GmSARK启动子驱动IPT基因在拟南芥中的表达研究

[目的]对GmSARK启动子驱动IPT基因在拟南芥中的表达进行研究。[方法]分别克隆IPT基因及GmSARK基因启动子,构建它们的植物表达载体并进行拟南芥的转化,利用PPT(phosphinothricin)除草剂筛选,检测T1代转基因植株;对T1代转基因植株进行黑暗避光和干旱处理后进行半定量RT-PCR分析。[结果]成功克隆得到了IPT基因及GmSARK基因,并构建了它们的p3301-GmSARK-IPT植物表达载体;对T1代转基因植株的RT-PCR表明,目的基因mRNA水平上有所表达。[结论]为进一步研究GmSARK启动子驱动的IPT基因在抗逆中的作用奠定了基础。     

水稻醇溶蛋白启动子驱动下的ipt基因表达及对烟草种子iPAs含量和种子重量的影响

将种子特异性表达的水稻醇溶蛋白启动子P与ipt基因融合,构建了pBI121-Pi植物表达载体,通过农杆菌LBA4404介导将基因整合到烟草的基因组中,利用抗生素筛选和PCR检测及序列分析,筛选出转基因的植株,成熟种子通过ELISA试剂盒检测其细胞分裂素含量,发现iPAs的含量为对照的4.17倍,种子的千粒重与对照相比增加了12.14%。     

特异性启动子在异戊烯基转移酶基因转化中的应用

综述了特异性启动子在异戊烯基转移酶基因转化中应用的研究进展,分析了存在的问题,并对今后的研究提出了建议。     

银杏木质部特异定位表达基因启动子在转基因烟草的功能研究

为了研究银杏GRP 1.8启动子在木本植物中的调控制特性,用从银杏细胞壁形成及纤维素生物合成密切相关的,并定位于形成层木质部维管组织细胞表达的富甘氨酸蛋白质基因(GRP 1.8)的启动子与GUS报告基因构建的表达载体转化烟草,经过Southern blotting鉴定,得到一批转化再生植株.经GUS组织化学检测,发现转基因烟草的茎木质部呈现GUS染色阳性,初步证明银杏GRP 1.8基因启动子确有韧皮部表达特性,可介导GUS基因在转基因烟草木质部特异性表达.     

HRAP基因诱导型植物表达载体的构建及烟草转化

系统获得性抗性是植物抵御病菌侵染的一种独特的防御机制.HRAP基因是一种从甜胡椒中克隆的蛋白质激发子,可以有效引发植物系统性抗性.SAR8.2b基因是烟草系统获得性抗性信号传导途径中下游响应基因,受病原物和水杨酸诱导.本试验根据Genebank发布SAR8.2b基因的启动子序列,利用PCR技术,克隆了SAR8.2b基因的完整启动子,命名为SAR8.2bP,然后将SAR8.2bP构建到pUC18-HRAP载体中命名为pUC18-SAR8.2bP-HRAP,然后用SAR8.2bP-HRAP替换p2300-121载体中的35S启动子和GUS基因,重组子命名p2300-SAR8.2bP-HRAP.将构建的植物表达载体转化农杆菌GV3101,利用叶盘法转化烟草,通过PCR筛选,获得了转基因植株.为进一步验证转基因烟草的抗病效果奠定了基础.     

猕猴桃果实特异表达ipt基因的构建

异戊烯基转移酶(ipt)基因是细胞分裂素生物合成关键酶．为保证／ipt基因仅在猕猴桃开花授粉之后的幼果期开始有效表达,作者以pUC119质粒为克隆载体,将猕猴桃果实特异表达的猕猴桃素(Actinidin)因启动子与ipt编码基因连接构建成猕猴桃果实特异表达ipt基因．     

拟南芥AtRD29a启动子在烟草中的表达特性

将低温诱导启动子AtRD29a控制的GUS基因转入烟草,通过GUS活性组织染色,分析拟南芥AtRD29a启动子在烟草植株中的表达特性;结果表明:外源基因已经整合到烟草基因组中,并且AtRD29a启动子在烟草中同在拟南芥中一样,不具有组织表达特异性,而是低温诱导型启动子;它在25 ℃常温下不表达,10 ℃左右为诱导临界温度,4 ℃左右稳定和高效表达.     

拟南芥AtRD29α启动子在烟草中的表达特性

将低温诱导启动子AtRD29α控制的GU$基因转入烟草,通过GUS活性组织染色,分析拟南芥AtRD29α启动子在烟草植株中的表达特性;结果表明：外源基因已经整合到烟草基因组中,并且AtRD29α启动子在烟草中同在拟南芥中一样,不具有组织表达特异性,而是低温诱导型启动子;它在25℃常温下不表达,10℃左右为诱导临界温度,4℃左右稳定和高效表达。     

诱导型启动子在植物基因工程中的研究进展

诱导型启动子不仅能使目的基因的表达产物在特定时期积累,避免植物能量的不必要浪费,而且可以避免基因过表达对植物造成的毒害,以及因此造成的植物减产甚至死亡。综述了高等植物诱导型启动子在植物基因工程中的最新研究进展,以期使人们更加深入地了解高等植物基因表达调控机制,为植物基因工程及作物改良研究提供具有应用价值的启动子元件。     

猕猴桃果实特异表达异戊烯基转移酶基因植物表达载体的构建

以pBI121质粒为载体,将猕猴桃素基因启动子与ipt编码基因连接,构建猕猴桃果实特异表达ipt嵌合基因。     

一个烟草糖基转移酶启动子在转基因烟草植株中的表达分析

[目的]研究从烟草中克隆的1个受水杨酸和茉莉酸甲酯诱导表达的新糖基转移酶基因（sm-Ngt）启动子部分缺失片段在烟草中的表达。[方法]以转sm-Ngt5个不同长度的5’端缺失的启动子与Gus基因融合植物表达载体的T1代转基因植株为材料,用茉莉酸甲酯（MeJA）和水杨酸（SA）处理16 h后分别进行GUS组织化学染色和荧光定量法测定GUS酶活性,分析水杨酸和茉莉酸甲酯对sm-Ngt5个不同长度的5’端缺失的启动子表达的影响。[结果]在5个不同缺失片段启动子的转基因T1代生长30 d的植株中,转-220～0 bp片段的GUS染色最少,转-524～0 bp及-468～0 bp片段的染色最深。在没有MeJA和SA诱导处理时,-524～0 bp和-468～0 bp 2个启动子片段启动的GUS活性最高,远高于-1 150～0、-800～0、-220～0 bp片段的活性,并且不是由于基因拷贝数而引起的（South-ern杂交结果）;-800～0 bp启动子片段启动的GUS活性受到MeJA和SA双重诱导,-1 150～0 bp启动子片段启动的GUS活性受到MeJA的诱导。[结论]在sm-Ngt启动子的-524～-220 bp存在提高启动子活性调控元件,-1 150～-524 bp存在抑制启动子活性的序列,并且存在MeJA和SA双重诱导启动子活性调控元件。     

拟南芥 AtNHX5基因启动子的克隆和组织定位分析

为了探明拟南芥内膜反向转运体 AtNHX5基因启动子（proNHX5）功能及基因的组织表达模式,从基因组中克隆 AtNHX5基因开放阅读框（ORF）上游侧翼调控区1 807 bp序列,发现该启动子具有典型启动子一般特征,不仅具有TATA-box、CAAT-box等核心元件,还含有与光响应、激素响应、逆境诱导响应和分生组织表达调控元件。构建 AtNHX5基因启动子与GUS的融合表达载体,通过农杆菌花序浸染法转化野生型拟南芥获得转基因植株。利用组织染色法鉴定转基因拟南芥的GUS表达模式,发现在子叶、下胚轴和花中有显著的GUS酶活性,成熟叶片和根中只有局部检测到GUS表达,在未成熟果荚中只有在果荚顶端和基部存在GUS酶活性,说明 AtNHX5基因启动子与GUS的融合表达载体成功构建且正常启动GUS基因表达,同时也表明, AtNHX5基因主要在这些部位表达,且表达具有时空特异性。     

拟南芥菜一个组织特异基因的克隆与研究

利用启动子陷阱技术,鉴定和分离了一个在拟南芥菜的维管束和花药的绒毡层细胞中高度特异性表达的基因。经鉴定,该基因全长为４．４ｋｂ,编码一种与ＲＮＡｈｅｌｉｃａｓｅＡ高度同源的蛋白。组织化学和原位杂交的证据表明,该基因只在维管束中少数细胞内转录、翻译并在原位发挥作用。     

转酿酒酵母HOG1基因拟南芥植株的获得与检测

HOG1(high osmolarity glycerol,HOG1)是酵母中参与耐高渗透压调控的重要基因。根据已发表的酿酒酵母序列,设计特异引物,扩增到完整的HOG1基因;构建植物表达载体pBI121-HOG1,通过农杆菌介导转化拟南芥,获得转化植株种子。对收获的T0代种子进行卡那霉素抗性筛选,并通过PCR和RT-PCR对抗性苗进行检测。结果表明,构建的载体成功转化拟南芥,并获得了13份转HOG1基因苗。     

拟南芥AtWRKY33基因启动子的克隆及表达分析

以野生型拟南芥为材料,采用PCR技术克隆得到了拟南芥AtWRKY33基因起始密码子ATG上游1 629 bp启动子序列,并利用该启动子驱动GUS基因在野生型拟南芥中表达,对获得的转基因拟南芥采用重金属Cd处理不同时间,进行GUS染色及定量分析。结果表明：AtWRKY33基因启动子与GUS融合表达载体成功构建并正常启动GUS基因表达;拟南芥植株中的AtWRKY33基因在根中大量表达;定性与定量实验均显示经重金属Cd处理后的拟南芥幼苗中AtWRKY33基因随着时间增加而被显著诱导表达。说明该基因响应重金属Cd胁迫。     

一个烟草糖基转移酶启动子在转基因烟草植株中的表达分析（摘要）

[目的]研究从烟草中克隆的1个受水杨酸和茉莉酸甲酯诱导表达的新的糖基转移酶基因（sm-Ngt）启动子部分缺失片段在烟草中的表达。[方法]以转sm-Ngt5个不同长度的5’端缺失的启动子与Gus基因融合植物表达载体的T1代转基因植株为材料,用茉莉酸甲酯（MeJA）和水杨酸（SA）处理16h后分别进行GUS组织化学染色和荧光定量法测定GUS酶活性,分析水杨酸和茉莉酸甲酯对sm-Ngt5个不同长度的5’端缺失的启动子表达的影响。[结果]在5个不同缺失片段启动子的转基因T1代生长30d的植株中,转-220～0bp片段的GUS染色最少,转-524～0bp及-468～0bp片段的染色最深。在没有MeJA和SA诱导处理时,-524～0bp和-468～0bp2个启动子片段启动的GUS活性最高,远高于-1150～0、-800～0、-220～0bp片段的活性,并且不是由于基因拷贝数而引起的（Southern杂交结果）;-800～0bp启动子片段启动的GUS活性受到MeJA和SA双重诱导,-1150～0bp启动子片段启动的GUS活性受到MeJA的诱导。[结论]在sm-Ngt启动子的-524～-220bp存在提高启动子活性调控元件,-1150～-524bp存在抑制启动子活性的序列,并且存在MeJA和SA双重诱导启动子活性调控元件。     

二穗短柄草DREB1G基因表达模式分析和在拟南芥中的异源过量表达

CBF/DREB基因是一类植物特异性转录因子,通过调控下游抗逆相关基因的表达,在植物逆境胁迫应答过程中发挥重要作用。为了研究新型的禾本科模式植物二穗短柄草DREB基因的功能,克隆BdDREB1G的cDNA序列,分析该基因在各种非生物胁迫条件下的表达,构建过表达载体,获得转基因拟南芥。结果表明:高温、低温和水杨酸胁迫处理显著诱导BdDREB1G的表达,暗示该基因响应高温和低温胁迫。初步观察结果说明,该与野生型拟南芥相比,转基因植株生长发育迟缓。这些为研究该基因响应非生物胁迫的功能奠定基础。     

垃圾渗滤液暴露对拟南芥的毒效应研究

为研究垃圾渗滤液的综合毒性,通过盆栽实验探讨了渗滤液对拟南芥早期、成熟期和后期生长发育的影响。结果表明:垃圾渗滤液会影响拟南芥整个生命期的生长情况,低浓度(0.1%)、短时间(24 h)的渗滤液暴露会促进拟南芥早期的萌发及根系生长,分别为对照的256%和324%,而高浓度(10%)、长时间(≥48 h)暴露则产生抑制作用,48 h的抑制效应分别为对照的67%和36%;在相同暴露时间下,芽长随暴露浓度变化不明显,仅在48 h呈现出差异,说明拟南芥幼苗的根系比芽更为敏感。不同浓度的渗滤液还会影响成熟期拟南芥的生长发育,诱导叶片氧化损伤并呈现浓度和时间双重依赖性,进而损伤其抗氧化防御系统。此外,高浓度(20%)渗滤液对晚期阶段拟南芥抽薹率和角果数的抑制效应较为明显(P0.01),在暴露15 d后分别为对照的45%和43%。研究结果说明拟南芥可有效、简单、重复性地监测渗滤液的毒性,为渗滤液的植物监测提供理论依据。