗”的方法,可筛选出稻瘟病抗性优良、抗谱明显拓宽、产量性状较好的转基因稳定株系。     

小麦NPR1-like基因的克隆及赤霉菌诱导下的表达分析

AtNPR1是拟南芥系统获得性抗病反应中的关键基因,对拟南芥的广谱抗性起重要调控作用。从赤霉菌诱导的小麦抗、感赤霉病近等基因系RNA差异表达谱中获得3个与AtNPR1类似的EST片段,据此检索相应序列信息并设计引物,采用RT-PCR方法从小麦中克隆得到3个cDNA全长序列,分别命名为TaNPR1、TaNPR2和TaNPR3,其开放阅读框分别编码580、607和601个氨基酸残基。序列分析表明,这3个小麦NPR1-like蛋白都含有保守的BTB/POZ、ANK和NPR1_like_C结构域及功能氨基酸,但仅TaNPR1具有2个对NPR1寡聚体形成十分必要的保守半胱氨酸残基。蛋白质聚类分析表明,TaNPR1与TaNPR2和TaNPR3的同源性均较低,其中TaNPR1与NPR1蛋白聚为一类,而TaNPR2和TaNPR3均与NPR1同源蛋白聚为一类。荧光定量PCR分析结果显示,TaNPR1、TaNPR2和TaNPR3基因都可被植物抗病相关信号分子水杨酸和茉莉酸甲酯诱导。与感病材料Apogee相比,抗病近等基因系Apogee73S2中TaNPR1和TaNPR3能够更早地响应赤霉菌的诱导并显著上调表达;而TaNPR2在感、抗材料中对赤霉菌侵染的响应都较为缓慢且变化不明显。这些结果表明,TaNPR1和TaNPR3可能在小麦对赤霉菌的防御反应中起重要作用。     

黄河流域田间棉铃虫对转Bt基因棉抗性监测

利用改进的单雌系F1/F2代法,对黄河流域主要棉区河南安阳县、河北威县、山东武城县的棉铃虫种群进行了系统监测。在2007-2009年,连续3年保守地估计了以上3个主要植棉县棉铃虫种群对Cry1Ac的抗性基因频率。结果表明,山东武城棉铃虫种群3年的抗性等位基因频率分别为0.00086、0.00097和0.00052;安阳田间棉铃虫种群2008和2009年抗性等位基因频率分别为0.00090和0.00103;河北威县的田间棉铃虫种群抗性等位基因频率为0。所有家系F1代和F2代的相对平均发育级别均值比较结果显示,山东武城县棉铃虫种群耐受性高于其它2个地区,其次为安阳县种群,威县种群敏感度最高。总之,我国黄河流域这3个主要棉区田间棉铃虫种群对Cry1Ac毒素还没有产生明显的抗性,抗性基因频率仍处于正常水平,但是棉铃虫对Cry1Ac毒素的耐受性有升高趋势,需要进一步加强全国性的监测工作。     

植物SWEET基因家族的相关研究进展

为了深入研究近年来新发现的一类糖转运蛋白SWEET基因家族在植物中的作用,本研究介绍了植物SWEET基因家族的发现,归纳总结了SWEET基因的蛋白质结构、进化分析结果和在植物中的生理功能。指出SWEET转运蛋白具有多种不同的生理功能,在植物生长发育及代谢活动中起了重要的作用。为后续在植物中研究SWEET基因家族提供一定的理论基础。     

过表达谷子液泡H~+-ATPase E亚基基因在拟南芥中的耐盐性

V-H+-ATPase在植物生长、发育和胁迫响应等生物学过程中发挥重要作用。本研究通过序列比对,从谷子中克隆到V-H+-ATPase E亚基基因Si VHA-E。进化树分析显示,Si VHA-E基因在进化上属于E1/E3亚族,与玉米V-H+-ATPase E亚基基因Zm VHA-EL亲缘关系较近。表达谱分析结果显示,Si VHA-E在高盐、茉莉酸甲酯(Me JA)、水杨酸(SA)和脱落酸(ABA)处理下表达上调,在低温和低氮处理下表达下调。亚细胞定位分析表明Si VHA-E定位于液泡膜上。遗传转化拟南芥的耐盐性鉴定表明,在盐处理条件下,转基因株系的种子萌发率、幼苗主根长、植株鲜重及存活率显著高于野生型的。与野生型拟南芥植株相比,Si VHA-E过表达植株体内Na+含量减少,体内相对含水量提高。此外,ABA萌发试验结果显示,在种子萌发后期,Si VHA-E过表达植株对ABA更加敏感。研究表明,谷子Si VHA-E可以显著提高拟南芥耐盐性,这可能与其正向调控ABA信号途径以及减少植株体内Na+积累和水分散失有关。     

甘蔗Na~+/H~+逆转运蛋白基因的克隆与表达分析

Na~+/H~+逆向转运蛋白基因SOS1(salt overly sensitive 1)是植物耐盐性的必需基因之一,在植物抵御盐胁迫过程中发挥十分重要的作用。本研究以小麦EST序列KJ563230为探针,利用电子克隆技术结合RT-PCR,获得一条甘蔗SOS1基因的cDNA序列,命名为ScSOS1(GenBank登录号为KT003285)。序列分析结果表明,该基因全长1403 bp,包含一个1272 bp的开放阅读框,编码423个氨基酸的蛋白质。ScSOS1蛋白的相对分子质量为47.6 kD,理论等电点(pI)为9.12。氨基酸序列分析表明,ScSOS1蛋白具有一个CAP-ED superfamily结构域。生物信息学预测显示,ScSOS1的编码蛋白为亲水性蛋白,不存在信号肽,二级结构元件多为无规则卷曲,主要参与中间代谢。实时荧光定量PCR分析表明,ScSOS1基因的表达具有组织特异性,在甘蔗叶鞘、蔗皮、蔗髓、侧芽和根中均有表达,其中在叶鞘中的表达量最高,根中的表达量最低。此外在NaCl、PEG、ABA、SA和MeJA的胁迫过程中,该基因表达均受到调控,其中受NaCl和PEG诱导后上调表达,均在24 h表达量达最高,分别约为对照组的1.5倍和4.0倍。推测该基因的表达与甘蔗耐盐性和抗渗透胁迫有关。     

青稞HvBADH1基因的克隆及其转化烟草的初步研究

应用RT-PCR结合RACE技术, 从青稞总RNA中扩增得长度为1 512 bp的甜菜碱醛脱氢酶(BADH)基因cDNA全长编码序列。通过氨基酸同源性比对, 发现该序列的推定表达产物与大麦BADH同工酶BBD2的同源性为98.4%, 而与小麦、玉米和水稻等禾本科作物的BADH同源性分别为97.0%、84.7%和85.1%。将克隆到的青稞cDNA序列命名为HvBADH1, 投递到GenBank, 获得收录号EF492983。HvBADH1可以在原核表达系统TB1-pMAL c2x中正常表达出分子量为54.2 kD的多肽链。将HvBADH1的编码ORF, 插入到添加了植物表达CaMV 35S启动子和Nos polyA终止子调控元件的植物表达载体pCAMBIA1301质粒相应的克隆位点中, 构建了HvBADH1基因的农杆菌植物转化系统LBA4404(pCAM-ba)。进而采用农杆菌介导法, 将HvBADH1基因导入烟草中, 对所获得的潮霉素抗性烟草株系进行PCR、Southern blot和RT-PCR等分子生物学检测, 结果表明, 在得到的2个转基因株系中, HvBADH1基因已整合到受体植物基因组中, 并且可以在mRNA水平上进行转录。     

从携带S5n基因的水稻种质中发掘San、Sbn和Scn基因

花粉不育是籼粳杂种F₁优势利用的主要障碍之一。包括S_a、S_b和S_c等至少6个基因座位内的等位基因互作会引起花粉不育,这些座位上的中性等位基因可以克服不育性。所以,发掘和利用中性等位基因具有重要意义。本文用携带S₅ⁿ的水稻种质,分别与台中65及其携带花粉不育基因的一套近等基因系杂交,组配具有单个座位互作和多个座位同时互作的杂种F₁,首先通过观察杂种F₁的花粉育性并比较相应杂种F₁育性的差异,初步判断是否具有中性等位基因,然后,采用与S_a、S_b和S_c座位紧密连锁的分子标记对F₂植株基因型的分离进行检测,并分析其分离比例的符合度,确定存在中性等位基因的真实性。结果发现在所鉴定的6份材料中有2份(灰背子和Madhukar)同时携带S_aⁿ和S_bⁿ,3份(饭毫皮、秕五升和粤泰B)携带S_bⁿ,1份(Jackson)携带S_cⁿ。这些材料同时携带可克服杂种F₁胚囊不育和花粉不育的基因,是克服籼粳杂种F₁不育性的重要基因来源。     

圆果黄麻纤维素合成酶基因CcCesA1的克隆、反义载体构建及转化拟南芥

以圆果黄麻(Corchorus capsularis L.) “179”茎部韧皮为材料,利用同源克隆和RACE技术,克隆黄麻纤维素合成酶基因CcCesA1 5¢端500 bp序列外的全部cDNA。其序列长度为2529 bp,编码627氨基酸残基,经Blast基因比对和蛋白质结构分析,确定是黄麻纤维素合成酶基因。半定量RT-PCR分析表明,CcCesA1在植株不同部位表达量具组织差异性,依次为茎部韧皮>根>叶>顶芽>麻骨。利用CcCesA1基因部分cDNA序列和3¢UTR区,构建黄麻CcCesA1基因反义载体,用测序验证的阳性质粒转化模式植物拟南芥。Southern结果表明,外源基因以单拷贝方式整合进入基因组,转基因拟南芥生长严重受阻,植株变得矮小且茎部易弯曲倒伏,角果数量变少,长度变短,纤维素含量有不同程度的降低,本研究结果表明,所克隆的黄麻CcCesA1基因除了参与植物其他生理代谢过程外,还参与纤维素的生物合成。     

蛋白激发子基因pemG1转化三生烟中及其对TMV抗性的提高

通过根癌农杆菌(Agrobactrium tumefaciens)介导转化法,将含有稻瘟菌蛋白激发子基因pemG1的植物表达载体pCAMBIA2300-Ubi-pemG1-Ocs转化三生烟(Nicotiana tobacum cv. Samsun NN),获得了转基因植株。用PCR检测抗卡那霉素烟苗确认阳性转化株,用Southern、Northern和Western杂交进一步证实了pemG1基因的整合、转录和表达。对T2代转基因阳性株进行烟草花叶病毒(Tobacco Mosaic Virus)接种试验。接种5 d后发现,与非转基因对照相比,表达pemG1的烟草叶片枯斑数量减少,表明稻瘟菌蛋白激发子基因pemG1的表达提高了转基因烟草对TMV的抗性。     

1BL/1RS易位对小麦贮藏蛋白组分含量和面团流变学特性的影响

利用1BL/1RS易位系后代研究1BL/1RS易位对贮藏蛋白组分含量和面团流变学特性的影响有助于指导小麦品质改良工作。选用师栾02-1/周麦16组合14份F6品系,于2012—2013年度分别种植在河南安阳和焦作,采用反相超高效液相色谱(RP-UPLC)和凝胶排阻超高效液相色谱(SE-UPLC)方法分析贮藏蛋白组分含量,并研究它们与面团流变学特性的关系。结果表明,拉伸仪延展性和最大抗延阻力、不溶性谷蛋白聚合体含量和谷蛋白、醇溶蛋白等贮藏蛋白组分含量及其比例均受1BL/1RS易位有无类别和类内品系效应的显著影响,以类内品系效应较大;拉伸仪拉伸面积、谷蛋白含量及醇溶蛋白与谷蛋白含量比值的类内品系效应显著且较大。易位系和非易位系的贮藏蛋白组分含量和面团流变学特性的相关系数达显著水平,在易位系中,不溶性谷蛋白聚合体含量和拉伸面积(r=0.92,P0.001)、延展性(r=0.92,P0.001)、最大抗延阻力(r=0.80,P0.01)呈显著正相关,面团流变学特性较好的品系不溶性谷蛋白聚合体含量均较高;在非易位系中,醇溶蛋白与谷蛋白含量比值和拉伸面积(r=?0.91,P0.001)、最大抗延阻力(r=?0.88,P0.001)呈显著负相关,面团流变学特性较好的品系醇溶蛋白与谷蛋白含量比值均较低。上述信息对以不溶性谷蛋白聚合体含量和醇溶蛋白与谷蛋白含量比值为指标改良1BL/1RS易位系的面筋品质有重要意义。     

Effect of 1-methylcyclopropene (1-MCP) on reducing postharvest decay in tomatoes (Solanum lycopersicum L.)

1-Methylcyclopropene (1-MCP as SmartFresh™ technology), an ethylene antagonist, was evaluated for affecting postharvest decay caused by Alternaria alternata, Botrytis cinerea, and Fusarium spp. on ‘Quality 23’ and ‘Seminis 35’ tomatoes at green or pink stages. Fruit with natural or artificial infection were subjected to 1-MCP at 0.0 μL L⁻¹, 0.6 μL L⁻¹ for 12 h, and 1.0 μL L⁻¹ for 6 h. After 31-42 d storage, disease incidence and severity of individual diseases in 1-MCP treated fruit was significantly reduced compared with that of the untreated controls, except in one inoculated test for ‘Quality 23’ where severity of Alternaria rot in 1.0 μL L⁻¹ treated fruit were significantly higher than that of the untreated control. Fruit treated with 1-MCP at 1.0 L⁻¹ for 6 h also had significantly higher incidence of Alternaria rot in the inoculated ‘Quality 23’ and in the non-inoculated ‘Seminis 35’ compared with the fruit treated with 1-MCP at 0.6 μL L⁻¹ for 12 h. The results of this study indicate that 1-MCP can reduce postharvest decay within a certain storage period.