黑核桃体细胞胚状体发生及其基因转化系统的建立

以我国种植的优良品种黑核桃 (JuglansnigiaL .)幼胚和幼叶为外植体诱导出体细胞胚状体 ,通过根癌农杆菌介导将nptⅡ和gus基因导入体细胞胚 ,同时研究了激素、体细胞胚的发育时期及预培养等对转化率的影响 ,建立了黑核桃体细胞胚基因转化系统 ,还分析了体细胞胚胎转化系统的特点和潜力。     

根癌农杆菌介导的‘魏可’葡萄遗传转化体系的优化

以‘魏可’葡萄离体叶片为外植体,利用植物表达载体上含有卡那霉素抗性基因(nptⅡ)的根癌农杆菌LBA4404(pCAMBIA2301)对影响‘魏可’葡萄遗传转化效率的因素进行系统研究。结果表明,最佳农杆菌介导‘魏可’葡萄遗传转化体系为农杆菌侵染4 min,共培养3 d,卡那霉素质量浓度5 mg·L-1,羧苄青霉素质量浓度200 mg·L-1。采用此体系对‘魏可’葡萄进行转化,共获得9株抗性苗。利用GUS组织化学染色、PCR扩增的方法检测,结果表明,有4株通过了PCR检测,1株通过了RT-PCR检测,初步证明nptⅡ基因已经整合进入‘魏可’葡萄基因组中。将PCR产物回收,经测序验证nptⅡ基因完全整合进入‘魏可’葡萄基因组中。对CK及经PCR检测呈阳性的株系进行卡那霉素抗性鉴定,发现PCR呈阳性的株系均比CK抗Kan的能力明显增强。     

黑核桃体细胞胚状体发生及其基因转化系统

以我国种植的优良品种黑核桃（Ｊｕｇｌａｎｓ ｎｉｇｉａ Ｌ．）幼胚和幼叶为外植体诱导出体细胞胚状体，通过根癌农杆菌介导将ｎｐｔⅡ和ｇｕｓ基因导入细胞胚，同时研究了激素、体细胞胚的发育时期及预培养等对转化率的影响，建立了黑核桃体细胞胚基因转化系统，还分析了体细胞胚胎转化系统的特点和潜力。     

农杆菌介导西瓜转葡聚糖酶及几丁质酶双基因

采用根癌农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)介导法将含有葡聚糖酶基因和几丁质酶基因表达载体遗传转化西瓜(Citrulluslanatus),遗传转化体系为以子叶为外植体经过组织培养获得再生植株。结果表明,Kan抗性芽的分化率随着共培养时间的延长先上升后下降,GUS阳性芽的百分率逐渐升高,共培养时间30h后,GUS阳性芽的百分率趋于平稳,同时,通过对候选转基因植株中GUS基因染色鉴定、卡那基因、葡聚糖酶基因及几丁质酶基因特异引物PCR检测,表明葡聚糖酶和几丁质酶基因已成功导入西瓜植株中,转基因植株的表现在进一步研究中。     

转rol基因枳橙分子鉴定及部分生物学的观测

 对转rol基因枳橙B、D、E 3个系及对照田间高接植株进行了PCR分子鉴定、RT-PCR转基因表达分析和生物学特征的观测。PCR分析表明rolA、rolB、rolC已成功转入到3个转化枳橙系中。利用RT-PCR在田间转化植株中只检测到nptⅡ和rolC基因的表达, 而rolA、rolB基因未检测到。3个转化系枳橙均表现出顶端优势减弱, 侧枝增多, 植株矮化性状明显, 高度只有对照植株的44% ～50% , 节间长度缩短,叶面积减少; 光合作用增强; 内源赤霉素、生长素、玉米素等促进类激素在中部、下部叶片含量均高于对照, 这可能是诱导上述形态特征的变化的因素之一。     

芜菁花叶病毒CP基因反向重复植物表达载体的构建及遗传转化

 针对芜菁花叶病毒外壳蛋白基因构建反向重复表达载体,利用农杆菌介导法将其导入四九菜心,PCR检测共获得13个阳性转化株,遗传转化效率为2%。     

薄壳山核桃赤霉素氧化酶基因CiGA2ox1克隆与功能分析

【目的】从薄壳山核桃（Carya illinoinensis）中分离克隆赤霉素氧化酶CiGA2ox1基因,通过遗传转化及功能验证研究该基因对薄壳山核桃生长发育的影响,为薄壳山核桃新品种选育提供理论参考。【方法】采用PCR扩增技术从薄壳山核桃体胚中克隆出CiGA2ox1基因全长序列,分析其序列和表达特性。通过亚细胞定位观察其在烟草中发挥功能的场所。构建35S::CiGA2ox1::GFP过表达载体,利用农杆菌介导法将35S::CiGA2ox1::GFP过表达载体转化到薄壳山核桃体胚中,获得CiGA2ox1过表达株系。通过qRT-PCR方法分析转基因薄壳山核桃中相关基因的表达水平,采用丙酮乙醇提取方法测定再生植株中叶绿素含量。【结果】薄壳山核桃CiGA2ox1基因全长1053 bp,编码350个氨基酸。CiGA2ox1蛋白含有1个2OG-FeⅡ-Oxy保守结构域和3个Fe2+结合位点。序列系统进化分类结果表明,CiGA2ox1基因与核桃JrGA2ox1基因亲缘关系最近。烟草叶片亚细胞定位显示,CiGA2ox1蛋白定位于细胞核和细胞膜中。对薄壳山核桃进行遗传转化后经荧光检测及PCR验证表明,...     

标记基因nptⅡ在转基因苹果嫁接砧穗间无相互传导

 以携带外源新霉素磷酸转移酶基因( nptⅡ基因) 苹果品种嘎拉、未进行基因转化的普通型嘎拉和苹果砧木M26组培苗为试材, 通过试管微嫁接方法, 对其体内所含外源nptⅡ基因在砧穗中的传导性进行了研究。结果表明, 外源nptⅡ基因只在转化植株体内表达, 不通过嫁接在接穗和砧木间进行传导。     

转chit42基因柠檬的分子鉴定及抗炭疽病研究

以转chit42基因柠檬为试材,对其进行了分子鉴定和抗炭疽病研究。用PCR和Southern杂交证实外源基因chit42已经整合到转化植株基因组中,chit42基因在转基因柠檬SR23株系中为3个拷贝,在SR24株系中为2个拷贝。对转基因柠檬进行离体和活体抗炭疽病试验表明转基因柠檬抗炭疽病能力得到明显提高。利用半定量RT-PCR技术检测chit42基因在柠檬中的表达,结果表明用炭疽病病菌接种处理24h后,chit42基因表达量开始增加;接种48h后,chit42基因表达量进一步明显增大;接种72h后,表达量开始有所下降,但仍然高于正常情况下chit42基因的表达量。     

番木瓜胚性细胞悬浮系高效遗传转化体系的建立

【目的】建立番木瓜高效遗传转化体系，为番木瓜基因功能研究和重要农艺性状改良提供新的技术支撑。【方法】以紫晖番木瓜胚性细胞悬浮系（embryogenic cell suspensions,ECS）为遗传转化受体，利用植物表达载体pCAMBIA1301和农杆菌介导法进行遗传转化，对抗生素浓度筛选、侵染时间、继代培养、抗性胚的诱导与萌发以及植株再生整个过程进行探索，最后获得抗性再生植株。【结果】通过设置不同浓度的头孢霉素和潮霉素处理，观察ECS细胞状态，筛选、确定头孢霉素和潮霉素最适处理质量浓度分别为200 mg·L-1和5 mg·L-1。工程菌和ECS共培养侵染2 d后转到含有头孢霉素和潮霉素的液体筛选培养基上进行继代培养，继代周期为14 d。经GUS染色验证，表明继代3次后的ECS几乎全部为转化细胞。将以上ECS转移到液体胚诱导培养基中进行培养，2个月后可获得大量球形体细胞胚，且GUS组织染色为蓝色。将球形体细胞胚转到半固体成熟培养基上培养，2个月后可获得成熟子叶期体细胞胚。子叶期体细胞胚在萌发培养基上光培养30 d后，可获得再生芽。任意选取再生芽进行GUS染色，均可染成蓝色。抗性再生芽...     

山核桃赤霉素氧化酶基因CcGA3ox的克隆和功能分析

[目的]赤霉素3-氧化酶(gibberellin 3-oxidases,GA3ox)是赤霉素(GAs)生物合成途径中关键酶之一,对山核桃(Carya cathayensis)中CcGA3ox基因进行克隆,并进行序列分析和功能验证.[方法]以山核桃体细胞胚为材料,提取RNA,采用PCR扩增技术,克隆山核桃CcGA3ox基...     

农杆菌介导法将小麦γ-硫堇蛋白基因转入厚皮甜瓜

以厚皮甜瓜鲁厚甜2号为材料,在绿色叶肉组织特异表达启动子PNZIP驱动下,利用农杆菌介导的遗传转化系统,将小麦抗真菌γ-硫堇蛋白（γ-Thionin）基因（THI）导入甜瓜,获得卡那霉素抗性植株。转化植株经PCR和Northern blot检测分析,证实γ-硫堇蛋白基因已经转入甜瓜基因组中并在甜瓜叶片组织中表达     

利用沙冬青抗寒基因AmEBP1 转化杏的研究

 利用花粉管导入法,将沙冬青抗寒基因AmEBP1 转化到‘大果’杏幼胚中,在改良WPM 培 养基上经卡那霉素筛选,PCR、Southern 检测,结果得到5 个转基因阳性株系;组培苗抗寒试验结果表明, 相同低温（–4 和–8 ℃）条件下,转基因植株均比对照表现出较高的成活率;随着处理温度的降低,转 基因株系REC 与MDA 含量始终低于对照植株;转基因植株的低温半致死温度（LT50）比未转基因对照 低2.13 ℃。试验结果表明导入的AmEBP1 基因提高了‘大果’杏的抗寒性。     

Somatic embryogenesis and Agrobacterium-mediated transformation of Japanese apricot (Prunus mume) using immature cotyledons

This study describes a successful method of somatic embryogenesis and genetic transformation using immature cotyledons of Prunus mume. Immature cotyledons from four different developmental stages of eight different P. mume cultivars were used for the experiments to optimize somatic embryogenesis and genetic transformation protocols. Somatic embryogenesis was induced when the explants were cultured on somatic embryo inducing medium consisting of MS basic medium supplemented with 1 μM 2,4-dichlorophenoxyacetic acid (2,4-D) and 1 μM 6-benzyladenine (BA). They were cultured for 30 days and then transferred to somatic embryo propagation medium containing 0.1 μM α-naphthaleneacetic acid (NAA) and 5 μM BA. It appeared that the developmental stage of the immature cotyledons used as explants was the most important factor for somatic embryogenesis; higher frequencies of somatic embryogenesis were observed when the immature cotyledons were less than 5 mm in length regardless of cultivars. For genetic transformation, the immature cotyledons were inoculated with Agrobacterium tumefaciens EHA101 harbouring a binary plasmid vector with neomycin phosphotransferase II and an intron-interrupted β-glucuronidase gene under the control of cauliflower mosaic virus 35S promoter, and three transgenic plant lines were obtained from inoculated “Sirakaga” immature cotyledons. Transgenic somatic embryos and shoots were selected using 25 mg l⁻¹ kanamycin. Integration of transgenes in the genome of GUS-positive putative transgenic shoots was confirmed by PCR and Southern blot analyses.     

香蕉凝集素基因双启动子表达

为了获得香蕉果实特异表达的强启动子,利用PCR方法将2个凝集素(BanLec)基因启动子串联在一起,置换植物表达载体pBI121上的35S启动子,构建BanLec基因双启动子携带gus植物表达载体pBIL3,用基因枪转化香蕉叶片、根系和果实薄片,瞬时表达结果显示BanLec基因串连的双启动子依然表现为果实特异性表达,而且表达量明显高于BanLec基因单启动子及35S启动子,证明该串连的双启动子是一个在香蕉果实中特异表达且表达量较高的强启动子。     

Somatic embryogenesis of Limonium sinense: a study on the regeneration efficacy via direct and indirect approach followed by Agrobacterium-mediated genetic transformation

An efficient indirect somatic embryogenesis and Agrobacterium-mediated transformation protocol for Limonium sinense has been established, wherein neomycin phosphotransferase II (npt II) and β-glucuronidase (GUS) genes were used as selectable and screenable markers, respectively. The efficiency of plantlet regeneration from transformed tissue was compared between direct embryogenesis from leaf and indirect embryogenesis from callus. Embryogenic callus (EC) was initiated from leaf explants on MS medium supplemented with 6.7 μM 2,4-D and 2.22 μM BA. The somatic embryos were induced, matured, and germinated when ECs were transferred onto MS medium supplemented with 4.44 μM BA and 1.07 μM NAA. Agrobacterium tumefaciens strain LBA 4404 containing the vector pBI121 was used for the transformation. Transient GUS expression frequency was evaluated and putative transgenic plants were successfully grown on culture medium in presence of kanamycin (80–100 mg L^?1). PCR analysis of putative transgenic plants confirmed the presence of GUS and nptII genes. The transformation efficiency obtained through indirect embryogenesis from calluses (4%) was much higher than through direct embryogenesis from leaf explants (0.9%).     

甜瓜CmACOⅠ启动子组织特异性表达研究

 为进一步明确甜瓜果实软化的分子机理,构建了ACC氧化酶Ⅰ基因（CmACOⅠ）启动子与GUS基因融合的植物表达载体,采用根癌农杆菌介导法转化甜瓜‘甘甜一号’。通过卡那霉素抗性和 PCR检测筛选呈阳性的转化植株,取不同组织进行X-Gluc染色。结果表明,转化植株的根、茎、叶、花、果实等器官组织经X-Gluc染色后,只在花药组织和成熟果果皮中出现蓝色斑点,其余组织均未检出,表明甜瓜CmACOⅠ启动子能够驱动GUS基因在转基因甜瓜花药和成熟果果皮中特异表达。