饲料中不同类型的硒对仿刺参幼参生长和免疫指标的影响

在水温为13.0~20.0℃、盐度为31.0~32.0和pH为7.5的条件下,将初始体质量为5.36~5.57 g的仿刺参Apostichopus japonicus幼参放养在塑料水槽中（40 L）,每箱15头,分别投喂在基础饲料中添加0.4 mg/kg硒粉、富硒酵母、蛋氨酸硒和亚硒酸钠的试验饲料,以未添加硒的基础饲料作为对照组,每个试验组设3个重复。60 d的饲养结果表明：摄食添加硒饲料的仿刺参的增重率、体壁的粗蛋白含量和对饲料中粗蛋白的表观消化率均显著高于对照组（P〈0.05）,其中摄食添加蛋氨酸硒一组的仿刺参增重最大,摄食添加富硒酵母的次之;摄食添加硒饲料的仿刺参体腔液中超氧化物岐化酶（SOD）和过氧化氢酶（CAT）的活性均高于对照组,但差异不显著（P〉0.05）,而摄食添加酵母硒组的仿刺参体腔液中酸性磷酸酶（ACP）的活性显著高于对照组（P〈0.05）。饲料硒能促进仿刺参的生长,可能与提高饲料蛋白质的消化率有关;饲料硒能提高仿刺参的成活,可能与提高体腔中SOD、CAT和ACP的活性有关。试验表明,饲料中的有机硒能促进仿刺参对饲料蛋白质的消化和积累,进而促进其生长的效果优于无机硒。     

仿刺参过氧化氢酶基因全长cDNA的克隆及表达分析

研究仿刺参（Apostichopus japonicus）免疫相关基因的功能和作用机制可为仿刺参养殖病害的防控提供科学依据。克隆了仿刺参过氧化氢酶（catalase）基因的全长cDNA序列,全长1 885 bp,其中5′\|非翻译区（5′\|untranslated region,UTR）长76 bp,3′\|UTR长306 bp,开放阅读框（open reading frame,ORF）1 503 bp,编码500个氨基酸,预测蛋白分子量为56.56 kDa。氨基酸序列比对结果显示,仿刺参Catalase与三角帆蚌（Hyriopsis cumingii）和紫海胆（Strongylocentrotus purpuratus）的相似度最高,为75%。仿刺参catalase cDNA推导的氨基酸序列具有过氧化物酶定位信号PTS2、与还原型辅酶Ⅱ(NADPH) 结合的氨基酸残基及与其它物种高度保守的Catalase近端血红素配体签名序列（351RLFSYSDTH359）。系统进化分析显示仿刺参处于无脊椎动物分支中,和紫海胆位于同一小支上。实时定量PCR结果显示,catalase mRNA在仿刺参肠、体壁、肌肉、呼吸树、体腔细胞和管足中均有表达,在肠中表达量最高。在细菌脂多糖LPS刺激后4 h,体腔细胞中catalase mRNA表达量显著升高,表明仿刺参的catalase基因在应对外来病原菌刺激的免疫应答中发挥了重要作用。     

饲料中添加蛋氨酸硒对仿刺参幼参存活、生长及免疫指标的影响

在水温为14.0～8.0℃、盐度为31～32和pH为7.5的条件下,将初始体质量为1.30～1.68 g的仿刺参Apostichopus japonicus幼参饲养在塑料水槽（40 L）中,投喂蛋氨酸硒添加量分别为0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/kg的饲料60 d,每种饲料设3个重复,每个重复组放15头仿刺参。试验结束后饥饿24h,测定仿刺参体质量的特定生长率（SGR）,体腔液中过氧化氢酶（SOD）、超氧化物歧化酶（CAT）、酸性磷酸酶（ACP）的活力,体壁干物质和肠干物质中硒的含量。结果表明：各组仿刺参的成活率为100%;当蛋氨酸硒添加量为0.6 mg/kg时,仿刺参幼参的SGR最大,且显著高于对照组（P〈0.05）,当硒添加量为1.0 mg/kg时,仿刺参幼参的SGR值最小;当硒添加量为0.6 mg/kg时,仿刺参对饲料干物质和粗蛋白的表观消化率最高,且显著高于对照组（P〈0.05）;各试验组仿刺参体壁干物质中蛋白质含量均显著高于对照组（P〈0.05）,且当硒添加量为0.4 mg/kg时,蛋白质含量最高;当硒添加量为0.6 mg/kg时,幼参肠中的硒含量最高,且显著高于对照组（P〈0.05）,但当硒添加量为0.4 mg/kg时,幼参体壁中的硒含量最高,其次为0.6 mg/kg硒组;除硒添加量为1.0 mg/kg外,各试验组仿刺参体腔液中的SOD、CAT值均显著高于对照组（P〈0.05）,添加量分别为0.8 mg/kg和0.4 mg/kg时达到最高,其次是0.6 mg/kg组;各试验组仿刺参ACP的活性均显著高于对照组（P〈0.05）,硒添加量为0.4 mg/kg时达到最高。研究表明,仿刺参幼参饲料中蛋氨酸硒的适宜添加量为0.4～0.6 mg/kg。     

饲料中β-胡萝卜素和虾青素添加量对仿刺参幼参生长及抗氧化能力的影响

在水温11．0～20．0℃、盐度35、pH7．5的实验室条件下,将初始平均体质量为3．89g的仿刺参Apostichopusjaponicus幼参放养在60L的塑料水槽中,投喂添加30、60、90mg／kg β-胡萝卜素和虾青素的饲料,分别记为A、B、C、D、E、F组,以不添加此物质的基础饲料作为对照（G组）,每组设3个重复,饲养80d后测定幼参的生长和几种抗氧化酶的活性。结果表明：摄食添加β-胡萝卜素的饲料时,仿刺参的特定生长率随添加量的增加而升高,A、B、C组分别比对照组提高6．67％、73．33％和100．0％,但仅C组与对照组差异显著（P〈0．05）;摄食添加60mg／kg和90mg／kg虾青素的饲料时,仿刺参的特定生长率比对照组提高113．33％和66．67％,但仅E组与对照组差异显著（P〈0．05）;试验组仿刺参体腔液中的总抗氧化能力（T-AOC）随饲料中β-胡萝卜素和虾青素含量的增加而升高,除A、B组外其余各试验组均显著高于对照组（P〈0．05）,饲料中添加虾青素的各组仿刺参体腔液的平均总抗氧化能力（12．77U／mL）比添加β-胡萝卜素的各组平均值（8．77U／mL）高45．61％,表明虾青素的抗氧化能力高于β-胡萝卜素;C、E、F组仿刺参体腔液中的SOD和CAT活性均显著低于对照组（P〈0．05）,而A、B、D组与对照组差异不显著（P〉0．05）;试验组仿刺参肠道蛋白酶和淀粉酶活力及体壁成分较对照组均无显著差异（P〉0．05）。     

仿刺参体腔细胞吞噬与凝集功能及其与温度的关系

采用光镜和电镜技术研究了仿刺参Apostichopus japonicus体腔细胞的吞噬和凝集功能及其与温度的关系。结果表明：仿刺参体腔细胞中球形细胞和变形细胞具有较强的吞噬功能,当异物的大小、性质不同时,其吞噬过程和吞噬能力存在一定差异。当体腔细胞吞噬洋红颗粒时,试验进行6h其吞噬率最高（48．01％）,108h时吞噬过程结束;当体腔细胞吞噬酵母时,试验进行4h其吞噬率最高（35．17％）,且体腔细胞的凝集现象较多,到96h时吞噬过程结束。仿刺参体腔细胞的吞噬能力与温度关系密切,18℃下吞噬百分率和吞噬指数最高,12℃下次之,4℃和25℃下最低。仿刺参离体的体腔细胞很快发生凝集反应,且温度和异物刺激都会影响体腔细胞的凝集作用时间和强序．     

仿刺参体壁再生形态学和组织学的研究

用手术刀片切掉仿刺参体壁表皮层和结缔组织层,深度至体腔膜。术后将仿刺参放入正常海水中饲养,用肉眼和光学显微镜观察仿刺参体壁再生的外部形态和组织学变化,并通过免疫荧光方法检测小鼠抗人角蛋白19（CK19）的表达。形态学观察表明：术后1 d,伤口呈凹陷状,体腔膜上增生出一薄层乳白色结缔组织;术后7 d伤口表面出现色素;术后11 d凹陷基本变平;术后21 d,伤口处体壁形态与颜色恢复至术前。组织学观察表明：术后1 d,疏松结缔组织直接暴露,创伤面附近有成纤维细胞和胶原纤维聚集;术后3 d,结缔组织外层有上皮细胞聚集;术后4 d,结缔组织间可见一条带状间隙;术后7 d,表皮外层出现角质层;术后11 d,上皮层厚度接近正常组织,但结缔组织较松散;术后21 d,上皮细胞数量、排列以及结缔组织的排列同正常组织。免疫荧光检测结果表明：CK19在正常的仿刺参体壁中表达得比较分散;术后3 d,CK19在创伤面附近集中表达。     

仿刺参补体类似物活性的测定

用3种方法对仿刺参Apostichopus japonicus体腔液、体腔液上清液及体腔细胞中的总补体溶血活性和补体类似物AjC3、AjC4活性进行测定.结果表明:在仿刺参体腔液、体腔液上清液和体腔细胞中能够检测到总补体溶血活性和补体类似物AjC3、AjC4,表明仿刺参体内存在有脊椎动物的补体类似物,且活性与正常人补体活性相似.仿刺参体内总补体溶血活性和补体类似物AjC3、AjC4的活性依次顺序均为体腔液＞体腔细胞＞体腔液上清液.     

复方中草药对仿刺参免疫力和抗病力的影响

将以黄芪、党参为主药并加入另外5味中草药所配伍的复方中草药粉碎制剂,以质量分数分别为0%（对照组）、0.5%、1.5%和2.5%的剂量添加于基础饲料中,连续投喂仿刺参Apostichopus japonicus37d,在试验开始后第1、2、3、4周采样,测定仿刺参的肠、触手、体壁、肌肉和体腔液中的抗菌活力及体腔细胞的吞噬活性;于试验开始后第4周,用仿刺参＂化皮病＂病原菌黄海希瓦氏菌Shewanella marisflavi以3.7×108个/mL的浓度在每头仿刺参背部注射0.1 mL的菌悬液,每天观察记录死亡个体症状,统计死亡率,计算相对保护率（共观察记录7 d）。结果显示：各组的抗菌活力均随着用药时间的延长、用药浓度的加大而升高,总体趋势表现为2.5%添加组〉1.5%添加组〉0.5%添加组〉对照组;各用药组仿刺参的体腔细胞吞噬能力均随着用药时间的延长呈现先升高后降低的趋势,第2、3周达峰值,总体趋势表现为1.5%添加组〉2.5%添加组〉0.5%添加组〉对照组;攻毒试验结果显示,对照组仿刺参3 d后全部死亡,第7天各用药组相对保护率依次为1.5%添加组〉0.5%添加组〉2.5%添加组,分别为30.0%、20.0%和10.0%。由此表明,该复方中草药可以显著提高仿刺参的免疫力和抗病力,以1.5%添加剂量组的效果最佳。     

几种理化因子对仿刺参体腔液补体溶血活性的影响

测定了仿刺参Apostichopus japonicus 体腔液补体溶血活性,并研究了几种理化因子对仿刺参体腔液补体溶血活性的影响.结果表明:仿刺参体腔液补体溶血活性为(68.8±13.5) U/mL;仿刺参体腔液在pH为7.5、Mg2+浓度为8 mmol/L的EGTA-Mg-GVB缓冲液和20 ℃条件下恒温水浴90 min时,其溶血活性最高;Mg2+对仿刺参体腔液补体的溶血活性有影响,苯甲基磺酰氟(PMSF)、酵母聚糖、甲胺和肼对仿刺参补体旁路溶血活性均有明显的抑制作用.     

仿刺参profilin基因全长cDNA的克隆及表达分析

仿刺参（Apostichopus japonicus）是我国北方沿海重要养殖品种之一。克隆了仿刺参profilin基因全长cDNA序列,并分析了基因的表达规律。该基因cDNA序列全长787 bp,5′-非翻译区（5′-untranslated region,UTR）长205 bp,3′-UTR长204 bp,开放阅读框378 bp,编码125个氨基酸,预测蛋白分子量13.4 kDa。仿刺参Profilin蛋白的PROF保守结构域中含有肌动蛋白互作位点、多聚脯氨酸结合位点和PIP2互作位点。氨基酸序列比对结果显示,仿刺参Profilin与丝盘虫（Trichoplax adhaerens）和囊舌虫（Saccoglossus kowalevskii）相似度最高,为46%。Quantitative real-time PCR结果显示,profilin mRNA在仿刺参未受精卵、受精卵、多细胞期、囊胚期、原肠期、小耳状幼体、中耳状幼体、大耳状幼体、樽型幼体、五触手幼体和稚参11个发育阶段及幼参的体壁、体腔细胞、肠道和呼吸树中均有表达;在仿刺参的不同发育阶段中,未受精卵至原肠期profilin mRNA表达量低,从小耳状幼体至稚参表达量增高;在仿刺参的不同组织中,profilin mRNA在体腔细胞中的表达量最高。经过棘皮动物免疫系统有效激活物脂多糖LPS的刺激,体腔细胞中profilin mRNA表达量显著升高,为仿刺参养殖病害的防控提供科学依据。     

左氧氟沙星人工抗原间接ELISA检测方法的建立

为检测所制备的左氧氟沙星人工抗原品质,采用西北农林科技大学兽医药理实验室制备的左氧氟沙星人工抗原免疫BALB/c小鼠,制得鼠抗左氧氟沙星人工抗原的多克隆抗体.以采集的抗血清为一抗、辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG为二抗、四甲基联苯胺(TMB)为底物,建立左氧氟沙星人工抗原间接酶联免疫检测法( ELISA).试验结果表明,间接ELISA最佳反应条件为包被抗原质量浓度1 mg/L、4℃过夜、抗原抗体于37℃作用1h、酶标二抗稀释度为1∶2 000.该方法的灵敏度高,且具有良好的准确性和重复性,可以评价左氧氟沙星人工抗原的品质.     

猪流行性腹泻病毒双抗体夹心ELISA检测方法的建立

采用特异性好的鼠源抗猪流行性腹泻病毒(PEDV)单克隆抗体为捕获抗体,兔源多克隆抗体为检测抗体,建立PEDV双抗体夹心ELISA检测方法。结果显示,该方法的最佳反应条件为:抗PEDV单克隆抗体E1包被质量浓度4.40μg·mL~(-1),37℃包被2h,采用5%BSA封闭液封闭1h,兔抗PEDV抗体工作质量浓度为5.91μg·mL~(-1),酶标二抗稀释度为1∶2000,以OD450nm≥0.381作为阳性判定标准。该ELISA方法对猪轮状病毒和猪传染性胃肠炎病毒无交叉反应。敏感度可达30μg·mL~(-1)(5×103.12);重复性变异系数小于10%。采用该方法和RT-PCR方法同时检测临床样品42份,阳性样品符合率为92.30%,表明建立的PEDV双抗体夹心ELISA检测方法具有特异性好、敏感性高和方便快捷等优点,可用于PEDV快速检测。     

抗氯霉素单克隆抗体的制备及直接竞争ELISA方法的建立

用人工合成的氯霉素-卵清蛋白(CAP-OVA)免疫BALB/c小鼠,通过杂交瘤技术筛选出1株能稳定传代并分泌抗氯霉素(CAP)单克隆抗体(McAb)的杂交瘤细胞4C9,并以此制备腹水单抗.经间接竞争ELISA(ciELISA)检测,该单抗亚类重链类型是IgG1,轻链为κ类型,单抗腹水效价为1∶1×106,与甲砜霉素、氟甲砜霉素以及其他常见抗生素的交叉反应率小于0.01%.用过碘酸钠氧化法合成CAP酶标记单抗,建立了CAP直接竞争ELISA(cdELISA)方法.此法检测的线性范围为0.1~100 ng·mL-1,半数抑制浓度(IC50)为5.81 ng?L-1.添加回收实验表明所建立的CAP cdELISA方法检测限达到0.1 ng·L-1,对比试验表明其检测灵敏度与商品试剂CAP ELISA基本相当.     

猪CD127流式单克隆抗体的研制

[目的]研制出猪CD127(调节因子IL-7受体α链)流式单克隆抗体,为研究分析猪淋巴细胞亚群,尤其是猪Treg细胞亚群提供流式细胞分析抗体,也为进一步探究猪抗病性状与免疫机制间的关系打下基础.[方法]克隆猪CD127基因片段,通过原核载体诱导表达出相应的融合蛋白,以纯化后的融合蛋白免疫Balb/c小鼠,然后取其脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合,综合ELISA和流式细胞仪检测筛选出亚克隆抗体,并采用Western blotting验证所得亚克隆抗体能否与猪淋巴细胞上的CD127特异性结合.[结果]猪CD127基因cDNA全长1999 bp,第49~1428 bp为开放阅读框(ORF),编码459个氨基酸,其中前21位氨基酸为信号肽,成熟肽N端第1~219位氨基酸为胞外蛋白,第220~242位氨基酸为跨膜蛋白,第243~459位氨基酸为胞内蛋白.以pET28a和pET32a原核载体诱导表达CD127胞外片段可获得大小介于34~43 kD的融合蛋白,经Ni亲和层析柱纯化后用于免疫Balb/c小鼠,6只免疫小鼠血清中的多克隆抗体均能对猪淋巴细胞中的CD3阳性细胞(CD3+)进行共标记,其中以M2和M4两只免疫小鼠抗血清对CD3+的共标记效果较优,分群清晰;但流式细胞仪检测发现,仅2.3%的CD3+能与M2混合池培养基上清液中的分泌抗体共标记,而67.0%的CD3+能与M4混合池培养基上清液中的分泌抗体共标记,且分群清晰.从M4混合池中筛选出6株效价稳定的亚克隆细胞株(1E2、1D8、2F3、2F8、3C6和4E1),且以1D8、2F3、2F8和3C6亚克隆抗体标记的CD3+较多,其培养基上清液中的分泌抗体在猪胸腺和肌肉样品中均能检测出大小约50 kD的单一目的条带.[结论]制备获得的猪CD127流式单克隆抗体可与T淋巴细胞表面的IL-7受体特异性结合,同时在流式细胞仪检测过程中可用于猪Treg细胞亚群检测.     

HIV-1-infected T cells show a selective signaling defect after perturbation of CD3/antigen receptor

The binding of antigen or monoclonal antibody to the T cell receptor for antigen or the closely associated CD3 complex causes increases in the concentration of intracellular ionized calcium and subsequent cell proliferation. By measuring second messenger production in primary cultures of human immunodeficiency virus (HIV-1)--infected T cells stimulated with monoclonal antibodies specific for either CD3 or CD2, a specific impairment of membrane signaling was revealed. The HIV-1--infected T cells were unable to mobilize Ca2+ after stimulation with anti-CD3, whereas CD2-induced calcium mobilization remained intact. Furthermore, the HIV-1--infected cells proliferated poorly after CD3 stimulation, although the cells retained normal DNA synthesis in response to interleukin-2 stimulation. These results show that the signals initiated by CD2 and CD3 can be regulated independently within the same T cell; uncoupling of signal transduction after antigen-specific stimulation provides a biochemical mechanism to explain, in part, the profound immunodeficiency of patients with HIV-1 infection.     

Immunochemical proof that a novel rearranging gene encodes the T cell receptor delta subunit

The T cell receptor (TCR) delta protein is expressed as part of a heterodimer with TCR gamma, in association with the CD3 polypeptides on a subset of functional peripheral blood T lymphocytes, thymocytes, and certain leukemic T cell lines. A monoclonal antibody directed against TCR delta was produced that binds specifically to the surface of several TCR gamma delta cell lines and immunoprecipitates the TCR gamma delta as a heterodimer from Triton X-100 detergent lysates and also immunoprecipitates the TCR delta subunit alone after chain separation. A candidate human TCR delta complementary DNA clone (IDP2 O-240/38), reported in a companion paper, was isolated by the subtractive library approach from a TCR gamma delta cell line. This complementary DNA clone was used to direct the synthesis of a polypeptide that is specifically recognized by the monoclonal antibody to TCR delta. This complementary DNA clone thus corresponds to the gene that encodes the TCR delta subunit.     

Location and chemical synthesis of a binding site for HIV-1 on the CD4 protein

The human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) uses the CD4 protein as a receptor for infection of susceptible cells. A candidate structure for the HIV-1 binding site on the CD4 protein was identified by epitope mapping with a family of eight functionally distinct CD4-specific monoclonal antibodies in conjunction with a panel of large CD4-derived synthetic peptides. All of the seven epitopes that were located reside within two immunoglobulin-like disulfide loops situated between residues 1 and 168 of the CD4 protein. The CD4-specific monoclonal antibody OKT4A, a potent inhibitor of HIV-1 binding, recognized a site between residues 32 and 47 on the CD4 protein. By analogy to other members of the immunoglobulin superfamily of proteins, this particular region has been predicted to exist as a protruding loop. A synthetic analog of this loop (residues 25 to 58) showed a concentration-dependent inhibition of HIV-1-induced cell fusion. It is proposed that a loop extending from residues 37 to 53 of the CD4 protein is a binding site for the AIDS virus.     

1株抗鸡CD8α链单克隆抗体的鉴定

[目的]获得研究鸡CD8分子的单克隆抗体。[方法]用自行设计的引物PCR扩增鸡CD8分子α链部分基因片段,构建2个原核重组质粒,该片段经原核表达和纯化后免疫BALb/c小鼠,最后将免疫小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞融合,细胞上清液用ELISA检测。[结果]PCR扩增获得大小约为510 bp的基因片段。构建的pET-32a-CD8α导入大肠杆菌,诱导表达获得了大小为39 kD的融合蛋白H is-CD8α。融合细胞经亚克隆,其上清液用ELISA检测和筛选,获得1株稳定传代和分泌抗CD8α的抗体的杂交瘤细胞株。该株细胞被命名为C11。上清液的ELISA抗体效价达1：600。[结论]该研究以原核表达的CD8α为抗原制备了1株单克隆抗体。     

草鱼点状产气单胞菌单克隆抗体的制备与双抗原夹心ELISA法的建立

为了建立一种快速、准确能早期检测草鱼肠炎病原菌的方法,以患病草鱼为材料,制备点状产气单胞菌单克隆抗体(McAb),并鉴定其特异性和抗原表位;采用过碘酸钠方法,以辣根过氧化物酶标记单抗,用试管凝集试验测定其活性;建立点状产气单胞菌McAb的双抗原夹心ELISA检测方法,确定包被单抗和酶标单抗的浓度,并测定其灵敏度和特异性。结果:1)获得了2株特异性强和抗原表位不同的单抗,其ELISA效价为1∶16 000。2)辣根过氧化物酶标记的抗体活性为1∶640。3)建立了包被抗体稀释度为1∶800、酶标抗体稀释度为1∶1 600的双抗原夹心ELISA检测方法,该方法与点状产气单胞菌呈强阳性反应,与近似菌无交叉反应,灵敏性为7×103cfu/mL。结论:制备的点状产气单胞菌McAb的效价高、特异性强;建立的双抗原夹心ELISA方法操作简单、灵敏度高、特异性强,可应用于草鱼肠炎病原体的早期快速检测。     

Selective stimulation of T cell subsets with antibody-cytokine immune complexes

Interleukin-2 (IL-2), which is a growth factor for T lymphocytes, can also sometimes be inhibitory. Thus, the proliferation of CD8+ T cells in vivo is increased after the injection of a monoclonal antibody that is specific for IL-2 (IL-2 mAb), perhaps reflecting the removal of IL-2-dependent CD4+ T regulatory cells (T regs). Instead, we show here that IL-2 mAb augments the proliferation of CD8+ cells in mice simply by increasing the biological activity of preexisting IL-2 through the formation of immune complexes. When coupled with recombinant IL-2, some IL-2/IL-2 mAb complexes cause massive (>100-fold) expansion of CD8+ cells in vivo, whereas others selectively stimulate CD4+ T regs. Thus, different cytokine-antibody complexes can be used to selectively boost or inhibit the immune response.