鲤鱼春季病毒血症病毒磷蛋白基因的克隆与原核表达

【目的】克隆鲤鱼春季病毒血症病毒（SVCV）的磷蛋白（P蛋白）基因,并对其进行原核表达,为进一步制备SVCV-P蛋白单克隆抗体及建立新的SVCV诊断方法奠定基础。【方法】采用RT-PCR方法扩增SVCV P蛋白基因,将其克隆入pET-28a(＋)载体中,获得原核重组表达质粒pET28-P,进行原核表达。将该重组原核表达质粒转化至大肠杆菌Rosetta感受态细胞中,用0.4 mmol/L IPTG进行诱导表达,用镍亲和层析试剂盒对表达产物进行纯化,分别用SDS-PAGE和Western Blotting方法对表达产物进行鉴定。【结果】成功克隆了SVCV-P蛋白基因,该基因长度为933 bp。成功构建了原核重组表达质粒pET28-P,其诱导表达产物分子质量约为37 ku;表达的重组P蛋白可被SVCV阳性血清所识别。【结论】成功克隆了SVCV P蛋白基因,获得了分子质量约为37 ku的重组P蛋白。     

山葡萄类黄酮-3-O-葡萄糖基转移酶基因的表达分析

为了探究VAm3GT蛋白表达和在山葡萄体内酶学特征及生物学功能,进一步证实克隆所获得目的基因的准确性。利用实时定量PCR法对山葡萄果皮8个不同转色时期类黄酮-3-O-葡萄糖基转移酶基因(VAm3GT)的表达量进行了分析,并通过双酶切、连接转化等方法将VAm3GT基因克隆到原核表达载体pET28a上,构建原核表达重组质粒pET28a-VAm3GT。重组质粒转化至E.coli BL21后经不同浓度的IPTG诱导,通过SDS-PAGE分析表明,在适宜的IPTG诱导浓度下,VAm3GT基因在大肠杆菌BL21中得到高效表达,表达的融合蛋白分子质量约为50.19 ku,成功构建其原核表达载体并使其在大肠杆菌中得到高效表达。     

兔出血症病毒衣壳蛋白VP60的原核表达及多克隆抗体制备

【目的】构建兔出血症病毒衣壳蛋白VP60基因的原核表达载体,进行原核表达并制备其蛋白抗体。【方法】以保存的VP60基因的质粒(pTeasy-VP60)为模版,用PCR方法获得VP60基因,并将其克隆到pET28a(+)载体上,构建重组表达载体pET28a(+)-VP60,酶切鉴定和测序验证后转入大肠杆菌BL21(DE3)中进行诱导表达,优化诱导表达时间和IPTG浓度;利用镍离子螯合层析纯化重组蛋白,并制备了高效价的抗VP60多克隆抗体。【结果】成功构建了兔出血症病毒衣壳蛋白VP60的原核表达质粒pET28a(+)-VP60,其在大肠杆菌中以包涵体形式高效表达,重组蛋白分子质量为60 ku,制备的多克隆抗体具有较强的免疫结合活性。【结论】成功实现了VP60基因的原核表达,制备了重组蛋白VP60的多克隆抗体,为进一步的VP60转基因研究奠定了基础。     

草胺膦抗性基因bar的原核表达与蛋白质纯化

通过PCR扩增,从pCAMBIA1300-bar质粒中获得bar基因编码区全长,经酶切鉴定和测序后证实,bar基因分离成功。用BamH和Hind酶切,将bar基因与原核表达载体pET28a(+)连接,构建成重组质粒pET28bar。将重组质粒pET28 bar转化大肠杆菌菌株BL21(DE3)后,获得高效表达。SDS-PAGE电泳分析显示,目的蛋白主要以包涵体形式存在,蛋白质分子量约为27 ku。将包涵体离心、洗涤和纯化后,得到高纯度的目的蛋白。该蛋白可以替代植物外源蛋白进行转bar基因产品的食用安全性检测,也可用于转bar基因产品ELISA检测的抗体制备。     

棉花GhGGPase2基因克隆、功能序列分析、原核表达及烟草的遗传转化

以棉花纤维组织为材料,根据NCBI棉花EST进行同源搜索、比对和序列拼接,经RT-PCR从陆地棉纤维组织中扩增得到L-半乳糖磷酸化酶基因(Gh GGPase2)的c DNA开放阅读框为1 335 bp,为包含445个氨基酸的蛋白质,分子质量约为49 ku。利用软件进行蛋白质序列分析,Gh GGPase2蛋白具有组氨酸三聚体(HIT)蛋白超家族的主要特性的结构域。进化树分析的结果表明棉花Gh GGPase2与猕猴桃Ad GGPase在进化上亲缘关系上较近。构建原核表达载体p ET28a-Gh GGPase2并转化大肠杆菌,将重组载体p ET28a-Gh GGPase2导入大肠杆菌BL21(DE3)中通过IPTG诱导表达后经过SDS-PAGE分析,显示成功获得分子质量为49 ku左右的诱导表达蛋白Gh GGPase2。将Gh GGPase2基因构建到植物真核表达载体p CAMBIA2300中,利用农杆菌通过叶盘法转化烟草,经PCR分子鉴定,获得了含Gh GGPase2转基因烟草植株。研究结果将为进一步阐明该基因的生物学功能奠定基础。     

烟草环斑病毒外壳蛋白基因片段原核表达载体的构建及表达

根据烟草环斑病毒外壳蛋白(TRSV-CP)基因的保守序列设计引物,采用RT-PCR方法,获得烟草环斑病毒基因组中编码外壳蛋白部分基因片段,将其插入原核表达载体pET28a中,获得重组表达质粒pET-CP,转化大肠杆菌BL21(DE3)后,利用IPTG诱导蛋白大量表达.重组蛋白经过Ni -NTA纯化后,SDS-PAGE和Western blotting分析结果表明,TRSV-CP基因在大肠杆菌中获得了高效表达,产生的融合蛋白分子质量约为34ku,并具有免疫学活性.以纯化的表达蛋白免疫新西兰大白兔,多抗血清效价达1:409600,可以与重组蛋白发生抗原抗体反应.     

新疆加工番茄上南方番茄病毒外壳蛋白基因的克隆与原核表达

【目的】克隆南方番茄病毒(STV)的外壳蛋白(CP)基因,构建其原核表达载体并进行诱导表达,为制备检测该病毒的高效价血清提供参考。【方法】利用一步法RT-PCR从新疆加工番茄上克隆STVCP基因,将其连接到原核表达载体pET-28a(+)上,获得重组质粒pET-28a-STV CP。将重组质粒转化大肠杆菌BL21后用IPTG进行诱导表达。【结果】成功克隆了STVCP基因,其长度为1 134bp。构建了原核重组表达质粒pET-28a-STV CP,其在1mmol/L IPTG诱导下,成功表达出分子质量约47ku的蛋白。【结论】成功克隆了STV CP基因,并诱导了pET-28a-STV CP重组蛋白的原核表达。     

棉花GhGGPase基因克隆、序列分析及原核表达

[目的]棉花GDP-L-半乳糖磷酸化酶(GhGGPase)基因的克隆、功能序列分析及原核表达.[方法]利用RT-PCR技术从棉花纤维中克隆棉花GhGGPase基因,进行生物信息学分析,构建原核表达载体pET28a-GhGGPase,转化大肠杆菌BL21 (DE3)并进行体外诱导表达,通过SDS-PAGE检测目的蛋白的表达.[结果]从陆地棉纤维组织中扩增得到L-半乳糖磷酸化酶基因的cDNA开放读码框为1350 bp,为包含450个氨基酸的蛋白质,理论分子质量为49 kDa.对氨基酸序列进行生物信息学分析,GhGGPase蛋白具有组氨酸三聚体(HIT)蛋白超家族的主要特性的结构域.进化树分析的表明棉花GhGGPase与柑橘CuGGPase在进化上亲缘关系上较近.成功构建了pET28a-GhGGPase原核表达载体;获得分子质量约为49kDa左右的重组蛋白GhGGPase.半定量RT-PCR的组织表达特异性分析表明GhGGPase基因与棉纤维的快速伸长发育密切相关.[结论]GhGGPase基因的克隆、序列分析和重组蛋白的诱导表达为深入研究该基因在棉纤维发育中的作用奠定了基础.     

兔岩藻糖基转移酶基因的克隆与原核表达

【目的】克隆兔岩藻糖基转移酶(FUT2)基因,并进行原核表达,为进一步研究RHDV的感染过程和致病机理奠定物质基础。【方法】从兔肌肉组织中抽提基因组DNA作为模板,PCR扩增出FUT2基因,然后将该基因亚克隆入原核表达载体pET30a中,获得重组原核表达质粒pET30a-FUT2。将该重组原核表达质粒转化E.coli BL21(DE3)感受态细胞,用IPTG进行诱导表达,分别用SDS-PAGE和Western-blot方法对表达产物进行鉴定。【结果】成功克隆了FUT2基因,该基因长度为1 044 bp。成功构建了原核重组表达质粒pET30a-FUT2,其诱导表达产物分子质量约为45 ku;表达的重组FUT2蛋白可与His标签抗体发生抗原抗体反应。【结论】成功克隆了兔岩藻糖基转移酶基因,获得了分子质量约为45 ku的FUT2蛋白。     

拟南芥Dof1基因原核表达载体的构建及应用

【目的】构建拟南芥转录因子Dof1基因的原核表达载体,进行原核表达并制备其蛋白抗体。【方法】利用RT-PCR方法从拟南芥中克隆转录因子Dof1基因,将其连接到原核表达载体pET-32a(+)上,构建重组原核表达载体pET32a(+)-Dof1,经酶切鉴定和测序验证后将其转化至大肠杆菌BL21中,经IPTG诱导后,纯化重组蛋白,以分离到的重组蛋白为抗原免疫小鼠制备抗血清,检测植物中Dof1蛋白表达水平。【结果】成功构建了拟南芥转录因子Dof1基因的原核表达载体pET32a(+)-Dof1,在28℃、1mmol/L IPTG诱导6h的大肠杆菌中可高效表达分子质量约为42ku的重组蛋白,其分泌到细胞质中,不形成包涵体;Western-blotting检测结果证明,制备的抗血清有较好的抗原-抗体识别反应。【结论】成功实现了Dof1基因的原核表达,制备出的重组蛋白Dof1多克隆抗体可用于植物Dof蛋白表达水平的检测,可为Dof1基因的进一步研究奠定基础。     

青海不同基因型蚕豆蛋白组成及清蛋白和球蛋白亚基的SDS-PAGE分析

采用连续提取蛋白法和SDS-PAGE技术分析了青海省11个不同基因型蚕豆的蛋白质组成以及清蛋白、球蛋白亚基的差异.结果表明:蚕豆蛋白主要由清蛋白、球蛋白、谷蛋白、醇溶蛋白和其他蛋白组成,不同基因型蚕豆的蛋白质含量及其组成存在一定的变异,其中清蛋白和球蛋白是蚕豆蛋白主要组成部分,占总蛋白的75.08%.不同基因型蚕豆的清蛋白和球蛋白亚基存在一定的差异,蚕豆清蛋白亚基由97、66+67、63、50、45、38+41、22ku等7个基本亚基组成外,还有96ku特异亚基;球蛋白亚基由63、56、52、47、22ku等5个基本亚基组成外,还有46ku的特异亚基.     

Observation on the modifying activity of the protein from Elytrzgia repens rhizome for ice crystal

In winter,spring and summer,the rhizome of wild Elytrzgia repens of Heilongjiang Province was selected to extract the soluble which whole protein and the apoplastic protein,and analyzed by SDS-PAGE.The result indicated that there were two specific polypeptides in two types protein from winter;their relative molecular weight were identified as 52 ku and 26 ku by analyzing software:the apoplastic protein from winter had the ability of modifing the growth of ice crystal which appeared hexagonal in shape observed with the phase-contrast photomicroscope.So the apoplastic protein from winter has the antifreeze characters and the 52 ku protein is more likely the antifreeze protein.     

偃麦草根茎蛋白质对冰晶修饰能力的观察

以黑龙江省野生偃麦草为试验材料,选取冬季、春季和夏季的偃麦草根茎,提取全蛋白和非质体蛋白,通过对3个时期蛋白质进行SDS-PAGE分析,发现全蛋白中有冬春季节特有的两条蛋白多肽,分子量分别是52 ku和26 ku,其中52 ku在非质体蛋白电泳谱中出现。同时在相差显微镜下观察到冬季非质体蛋白提取液具有将冰晶生长修饰为六角形的能力,说明偃麦草非质体蛋白内含有抗冻蛋白,而52 ku蛋白可能为抗冻蛋白。     

栽培方法对3:2式麦套中熟春棉棉铃发育的影响

研究结果表明：栽培方法可影响纤维伸长和纤维素累积,对纤维最终长度影响较小,育苗移栽和地膜覆盖有利于纤维伸长和纤维素累积,棉纤维ＩＡＡＯ活性变化也说明了这一点;地膜棉和播棉的棉籽脂肪,蛋白质累积差别较小,栽培方法对棉仁各种脂肪酸含量影响作用较小;３：２式两熟中熟春棉应选择地膜覆盖方法。     

棉纤维发育的遗传特性及相关基因的研究进展

棉纤维是纺织工业的重要原材料,在国民经济发展中具有举足轻重的地位。棉纤维细胞发育进程是一个多基因调控的、有序的系统发生过程,包括纤维起始期、伸长期、次生壁合成与加厚期和脱水成熟期等4个时期。随着遗传学、细胞学和分子生物学等学科的交叉融合,棉纤维生长发育调控分子机制的研究已成为研究热点。目前大多研究集中在运用遗传定位、基因克隆以及近年来兴起的深度测序等技术对棉纤维生长发育的调控机制进行解析。为了更加系统地了解棉纤维的发育过程,详细描述了棉纤维发育各时期的形态结构变化及特征,概述了经典遗传学在棉纤维遗传规律和基因定位方面的工作,以及从转录组学、蛋白组学及表观遗传学领域总结了近年来深度测序技术在棉花纤维组学研究方面的运用和取得的进展,并简述了棉纤维发育各个时期所涉及的相关调控基因。纤维的产量由棉纤维发育起始期决定,长度由伸长期决定,且伸长期的生化反应最为活跃,是影响纤维品质的关键时期。棉纤维遗传规律的研究发现,性状相同而基因型不同的材料,其棉纤维遗传模式也不同。纤维品质和产量相关的数量性状位点（QTL）遍布各个染色体,一些稳定的主效QTL（如FS1,qLI17和qFL-Chr14-3等）值得科研工作者进一步关注并有望在分子辅助选择中进行应用;质量性状基因的最新进展明确了显性基因Li₁和N₂,分别是肌动蛋白编码基因和转录因子MYB25-like。转录组学、蛋白组学及表观遗传学领域三方位的深度测序有效建立了RNA水平和蛋白质水平、编码区域和非编码序列之间的联系,并发现一系列的转录因子、编码转脂蛋白的基因、钙信号转导相关基因、多糖合成相关蛋白、大量的miRNA以及DNA甲基化作用等共同参与棉纤维发育过程。     

彩色棉抗氧化系统生理特征及纤维素累积对纤维品质的影响

【目的】研究黄河流域棉区不同纤维颜色棉花品种品质差异及棉铃在发育进程中生理活性变化,探索其品质形成的主要时期和相关影响因素,为彩色棉的品质改良提供理论依据。【方法】在大田试验条件下,以彩色棉品种中棉所51号（浅棕,CCRI 51,杂交棉）、中棉所81号（深棕,CCRI 81）、中棉所82号（深绿,CCRI 82）和普通棉（简称白棉,CK）国欣棉3号（GX 3）为试验材料,对各小区棉株中部第5-6果枝的一、二果节当日花进行挂牌,于收获期测定其纤维品质,并在花后10、15、20、30、40 d（days post anthesis,DPA）取挂牌棉铃,分别测定铃壳、棉籽、棉纤维的可溶性蛋白质含量、过氧化物酶（POD）活性、超氧化物歧化酶（SOD）活性、丙二醛（MDA）含量以及棉纤维的纤维素含量,研究不同颜色棉花品种纤维品质差异及棉铃发育特点,并对二者进行相关性分析。【结果】纤维上半部平均长度、整齐度指数以及断裂比强度三个指标均以杂交彩色棉（浅棕棉）最高,常规陆地棉三个指标的高低顺序为：白棉＞深棕棉＞深绿棉。白棉铃壳各时期可溶性蛋白质含量均显著高于彩色棉品种,各品种各时期差异均达到显著水平;白棉棉纤维可溶性蛋白质含量最大下降幅度时期为前期（10-20 DPA,降幅66.67%）,而彩色棉品种为后期（20-40 DPA,降幅为23.08%-61.19%）。各品种铃壳POD活性在花后10-20 DPA均有所上升,其中以深绿棉品种上升幅度最高,白棉和浅棕棉铃壳POD活性在10 DPA时显著高于深棕棉和深绿棉。白棉在10 DPA时铃壳和棉籽SOD活性均为最高,两棕色棉铃壳SOD活性在棉铃发育过程中均呈逐渐增加趋势;浅棕棉棉籽SOD活性在30-40 DPA时提高了53.18%,显著高于其他品种;深绿棉棉纤维SOD活性降低时期出现得较其他品种早10 d。白棉棉籽MDA含量在花后20-30 DPA时下降,而彩色棉均升高。浅棕棉纤维素快速累积开始期最早,持续期最长,白棉较深棕棉和深绿棉的纤维素快速累积起始期早3 d,持续期长1-5 d。10 DPA时棉籽MDA含量与棉纤维长度和断裂比强度显著负相关,铃壳POD活性与纤维长度呈显著正相关,纤维素快速累积持续期与纤维长度及强度显著正相关;20 DPA时棉纤维可溶性蛋白质含量、30 DPA时棉籽MDA含量以及纤维素快速累积起始期与整齐度呈显著负相关;20 DPA时棉籽MDA含量、30 DPA时铃壳可溶性蛋白质含量、40 DPA时棉纤维MDA含量与马克隆值呈显著正相关;40 DPA时棉籽可溶性蛋白质含量、20 DPA时棉纤维POD活性与伸长率显著正相关。【结论】彩色棉棉铃相比于白棉,较低的抗氧化酶系统活性在纤维发育前期（0-20 DPA）阻碍了纤维初生壁的形成及生长,在纤维发育后期（20-40 DPA）促进了色素类物质在次生壁沉积,这就降低了纤维素在次生壁的积累。彩色棉较短的纤维素累积持续期以及较晚的纤维素快速累积起始期是造成彩色棉品质低的直接原因。     

棉花陆海渐渗杂交群体纤维品质性状的QTL定位

【目的】有效发掘利用海岛棉优异性状基因,拓宽陆地棉栽培种遗传基础。【方法】采用新疆主栽早中熟陆地棉品种新陆中60号为母本,与优质海岛棉品种新海41号为父本杂交,并以新陆中60号为轮回亲本构建出由151个BC₁F₁单株组成的回交群体,利用SSR分子标记和Join Map4.0软件构建遗传连锁图谱,采用复合区间作图法(CIM)对BC₁F₂纤维品质性状的进行QTL定位。【结果】构建的遗传连锁图谱包含52个多态性标记、14个连锁群,该图谱总长824 cM,覆盖棉花基因组的18.5%;最长的连锁群为150.3 cM,包含6个标记,最短的为0.3 cM,包含2个标记。检测到1个与纤维上半部平均长度相关的QTL,qFL-Chr14-1,定位在第14号染色体上,解释表型变异8.59%。【结论】筛选的与优质QTL位点相关SSR标记可应用于棉花优质分子标记辅助选择。     

海岛棉GbMYB25基因的克隆及表达分析

根据陆地棉GhMYB25的序列,设计1对引物,通过RT-PCR技术从海岛棉品种新海21号中克隆了1个同源基因,命名为GbMYB25。GbMYB25基因具有1个930bp的开放阅读框,编码309个氨基酸,预测分子量约为34.762ku,等电点为8.08,推测的氨基酸序列中含有2个高度保守的SANT结构域。GbMYB25基因序列包含2个内含子。氨基酸序列比对表明,该蛋白和其他高等植物的MYB蛋白有较高的同源性。进化树分析表明,GbMYB25基因和陆地棉GhMYB25基因处在同一进化树分支。亚细胞定位表明GbMYB25基因在细胞核中表达,实时荧光定量PCR结果表明GbMYB25基因在胚珠(0doa)、纤维(5dpa)和叶片中的表达量较高。以上结果表明,GbMYB25转录因子可能参与棉花纤维发育。     

棉花生长素结合蛋白(GhABP)的初步研究

本文利用从棉花(GossypiumhirsutumL.)纤维中获得的生长素结合蛋白(auxin-bindingprotein)基因cDNA全长,经生物信息学分析,构建了由棉花纤维特异表达启动子E6驱动的该基因过量表达载体(pBE6::GhABP1(GUS))。通过农杆菌介导法将该基因转化棉花,获得了经PCR检测的阳性胚性愈伤组织。为近一步研究生长素结合蛋白在棉纤维发育过程中的功能奠定了基础。     

彩色棉纤维中矿质元素含量与纤维品质形成的关系

【目的】探讨彩色棉纤维中大量元素含量与彩色棉纤维品质形成的关系。【方法】选用棕色棉(X008)、绿色棉(S029)和白色棉(Xuzhou142)为材料,对彩色棉纤维发育过程(开花后20—50d)中大量元素(N,P,K,Ca和Mg)、黄酮色素和纤维素以及纤维品质指标进行分析。【结果】(1)彩色棉纤维细胞中纤维素的含量显著偏低,比白色棉降低15%左右;黄酮色素含量较高,比白色棉纤维高4—10倍;大量元素的含量(除K)明显偏高,比白色棉提高1—2倍;(2)相关性分析结果显示,成熟彩色棉纤维的品质指标与纤维中纤维素含量呈极显著的正相关,与纤维中总黄酮含量呈极显著负相关;棉纤维中大量元素N、P和Ca的含量与纤维素含量呈极显著的负相关,与纤维中黄酮色素含量呈极显著的正相关。【结论】彩色棉纤维中N、P和Ca元素含量的提高可能有利于黄酮色素的合成,而黄酮色素的积累使得彩色棉纤维中纤维素含量降低,这可能是引起彩色棉纤维品质偏差的原因之一。