油菜(Brassica napus)β-1,4-木糖基转移酶基因BnIRX14克隆、序列分析及亚细胞定位

糖基转移酶(Glycosyltransferase, GTs)广泛参与植物次生物质的代谢及生物和非生物胁迫,β-1,4-木糖基转移酶属于糖基转移酶GT43家族成员。为了探究油菜β-1,4-木糖基转移酶对油菜次生物质的代谢和逆境调控,利用5′RACE和3′RACE方法从甘蓝型油菜中扩增获得油菜β-1,4-木糖基转移酶基因 BnIRX14全长cDNA,该cDNA具有1 566 bp的完整开放阅读框,编码522个氨基酸,分子质量约58.92 ku,由8 315个原子组成,分子式为C₂₆₃₁H₄₁₆₈N₇₄₂O₇₅₃S₂₁,具有多个磷酸化位点和糖基化修饰位点,属非分泌性单次跨膜蛋白。结构域分析表明,BnIRX14具有GTs家族保守的DxD保守结构域和UGT糖基转移酶PSPG特征结构域,属于糖基转移酶GT43家族成员。BiFC亚细胞定位初步显示BnIRX14定位于细胞质中,蛋白互作预测表明BnIRX14与各类糖合成和转运蛋白高度互作。结构域预测和互作分析初步表明,BnIRX14属于油菜糖...     

酵母双杂交筛选小麦TaMBD2互作蛋白

为探讨小麦甲基结合域蛋白(TaMBD2)在植物生长发育过程中的调控功能,以TaMBD2基因的全长cDNA为模板,构建诱饵载体pGBKT7-TaMBD2,利用酵母双杂交系统从小麦cDNA文库中筛选TaMBD2互作蛋白。结果共筛选到91个菌斑显蓝色的克隆,对其进行菌液PCR检测并测序,然后在NCBI上进行BLAST比对分析,共获得8个可能与TaMBD2互作的蛋白,分别为二磷酸核苷激酶(NDPK)、ENTH结构域蛋白、SIAN蛋白、Agenet结构域蛋白、C2H2型锌指蛋白、磷酸激酶和2个假定蛋白,其中最有可能的TaMBD2互作蛋白为NDPK。这些候选蛋白主要参与细胞信号传导、抗逆、能量代谢和蛋白质运输等。其中,检测结果中参与植物抗逆胁迫的蛋白质为主要互作蛋白,所占比例为54.9%;参与蛋白质运输的互作蛋白所占比例为25.3%,其余互作蛋白所占比例较小。因此,推测TaMBD2可能主要参与植物对干旱、低温和高盐等非生物胁迫逆境的响应及调控。     

玉米2个光敏色素A基因的克隆、蛋白结构与光诱导表达模式

【目的】分析玉米2个光敏色素A基因(ZmPhyA1和ZmPhyA2)的蛋白结构及可能存在的功能区段,明确其响应于不同光线处理的表达模式。【方法】通过RT-PCR方法获得ZmPhyA1和ZmPhyA2编码的完整cDNA序列,推断2个基因编码蛋白的保守结构域,利用酵母双杂交测试其结构域间的物理互作,利用半定量RT-PCR技术分析不同光处理条件下ZmPhyA1和ZmPhyA2的表达模式。【结果】遗传进化树分析表明,ZmPHYA2与高粱光敏色素A的遗传关系要比与ZmPHYA1更近。ZmPHYA1与ZmPHYA2蛋白中含有1个GAF结构域、1个Phytochrome结构域、2个PAS结构域、1个HisKinaseA结构域和1个类似组氨酸激酶的ATP激酶结构。ZmPHYA1与ZmPHYA2自身和相互之间可以通过其C端539个氨基酸区段进行相互作用。ZmPhyA1和ZmPhyA2在黑暗、远红光和蓝光条件下表达量较高,在红光和白光条件下较低,并且前者的表达量均低于后者。【结论】ZmPHYA1与ZmPHYA2蛋白是2个具有功能的光受体蛋白,自身和相互之间可能通过C端539个氨基酸区段互作形成复合体,二者的表达水平受不同光质的调控。     

紫云英结瘤受体激酶靶蛋白的筛选与鉴定

利用酵母双杂交技术,以结瘤受体激酶(NORK)蛋白的跨膜结构域(TM)为诱饵,进行了与其相互作用靶蛋白的筛选鉴定.结果获得41个候选阳性克隆,通过测序和在NCBI中进行Blast比对分析,发现其中一个具有重要生物学功能的互作蛋白翻译延伸因子AsEF1-α,并将该蛋白相应的编码基因命名为AsEF1-α.进一步的验证表明靶蛋白AsEF1-α与诱饵互作的关键结构域是EF1-α-Ⅲ.     

不结球白菜开花基因BcFT的亚细胞定位及其互作蛋白的筛选

[目的]开花基因FT是开花通路下游关键基因。本文旨在研究不结球白菜BcFT的亚细胞定位及互作蛋白的筛选,深入了解不结球白菜BcFT的功能及其调控机制。[方法]构建亚细胞定位载体p EZS-NL-BcFT,利用亚细胞定位技术研究BcFT的空间表达。通过酵母双杂交技术筛选与BcFT互作的蛋白,构建酵母双杂交诱饵载体p GBKT7-BcFT,转化酵母Y2H Gold菌株,验证自激活性和自毒性。对不结球白菜酵母双杂交c DNA文库进行筛选,得到与BcFT互作的片段,并根据基因片段进行比对,以不结球白菜c DNA为模板进行基因全长克隆,构建p GADT7载体,进行共转化验证,最后对筛选得到的2个蛋白进行生物信息学分析。[结果]BcFT蛋白在整个细胞中均有分布。诱饵载体p GBKT7-BcFT表达产物对酵母细胞无自激活性和自毒性,通过酵母双杂交及共转验证得到2个与BcFT互作的蛋白:Bc PPD5和Bc VHA-E1。生物信息学分析预测这2个蛋白均为亲水性蛋白,不含信号肽,Bc PPD5蛋白的氨基酸序列存在1个跨膜区,二级结构中不规则卷曲所占比例最大,第163和296氨基酸残基之间存在1个Psb P结构域;Bc VHA-E1蛋白无跨膜区,二级结构中α螺旋所占比例最大,无特定结构域。[结论]确定了BcFT蛋白在整个细胞中均有表达。利用酵母双杂交技术筛选得到2个与BcFT互作蛋白,进一步分析发现其可能通过光周期路径影响开花。     

稻瘟病菌无毒效应因子Avr-PikD与水稻蛋白OsDjA9的互作鉴定

【目的】对从水稻cDNA文库中筛选出的一个候选互作蛋白OsDjA9与Avr-PikD的互作关系进行鉴定,以期获得稻瘟病菌无毒效应因子Avr-PikD的水稻靶标。【方法】通过酵母双杂交、pull-down、Co-IP、荧光素酶互补成像试验及水稻原生质体中的共定位分析来验证Avr-PikD与OsDjA9的互作关系,并进一步借助酵母双杂交鉴定OsDjA9中参与互作的关键结构域。【结果】Avr-PikD在体外及体内条件下均能与OsDjA9发生相互作用,且OsDjA9所含DnaJ结构域是其与Avr-PikD互作所必需的。【结论】在稻瘟病菌侵染水稻的过程中,水稻OsDjA9蛋白是稻瘟病菌无毒效应因子Avr-PikD的一个作用靶标。     

巴西橡胶树锌指蛋白基因的克隆及功能鉴定

锌指蛋白是一类能与DNA/RNA结合并调控基因表达的蛋白。前期笔者通过酵母双杂技术筛选到1个可能与JAZ蛋白互作的巴西橡胶树锌指蛋白(命名为Hbzinc-finger),该基因的c DNA全长序列有2 262bp,编码753个氨基酸。该蛋白碳末端有1个PB1结构域,在336~381处氨基酸序列编码1个Zn F_ZZ锌离子结合结构域。红色荧光蛋白亚细胞定位结果表明,Hbzinc-finger定位于细胞核,酵母自转录激活显示该蛋白有自转录活性。该基因的表达受创伤影响,表明橡胶锌指蛋白的表达可能受茉莉酸信号调控。     

核桃炭疽病菌中GH互作蛋白找寻及遗传关系分析

【目的】植物病原真菌中的糖苷水解酶(GH)是参与破坏植物细胞壁的重要酶类,在真菌致病过程中发挥着重要作用。了解核桃炭疽病菌中GH蛋白的互作蛋白及其遗传关系,可为深入研究该病菌中GH家族蛋白的协同作用机制提供参考。【方法】基于前期所获得的胶孢炭疽菌Cg1中20个GH蛋白,通过STRING网络在线分析与其相似性较高的两个炭疽菌种——胶孢炭疽菌Cg-14和果生炭疽菌Nara gc5相关蛋白的互作关系;同时,利用生物信息学分析工具对这些蛋白进行了分子对接、亚细胞定位及遗传关系分析。【结果】两个炭疽菌菌株GH蛋白的互作情况极为相似。其中：GH5的互作蛋白数量最多,且GH5、GH6、GH7、GH11之间均存在明显互作关系;GH28亚家族中两个蛋白之间互作但不与其他GH亚家族蛋白互作;与单独GH蛋白存在互作关系的其他类蛋白多参与多糖催化、碳水化合物代谢等过程。不同蛋白之间均存在多个相互作用的氨基酸位点;仅GH72亚家族中的3个蛋白定位于质膜,其余蛋白均定位于细胞外;胶孢炭疽菌Cg1、Cg-14以及果生炭疽菌Nara gc5中GH蛋白明显分为四大类。其中：GH43亚家族中的3个蛋白分属于不同分支,亲缘...     

抑制OsPUT5基因表达降低水稻低温抗性

为研究水稻(Oryza sativa)多胺转运蛋白(polyamine uptake transporters, PUT)的功能，利用生物信息学方法对水稻中OsPUT家族成员进行鉴定，并对OsPUT5蛋白结构进行分析，采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测OsPUT5基因在水稻不同组织中的表达情况，最后利用水稻超表达(overexpress, OE)株系、日本晴(Nipponbare,Nip)株系和RNAi株系初步研究OsPUT5基因的功能。结果表明，水稻中含有6个OsPUT,其中OsPUT5是一种含有10个跨膜结构域，且N端和C端均位于细胞膜外，并具有腐胺-鸟氨酸逆向转运蛋白PotE特有结构域的膜蛋白。基因表达模式显示，OsPUT5基因在叶片中表达量最高，在根、茎和花中无显著差异(P>0.05)。在生命周期内，正常条件下，OE株系、Nip株系和RNAi株系无明显的表型差异。在水稻幼苗期，4℃处理30 h后，RNAi株系、Nip株系和OE株系的相对电导率、丙二醛含量和脯氨酸含量均显著(P<0.05)升高，且表型都受到一定程度的影响。与Nip株系和OE株系相比，RNAi...     

水稻OsZFP互作蛋白的筛选与鉴定

CCHC型锌指结构蛋白Os ZFP参与调控水稻Oryza sativa侧根的生长发育,但其相关互作蛋白及调控机制未知。以水稻‘日本晴’‘Nipponbare’为试验材料,克隆了Os ZFP基因,利用Eco RI和Sal I酶切位点构建酵母双杂交钓饵表达载体p GBKT7+Os ZFP,验证该表达载体对酵母菌株Y2H无毒性及报告基因自激活现象;采用酵母双杂交技术,从已构建的水稻c DNA文库中筛选到1个阳性互作蛋白,经美国国家生物技术信息中心数据库(NCBI)同源性比对,鉴定为含有T-complex polypeptide 1(TCP-1)结构域的分子伴侣蛋白第7个亚基(Os06g0687700),命名为chaperonin containing TCP-1 eta subunit(CCT-eta),进而通过酵母一对一回复验证该互作蛋白。基于CCT-eta亚基与Os ZFP蛋白互作,推测分子伴侣蛋白亚基CCT-eta可能参与调控水稻侧根的生长发育。     

多酚-肌原纤维蛋白互作对蛋白的影响

肌原纤维蛋白是组成肌肉纤维蛋白的其中一种,肌原纤维蛋白的空间结构,蛋白的氧化性、凝胶性、乳化性等功能特性对肉制品的品质有十分重要的影响。在日常生活中,蛋白质氧化是一种常见的现象,这一现象以前没有得到很好的认识,很大程度上被忽视但现在更好了,据了解,这是一个复杂的化学过程,比如我们经常在生活中发现肉储存久了,颜色会由鲜红色变成棕褐色,这就是蛋白质氧化的导致的。所以,在肉制品中加入合适的抗氧化剂来防止肉制品的氧化变质是非常重要的,也是现在科研正在积极探索的方向。据对食品蛋白质氧化的研究发现,茶多酚它具有极强的清除有害自由基的能力,可以有效的防止肉制品的颜色发生变化,延长了肉制品的保质期,故茶多酚是目前发现的一种可理想的运用在肉制品的天然抗氧化剂之一。这篇文章综述了近些年来国内外关于茶多酚与蛋白的相互作用方式,研究了茶多酚与肌原纤维蛋白相互作用的作用机理,及在肉制品中加入多酚后,多酚与肌原纤维蛋白形互作对蛋白质性能的影响。     

Phosphate-induced protein chromatography

High phosphate concentration is shown to cause a large proportion of the proteins of a cell-free extract of Escherichia coli to bind to agarose columns to which L-valine is attached. With a decreasing concentration gradient of potassium phosphate, the proteins elute in relation to their solubility in concentrated ammonium sulfate. This column technique appears to provide a general tool for the purification of proteins.     

Self-assembling protein microarrays

Protein microarrays provide a powerful tool for the study of protein function. However, they are not widely used, in part because of the challenges in producing proteins to spot on the arrays. We generated protein microarrays by printing complementary DNAs onto glass slides and then translating target proteins with mammalian reticulocyte lysate. Epitope tags fused to the proteins allowed them to be immobilized in situ. This obviated the need to purify proteins, avoided protein stability problems during storage, and captured sufficient protein for functional studies. We used the technology to map pairwise interactions among 29 human DNA replication initiation proteins, recapitulate the regulation of Cdt1 binding to select replication proteins, and map its geminin-binding domain.