Chi和Bar基因双价植物表达载体的构建及转基因烟草的初步检测

构建了单子叶植物双价表达载体pBI121-Ubi-Bar/Chi,其中含有木霉几丁质酶基因Chi和抗除草剂Bar基因,均由玉米Ubi启动子驱动.以烟草无菌苗叶片为受体,用农杆菌介导法将目的基因转入烟草中;以Bar基因作为选择标记,PPT为选择剂进行筛选,获得了一定数量的转基因植株.结果表明:经PCR分析,初步确定目的基因已经整合到烟草基因组中.     

不同启动子在转基因烟草中抗番茄黄化曲叶病毒的研究

为了提高植物对番茄黄化曲叶病毒的抗性,利用CaMV35S启动子、棉花韧皮部特异启动子PGHNBS、拟南芥韧皮部特异启动子SUC2分别构建了含有不同启动子控制下的烟粉虱内GroEL基因的植物表达载体P-Gro-EL、P-PGHNBS-GroEL、P-SUC2-GroEL。通过农杆菌介导转化法,获得了一批抗卡那霉素的转化再生烟草植株。RT-PCR结果表明,3个启动子皆驱动GroEL基因在转基因烟草中表达。对转化再生烟草的一次病毒注射侵染结果显示,共有19株抗性烟草植株,其中,转P-GroEL载体的有7株,转P-PGHNBS-GroEL和P-SUC2-GroEL载体的各有6株;2次病毒注射侵染的结果显示,获得7株抗性烟草植株,它们是转P-GroEL载体的1株、转P-PGHNBS-GroEL和P-SUC2-GroEL载体的各3株。2次接种的试验结果表明,PGHNBS和SUC2转基因烟草植株的抗病效果均比CaMV35S转基因植株明显。证明利用韧皮部特异表达GroEL基因可以获得抗番茄黄化曲叶病毒的转基因植物。     

冷诱导转录因子基因CBF3转化黄瓜的研究

从拟南芥Columbia生态型基因组DNA中扩增并克隆了冷诱导转录因子CBF 3基因,将其与CaMV 35 S启动子和Nos终止子融合后构建成植物表达载体pBINP-35 S-CBF 3.通过农杆菌介导转化黄瓜子叶,获得了具有卡那霉素抗性的黄瓜再生植株.经PCR检测鉴定,表明CBF 3基因已整合到黄瓜基因组中.     

冷诱导转录因子基因CBF3转化黄瓜的研究

从拟南芥Columbia生态型基因组DNA中扩增并克隆了冷诱导转录因子CBF3基因,将其与CaMV35S启动子和Nos终止子融合后构建成植物表达载体pBINP-35S-CBF3。通过农杆菌介导转化黄瓜子叶,获得了具有卡那霉素抗性的黄瓜再生植株。经PCR检测鉴定,表明CBF3基因已整合到黄瓜基因组中。     

烟草根特异性启动子植物表达载体的构建及其对番茄的转化

利用PCR技术从烟草中克隆获得了893bp的根特异性表达基因TobRB7的启动子,命名为NT1.以pBI121为原始植物表达载体,用NT1启动子和番茄广谱抗病基因Pto分别取代CaMV 35S启动子和GUS基因,获得了烟草根特异启动子驱动抗病基因的表达载体,命名为pBI-NT1::Pto.采用冻融法将pBI-NT1::Pto导入根癌农杆菌EHA105中,以番茄子叶为外植体进行了侵染转化.PCR检测NPT II基因的结果表明已获得转基因番茄植株.     

白桦BpMADS3 基因的功能分析

利用RT鄄PCR 技术,揭示了BpMADS3 基因在白桦不同组织中的差异表达模式:BpMADS3 基因仅在花器官中 强烈表达,在茎、叶组织中不表达。采用染色体步移法克隆BpMADS3 基因上游启动子,获得1 426 bp 长度启动子序 列,构建BpMADS3 基因启动子驱动GUS 基因植物表达载体,在拟南芥转基因植株中GUS 染色表明,GUS 活性集中 在萼片和心皮中。在拟南芥ap1 突变体中过量表达BpMADS3 基因,能恢复拟南芥ap1 突变体花器官的正常发育。 BpMADS3 基因转化烟草发现,转基因植株出现早花表型,且转基因烟草植株中相关开花基因表达水平均上调。      

玉米根部特异性启动子的克隆及功能分析

【目的】从玉米幼根基因组DNA中克隆β-葡萄糖苷酶基因根部特异性启动子序列ZmGLU1P,并对其功能进行分析。【方法】利用PCR技术从玉米品种P138幼根基因组DNA中克隆玉米根部特异性启动子片段ZmGLU1P,将其与GUS基因融合,构建植物表达载体pCAMBIA121-ZmGLU1P,转化到EHA105根癌农杆菌中,通过根癌农杆菌介导法转化烟草NC89,对转化烟草植株进行PCR和Southern杂交检测。采集PCR和Southern杂交检测为阳性的转基因烟草的根、茎、叶,进行GUS活性的组织染色检测。【结果】克隆获得了ZmGLU1P片段,其长度为1 846 bp,与已报道的序列同源性达99%以上。转基因烟草植株的PCR和Southern杂交结果显示,成功地获得了转基因阳性植株;GUS活性检测表明,根中GUS活性最强,而在茎和叶等组织中GUS活性甚微,表明ZmGLU1P片段具有根部特异性启动子功能。【结论】玉米β-葡萄糖苷酶基因上游1 846 bp的片段ZmGLU1P具有根部特异性启动子功能,为根部特异性启动子。     

二氢黄酮还原酶基因植物表达载体构建及对烟草的遗传转化研究

以pBI121为基础载体,通过分步酶切连接分别构建组成型CaMV35S启动子、光合组织特异型PNZIP启动子驱动的DFR基因植物表达载体pBIDFR和pPNDFR;采用直接转化法将pBIDFR和pPNDFR导入根癌农杆菌菌株,采用pPNDFR/EHA105菌株对普通烟草进行了遗传转化研究.在Kanamycin选择压力下获得了烟草转化不定芽和完整植株,经过PCR鉴定,该DFR基因已成功导入烟草基因组中.     

土壤宏基因组中抗草甘膦新基因的克隆及其功能验证

【目的】从土壤宏基因组中克隆新的抗草甘膦新基因,并对其功能进行验证,为培育抗除草剂转基因新品种奠定基础。【方法】利用被草甘膦污染的土壤建立宏基因组文库,经筛选从中成功克隆了一个新的具有草甘膦抗性的5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶(EPSPS)基因(命名为soilA)。构建了Prrn启动子驱动soilA基因的原核表达载体pSYTH-soilA,将其导入大肠杆菌进行原核草甘膦抗性试验,构建了35S启动子驱动soilA基因的植物表达载体pC330E,利用农杆菌介导法转化烟草,并对经PCR和胶体金试纸条鉴定的转基因烟草植株进行草甘膦耐受能力检测。【结果】序列分析表明,所获得的soilA基因长1 347bp,编码448个氨基酸,经BLAST分析,结果表明其属于ClassⅡ型EPSPS基因家族。原核表达soilA可使受体菌具有耐受1 200mmol/L草甘膦。构建soilA植物表达载体pC330E,通过农杆菌介导法将其导入烟草,经PCR和胶体金试纸条检测共获得107株阳性烟草植株,经过喷洒试验获得了3株高耐受草甘膦植株,这3株转基因烟草最高可耐受200mmol/L草甘膦。【结论】新克隆的编码EPSPS的soilA基因能够提高受体材料的草甘膦耐受能力。     

小麦avenin-like type-B基因启动子的克隆及功能验证

为深入研究ALPtype-B基因的调控机理及胚胎特异性表达特性,采用农杆菌转化技术,将含有ALPtype-B基因启动子的双元表达载体转化烟草。对阳性转基因烟草植株进行GUS组织化学检测定性分析。结果显示,小麦ALPtype-B基因启动子可驱动报告基因在烟草种子的胚乳中特异表达,在其他组织中没有表达。     

间伐对栓皮栎人工林林下荆条根茎叶主要功能性状的影响

  目的  研究间伐对栓皮栎Quercus variabilis人工林林下荆条Vitex negundo var. heterophylla根、茎、叶功能性状的影响，为人工林林分结构优化和林下幼苗更新保护提供理论基础。  方法  以间伐后3 a栓皮栎人工林灌木层荆条为研究对象，比较其叶面积、比叶面积、叶干物质质量分数、茎干物质质量分数、总根长、比根长等结构性状，以及植株各器官全氮、全磷、全钾和总有机碳质量分数等化学性状的差异性，研究植物功能性状与林下光环境及土壤理化特征的关系。  结果  间伐后荆条地上部分植物功能性状指标(叶总有机碳、叶面积、比叶面积、叶有机氮、茎总有机碳)和地下部分植物功能性状指标(总根长、根体积、根生物量、根总有机碳)均显著高于对照样地(P＜0.05)。相关和逐步回归分析结果表明:林下散射辐射是影响荆条叶结构性状的主要因子，林下直射辐射通量、光合有效辐射和太阳总辐射时间是影响叶化学性状的关键因子，茎功能性状主要受林下直射辐射和散射辐射的共同作用。总根长、比根长和根有机碳与土壤非毛管孔隙度、土壤总孔隙度、土壤有机碳和土壤全氮存在显著相关(P＜0.05)，其中，土壤有机质是影响荆条根功能性状的关键因子。  结论  间伐能显著促进栓皮栎人工林下荆条叶和根功能性状的发育，对茎功能性状的影响较弱。图1表6参31     

甘蔗细胞壁转化酶基因(SoCIN1)克隆及其在转基因烟草中的表达特性分析

[目的]克隆甘蔗细胞壁转化酶基因(SoCIN1)并分析其在转基因烟草植株中的表达特性,为研究CIN1基因功能提供参考.[方法]克隆SoCIN1基因,利用基因重组技术构建植物正义表达载体pBI121-SoCIN1,采用叶盘法经农杆菌EHA105介导将其转化烟草品种K346.经抗性筛选和PCR扩增验证后获得转SoCIN1基因烟草植株,采用半定量PCR检测叶片SoCIN1基因的表达量,并测定叶片可溶性糖含量、CIN活性及株高(以野生型烟草为对照).[结果]克隆获得的SoCIN1基因长度为1731 bp,与GenBank已公布的SoCIN1基因(JQ312298)核苷酸序列同源性达100%,并通过构建其植物正义表达载体转化烟草.PCR扩增鉴定结果表明,SoCIN1基因已整合至烟草基因组DNA.对F0和F1代进行转基因烟草连续筛选,获得4个转SoCIN1基因烟草株系(T-1、T-2、T-3和T-4).在4个株系的叶片中均检测到SoCIN1基因的表达,其中以在T-1株系叶片中SoCIN1基因表达量最高,其次是T-3株系,最低的是T-4株系.4个株系叶片的可溶性糖含量、CIN活性及株高均高于野生型烟草,其中CIN活性显著高于野生型烟草(P<0.05,下同),且T-1株系CIN活性高于其他3株系;T-1、T-2和T-3株系叶片可溶性糖含量分别显著高于野生型烟草39.68%、19.95%和31.15%;T-1、T-2、T-3和T-4株系的株高较野生型烟草分别提高了15.57%、2.90%、5.74%和5.22%,但仅T-1株系与野生型烟草存在极显著差异(P<0.01).[结论]转SoCIN1基因烟草叶片过表达SoCIN1基因,能提高烟草的CIN活性和可溶性糖含量,促进植株生长,由此推测该基因在甘蔗生长发育和蔗糖积累过程发挥作用.     

叶面喷施有机钾肥对烤烟生长及品质的影响

为研究叶面喷施有机钾肥对烤烟生长及品质的影响,本研究以烤烟品种“云烟105”为试验材料,采用单因素随机区组田间试验设计,在打顶后分2次叶面喷施有机钾肥,并以喷施清水为对照,分析比较叶面喷施有机钾肥对成熟期烟株农艺性状、光合特性、生物量、烤后烟叶单叶重及品质的影响。结果表明,叶面喷施有机钾肥能显著提高烟株的株高、叶面积系数、生物量等性状。叶面积系数增加了10.7%,根的干重增加了50%,叶片的干重增加了36.5%。同时,叶面喷施有机钾肥还有效地改善了叶片的净光合速率、气孔导度和蒸腾速率。在烤后烟叶的化学成分方面,叶面喷施有机钾肥还能提高烟叶钾含量,降低烟碱含量,进一步协调烟叶的化学成分。此外,叶面喷施有机钾肥后,中部叶片感官质量的总体评价优于对照,尤其在香气质、杂气程度、甜度等方面均明显好于对照。本试验的结果说明,在成熟期叶面喷施有机钾肥,对于提高单叶重,增加叶面积系数,协调烟叶内部化学成分,提高烟叶品质有积极的作用。     

拟南芥CYCD3;1基因植物表达载体的构建 及在烟草中的遗传转化分析

为了分析植物D型细胞周期蛋白在细胞周期中的作用,采用PCR方法从拟南芥花序中克隆出At CYCD3;1基因的全长c DNA序列。该基因的开放读码框为1131 bp,预测编码376个氨基酸,蛋白质的分子量为42701.6 Da,蛋白质的等电点为4.89。构建植物表达载体p ROKII-At CYCD3;1,并利用农杆菌介导的叶盘法将外源基因导入野生型烟草中。通过PCR及q RT-PCR检测显示,At CYCD3;1成功插入烟草基因组并在转录水平表达。表型观察显示转基因株系与野生型株系相比主要表现为花冠宽度变大,花瓣和萼片长度变长,果实变大,茎干弯曲,叶片卷曲,根尖细胞变小。综上,拟南芥At CYCD3;1基因的过量表达影响了植物的生长发育。     

不同栽培条件对烤烟农艺、经济性状及烟碱含量的影响

田间正交试验结果表明,种植密度(D)和施氮量(N)对烤烟的叶宽、叶长和叶面积没有显著影响,但随留叶数(T)的增加,上、中部叶变窄,叶面积变小;D对烤烟的经济性状没有影响。随着T减少,产量、产值显著地增大。在120kg/hm2的中等施氮水平下,烤烟的产量、产值、中等烟比例、下等烟比例、均价处于最佳状态。上部叶、中部叶烟碱含量随着D的减少而增加。所有部位烟叶烟碱含量均随着N的减少而减少。下部叶烟碱含量随着T的增加而减少。在120cm×45cm的种植密度+112.5 kg/hm2的氮肥施用量+18片/株的留叶数的农艺措施组合下,烟碱含量最低。     

天然彩色棉纤维特异表达启动子LTP3的克隆及其在烟草中的表达特异性

报道天然彩色棉纤维特异表达启动子LTP3,大小为1 548 bp。经测序分析,与GenBank中登录的海岛棉（Gossypium hirutum L.DES119）特异表达启动子序列同源性为99%,仅有个别碱基发生改变,而启动子的基本元件未发生突变。将克隆的启动子与报告基因GUS融合,构建植物表达载体pBI-LTP3,...     

间作桔梗对烤烟主要农艺性状及效益的影响

通过3年田间试验,研究了烤烟与桔梗间作对烤烟农艺性状、病害发生、烟叶外观质量和烟叶效益的影响。结果表明,烤烟与桔梗间作与烤烟单作相比,株高、茎围、腰叶、顶叶均略高于单作烟田,但差别不大;当地发生的主要病害病毒病、角斑病与野火病、黑胫病、赤星病的发病率均明显低于单作烟田;原烟外观质量与单作烟田基本相当;单产及其烟叶产值均低于单作烟田,但间作烟田烤后烟叶上中等烟比例和均价均高于单作。加上桔梗产值,间作烟田的综合经济效益显著高于单作烟田。     

打顶留叶数对烤烟产量、质量及焦油释放量的影响

[目的]研究打顶留叶数对丹东烟区烤烟产量、质量和焦油释放量的影响,为优质低焦油烟叶生产提供理论依据。[方法]通过安排留叶20片,18片(对照),16片3个处理的田间试验,调查分析在正常打顶时期不同留叶数对烤烟产质量及焦油释放量的影响。[结果]结果显示,打顶留叶20片时烟株农艺性状得到改善,田间发病情况较轻,产量、产值均高于对照,内在化学成分较协调,但烟气焦油释放量高。[结论]打顶留叶20片为较适宜处理,此时化学成分协调,经济效益更佳。     

玫瑰黄链霉菌活性代谢产物诱导烟草灰霉病抗性机制研究

【目的】解析温室条件下玫瑰黄链霉菌Men-myco-93-63活性代谢产物Roflamycoin和Men-myco-A（简称R&M）诱导烟草灰霉病抗性的作用机制,为利用R&M绿色防控烟草灰霉病提供理论依据。【方法】通过80 mg/L R&M注射4~5叶期本生烟草叶片后过敏反应（HR）染色验证及100 mg/L R&M注...     

不同时期优化结构对烟叶品质的影响

为研究不同时期优化结构对烤烟生长和产质量的影响,通过田间小区对比试验,研究不同时期优化烟叶结构对烤烟生长发育和产品质量的影响。结果表明:T3处理有助于促进烟株叶片开展,增加光合作用面积,促进烟株干物质积累;T1处理增加烟叶干鲜比,增强烟株抗逆性;化学成分方面表现为T3处理较好。综合来看,烟株采烤时3片脚叶留烟株不进烤,采收结束时留2片顶叶不进烤,有助于促进烟叶品质的提升。