儿茶素酶促制备茶黄素的研究进展

综述了儿茶素酶促制备茶黄素各反应条件的研究进展,旨在为确定儿茶素酶促制备茶黄素自动化提供科学依据,并就酶促制备茶黄素在选择多酚氧化酶方面以及同工酶方面做研究展望。     

茶儿茶素体外氧化产物分析

采用体外模拟发酵, 对从绿茶中提取的茶多酚( 其中儿茶素含量为78-09 % ) 进行酶促氧化、化学氧化和自动氧化, 制取茶色素, 经HPLC分析, 结果表明, 酶促氧化和化学氧化的产物吸收峰均能得到明确分辨, 其保留时间与红茶汤中茶色素成分相吻合, 而自动氧化的产物中则缺少TFs。优化的化学氧化法制得的茶色素中, TFs 和TRs1 含量高于酶促氧化制品。     

儿茶素组成和理化条件对茶黄素酶催化合成的影响

利用梨果实多酚氧化酶,在单因素试验基础上,设计正交试验,进行酶性合成茶黄素,研究儿茶素组成和理化条件对茶黄素合成的影响,以确定最佳反应条件。结果表明,以儿茶素混合物C(EGC>200mg/g,EGCG>200mg/g,儿茶素总量>500mg/g)为材料,茶黄素酶促合成的最佳条件为:反应体系的最佳pH值为5.5,温度为30℃,底物浓度为5mg/ml,酶添加量为75ml/1000mg,最佳反应时间40min。pH值和儿茶素浓度是反应体系中两个重要的影响因子(P<0.05)。     

茶黄素形成机理及其开发应用研究进展

茶黄素、茶红素是红茶发酵过程中形成的两类主要色素物质,其中茶黄素主要指由茶多酚、儿茶素类及其衍生物氧化缩合而来的且溶于乙酸乙酯呈橙黄色的物质;茶黄素经酶促氧化或非酶促氧化易进一步形成茶红素。在红茶成品茶中,茶黄素的含量不到0.3％,而茶红素     

理化条件对茶鲜叶儿茶素离体氧化的影响(续)

发酵期间,红茶多酚类的形成可以认为是两种反应综合的结果。多酚氧化酶的初期酶促反应,导致儿茶素为有关的邻—醌氧化。在此后的反应中,邻醌缩合生成茶黄素,此外经大量未确定的化学反应形成一系列属于近称为茶红素a的色素化合物成分,对这组色素成分总称为茶红素。形成1摩尔茶黄素需要1摩尔没食子儿茶素(表没食子儿茶素没食子酸脂或表没食子儿茶素)与1摩尔简单儿茶素(表儿茶素或表儿茶素没食子酸脂)的氧化缩合,因此,要在任何儿茶素混合液中形成最大量的茶黄素,就必须使这两类儿茶素的浓度相等。实际上,这种理想的情况从没有实现过,因为自然地出现在茶树新梢中的简单儿茶     

酶促合成茶黄素的茶鲜叶酶源筛选

通过对不同季节、不同采摘标准的20个茶树品种鲜叶的多酚氧化酶(PPO)活性及其同工酶分析,筛选出了3种PPO活性较高的茶鲜叶原料,然后以其匀浆液以及在匀浆液中添加速溶绿茶的方法,以催化速溶绿茶酶促合成茶黄素的效率为标准筛选了酶促合成茶黄素的茶鲜叶酶源。结果表明,各茶树品种茶鲜叶PPO活性以夏季一芽二叶较高,酶活性较高的3个品种依次为政和大白茶、福云6号及桃源大叶;不同品种茶鲜叶的PPO同工酶在谱带数目、迁移率和谱带染色深浅3个方面有差异,20个品种有2条相同的同工酶带,其Rf值分别为0.27和0.53,政和大白茶、桃源大叶、福云6号均有5条明显的同工酶带,且以政和大白茶的谱带染色最深;单位质量的政和大白茶鲜叶匀浆液自身酶促合成茶黄素的量高于桃源大叶与福云六号;参加酶促反应合成茶黄素的儿茶素主要为EC、EGCG和ECG;添加速溶绿茶作为底物合成茶黄素的量远高于茶鲜叶自身酶促合成茶黄素的量,其中政和大白茶反应体系中茶黄素的质量浓度达212.01mg/L,为自身酶促合成茶黄素质量浓度(39.05mg/L)的5.43倍。     

植物外源多酚氧化酶酶促合成茶黄素的研究进展

近年来,茶黄素作为一种具有多种生理功能的天然物质,受到国内外研究者们的广泛关注.本文从筛选酶促合成茶黄素PPO的酶源、影响茶黄素制备的因素、酶工程技术在制备茶黄素上的运用以及植物源PPO结构特点和酶促氧化茶黄素机理等方面综述PPO酶促合成茶黄素的研究进展,以望能为工业化制备茶黄素提供参考.     

发酵过程的控制及调节发酵产物保证茶叶品质的工艺技术

红茶加工中发酵阶段的基本反应是鲜叶中六种儿茶素的酶促氧化。由儿茶素参生的邻醌是非常活泼的,由此而产生一系列复杂的化学反应导致决定茶汤色、味特征的色素的形成.发酵期间产生的茶叶色素主要有两种,即茶黄素(TF)和茶红素(TR).儿茶素转化成茶黄素和茶红素如图1所示。     

毛栓菌多酚氧化酶酶学性质及茶黄素的酶促合成研究

研究从毛栓菌中分离得到的多酚氧化酶(PPO)用于茶黄素的体外氧化制备。结果表明毛栓菌胞外PPO较适的反应温度范围在28~36℃之间;最适pH值为5.2;恒温反应30min内均表现出较高的活性和稳定性;50%的硫酸铵可以沉淀粗酶液中96.0%的PPO。将毛栓菌PPO加入到儿茶素反应液中进行双液相反应,可得到10.19%的茶黄素,与茶鲜叶来源的PPO相比,毛栓菌PPO制备茶黄素的总含量偏低,但其中TF-3-G的比例较高,达到总茶黄素的68.10%,占脂型茶黄素总量的92.08%。     

两种原核表达载体对CsPPO蛋白表达活性的影响

为了选择合适载体,获得稳定表达且具有高活性的可溶性茶树多酚氧化酶,本研究以茶树叶片为材料,克隆茶树多酚氧化酶基因（CsPPO）,切除含43个氨基酸和70个氨基酸的肽段后分别与pET32a载体、pMAL-c5X载体进行重组构建原核表达载体,分别命名为pET32a-CsPPO₄₃、pET32a-CsPPO₇₀、pMALc5X-Cs PPO₄₃、pMALc5X-CsPPO₇₀,利用E. coil Transetta（DE3）菌株进行表达,经SDS-PAGE电泳检验,pMAL-c5X载体表达的目的蛋白易于提取,大量出现在上清液中;而pET32a载体表达后蛋白则基本存在于沉淀中。利用邻苯二酚、ECG、EC 3种底物在410βnm处检测CsPPO蛋白活性发现,pMALc5X-CsPPO对不同底物反应时酶活性随时间增加均呈现明显“S”型变化,表明茶树PPO氧化儿茶素类的反应并不是匀速过程。pMALc5X-CsPPO₄₃比活力比pMALc5X-CsPPO₇₀的高,其中pMALc5X-CsPPO₄₃与EC反应时酶比活力最高,最大比活力为1.45×10⁶β U·mg^-1。因此,可利用pMALc5X-CsPPO₄₃合成工业用PPO,为进一步研究其与儿茶素的反应机理,利用体外酶法高效获得茶黄素奠定基础。     

茶叶功能成份对甲硫醇的去除效果

就茶叶功能成份对主要恶臭成分甲硫醇的去除效果进行了研究,结果表明:绿茶水提取物,儿茶素,EGCG对甲硫醇的去除效果不明显,而茶黄素则表现出较强的活性;在pH10的碱性条件下,1mg含量为40%的茶黄素对甲硫醇的最大去除量为0.232mg。     

高纯度茶色素产品的化学组成与检测

用高压液相色谱同步分析测定了用固定化多酚氧化酶生化反应器生产的茶色素产品的茶黄素和儿茶素的含量和组成。产品的茶黄素总量为78．94％，其中TF5．89％、TF3G14．54％、TF3’G11．17％、TFDG47．34％。产品中残留的儿茶素为13．83％，其余7．23％为茶红素等成分。     

湖南红茶特征滋味化学成分研究

为全面了解湖南红茶特征滋味化学成分,本研究选取了湖南红茶代表性样品和典型外省样品,采用电子舌及高效液相色谱法等技术对红茶样品滋味进行评定及化学成分检测,并通过主成分分析（PCA）、正交偏最小二乘判别分析（OPLS-DA）可视化模式识别方法比较了不同嫩度等级和不同滋味类型湖南红茶化学成分的特征差异。结果表明：（1）糖组分总量、葡萄糖、麦芽糖、茶多酚、茶褐素、氨基酸组分总量、鲜味氨基酸、茶氨酸、茶黄素等含量可作为区分湖南红茶和外省红茶的主要滋味成分,其中糖组分总量、葡萄糖、麦芽糖、茶黄素等含量湖南红茶显著高于外省红茶。（2）一级湖南红茶茶汤中滋味化合物含量普遍较低,除氨基酸、茶褐素外,其他主要滋味成分均显著低于二级茶样;二级湖南红茶茶汤中滋味化合物在水浸出物、茶多酚、咖啡碱、氨基酸、茶黄素、茶红素等含量上表现突出;三级湖南红茶以儿茶素组分总量、糖类化合物、茶黄素、茶红素等成分含量相对较高,以茶多酚、氨基酸、茶褐素等成分含量相对较低。（3）“甘鲜味”茶汤中咖啡碱、儿茶素组分总量、非酯型儿茶素、EGC、茶黄素显著低于“略苦（浓）”茶汤。该研究结果可为湖南红茶产品的分类鉴别和滋味品质评价提供参考。     

茶多酚固定化酶体外氧化产物茶黄素组成及其化学发光分析

以红茶中提取的茶黄素粗提物和氧化前的茶多酚为对照,利用HPLC技术分析了纳米CaCO3固定化多酚氧化酶氧化产物的茶黄素组成;利用化学发光法进行了抗氧化活性研究。结果发现,固定化酶体外氧化产物中茶黄素组成以TF2A为主,茶黄素粗提物中四种茶黄素单体均占一定的比例;利用CuSO4-Vc-H2O2-酵母体系和Fe2+-H2O2-酵母体系进行化学发光研究,发现固定化酶体外氧化产物抗氧化活性较茶黄素粗提物和茶多酚强。     

酶性氧化合成茶黄素条件优化的研究

利用提取粗酶液在单因素试验和正交试验进行合成茶黄素以及在此基础上利用捣碎茶鲜叶（不提取粗酶液）直接进行合成茶黄素试验以确定最优反应条件。结果表明,在本试验反应体系中,茶黄素酶促合成的最佳条件（茶黄素总量）为：温度为30℃,反应体系的最佳pH值为4.8,底物浓度为0.9βg/100βml,酶源物浓度为28βg/100βml（以鲜叶重量计）,通氧量为0.4βL/min,最佳反应终止时间是40βmin。其中温度和pH值是反应体系中两个极其重要的影响因素（P<0.05）;通氧量也是影响茶黄素酶性合成的必不可少的条件之一。     

光照强度对发酵叶主要生化成分动态变化的影响

以福鼎大白茶一芽二叶鲜叶为原料,设置0 lx、3 000 lx、6 000 lx、9 000 lx、12 000 lx、15 000 lx等6个光照强度处理,研究不同光照强度对发酵叶主要生化成分的动态变化规律的影响。在发酵过程中,每隔30 min取样,测定茶多酚、黄酮、氨基酸、可溶性蛋白质、可溶性糖、儿茶素组分、氨基酸组分和茶黄素组分等含量。结果表明,随着发酵时间的延长,不同光照处理样茶多酚、儿茶素总量均呈现下降的趋势,黄酮、游离氨基酸和可溶性糖呈现上升的趋势,可溶性蛋白质总量和茶黄素总量呈现先升后降的趋势,拐点在发酵120 min左右。不同光照强度处理间比较,15 000 lx强光照处理会促进茶多酚和儿茶素组分含量的下降及黄酮、游离氨基酸总量的积累;9 000 lx处理样的可溶性蛋白质和可溶性糖含量最高;3 000 lx处理样的茶黄素组分总量和茶氨酸比重最高;感官审评结果表明3 000 lx处理样的汤色、滋味等得分最高,品质最优。     

茶多酚体外氧化产物颜色稳定性及对PC-3细胞生长的影响

以红茶中提取的茶黄素粗提物、绿茶多酚为对照,利用紫外扫描技术、UV-Vis法及MTT法研究了绿茶多酚纳米固定化多酚氧化酶体外氧化产物的颜色稳定性、自由基清除能力和对前列腺癌细胞PC-3生长的抑制作用。在不同pH值条件下,茶黄素粗提物和绿茶多酚纳米固定化酶体外氧化产物的紫外吸收光谱的变化趋势相似,碱性增加,吸光度增加;绿茶多酚、茶黄素粗提物及绿茶多酚纳米固定化酶体外氧化产物对DPPH·自由基均有明显清除作用,绿茶多酚纳米固定化酶体外氧化产物清除效果较绿茶多酚和茶黄素粗提物强;茶黄素粗提物及绿茶多酚纳米固定化酶体外氧化产物对PC-3细胞的生长都有抑制作用,绿茶多酚纳米固定化酶体外氧化产物优于茶黄素粗提物。因此,绿茶多酚纳米碳酸钙固定化酶体外氧化产物中茶黄素保持了红茶中茶黄素所具有的良好生物学活性。     

提高红碎茶水溶性多酚类保留量实验

研究了红碎茶发酵过程中茶多酚、此茶素的变化规律，结果表明，茶多酚、儿茶素总量随发酵时间的延长而降低，发酵温度控制在23℃、发酵时间在100min最有利红碎茶品质。在发酵中添加2％的柠檬酸钠等化学抑制剂和胰蛋白酶等生化抑制剂可明显提高成茶中茶多酚、儿茶素的保留量，增加条黄素、茶红素的含量和降低条褐素的含量。