柽柳甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因的克隆与表达分析

从柽柳(Tamarix hispida)cDNA文库中分离出甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因(ThGAPDH)全长cDNA序列,该基因全长1294bp。其中:5′非翻译区84bp,3′非翻译区184bp,开放阅读框1206bp,编码含341个氨基酸的蛋白质,编码蛋白的相对分子质量为37200,理论等电点(pI)为6.97。采用实时定量RT-PCR方法研究了刚毛柽柳在PEG、NaCl、NaHCO3及CdCl2胁迫下不同时间该基因ThGAPDH的表达模式。结果表明:PEG、NaCl及CdCl2处理均能诱导ThGAPDH基因在根中的表达而抑制其在茎和叶中的表达,而NaHCO3处理均能诱导该基因在根、茎、叶中的表达。基因ThGAPDH的cDNA序列在GenBank中的登录号为GQ478708。     

胞质甘油醛-3-磷酸脱氢酶GAPC2参与番茄果实成熟的调控

【目的】研究异源胞质甘油醛-3-磷酸脱氢酶2(cytoplasm glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPC2)对番茄果实成熟的影响。【方法】构建“红颜”草莓FaGAPC2过表达载体,采用瞬时过表达技术在樱桃番茄“罗纳”的破色期过表达FaGAPC2。【结果】FaGAPC2的表达量为对照组的2.39倍,过表达FaGAPC2能够显著抑制番茄果皮颜色变红并显著提高其硬度（3.76N）、降低可溶性糖含量,其类胡萝卜素含量和总叶绿素含量分别是对照组的0.37倍和1.5倍。进一步通过实时荧光定量分析结果表明,过表达FaGAPC2较对照能显著降低乙烯合成途径中ACO1(12.89倍)、ACO3(3.87倍)和ERF1(3.51倍);类胡萝卜合成途径中PSY1(12.39倍)、CYC-B(1.49倍);果实成熟相关基因E4(4.48倍)、PG(41.35倍)和MADS转录因子RIN(6.67倍)的表达量,其中果实成熟相关基因E8、LOXB相比于对照表达量几乎为零。【结论】表明FaGAPC2作为一个负调节因子参与番茄果实成熟的调控。     

毛竹阿拉伯糖-5-磷酸异构酶的基因克隆、原核表达及纯化

毛竹Phyllostachys edulis阿拉伯糖-5-磷酸异构酶（PeKdsD）是2-酮-3-脱氧辛糖酸（KDO）生物合成途径的第1个关键酶。采用逆转录实时聚合酶链式反应（qRT-PCR）克隆得到毛竹KdsD基因。该基因cDNA全长1 038 bp,编码346个氨基酸;对不同物种来源的KdsD氨基酸序列进行比对和系统进化树分析。结果表明:毛竹的KdsD与玉米Zea mays等植物来源的KdsD有很高的序列一致性,而与微生物来源的KdsD序列一致性较低。毛竹不同组织实时荧光定量聚合酶链式反应（qRT-PCR）结果表明:PeKdsD基因在叶中表达量远远高于其他组织。在大肠埃希菌Escherichia coli原核表达系统中获得了KdsD的可溶性高表达蛋白,将大量表达的重组蛋白经过Ni-NTA亲和层析和分子筛层析（SEC）进行纯化,发现KdsD在溶液（30 mmol·L-1三羟甲基氨基甲烷pH 8.0,200 mmol·L-1氯化钠）中以多种聚体的形式存在;酶学性质测定的结果表明:毛竹KdsD酶最适pH值为pH 8.5,最适作用温度为37℃。此结果为后期研究植物KdsD蛋白的结构与功能奠定了基础。图7参17     

卵形鲳鲹 JAK3 蛋白的原核表达与纯化

【目的】纯化获取卵形鲳鲹(Trachinotus ovatus)JAK3(TroJAK3)重组蛋白,为了解TroJAK3蛋白功能、相互作用及抗体制备奠定基础。【方法】应用分子生物学技术构建重组质粒pET-32a-TroJAK3,转化大肠杆菌BL21感受态细胞,经IPTG诱导表达,SDS-PAGE和Western blot检测TroJAK3重组蛋白表达情况。【结果】PCR扩增片段长度为3 333 bp,经双酶切鉴定、测序确认序列和开放阅读框正确,结果显示成功构建重组质粒pET-32a-TroJAK3。经终浓度为1 mmol/L IPTG 37℃诱导4 h后进行SDS-PAGE检测,结果表明TroJAK3重组蛋白以包涵体形式大量表达,分子量约为140 ku。经Ni-IDA树脂柱纯化,获得纯化的重组蛋白。Western blot检测结果显示有140 ku的条带,表明TroJAK3重组蛋白能被抗His抗体识别。【结论】成功构建了重组质粒pET-32a-TroJAK3,纯化得到高纯度的TroJAK3融合蛋白。     

拟南芥SEPALLATA3蛋白质原核表达与纯化

SEPALLATA3(SEP3)属于花器官建成ABCE模型中的E类基因,为了揭示SEP3蛋白是如何形成多聚体的,以及多聚体与其生物学功能之间的联系,开展了拟南芥Arabidopsis thaliana AtSEP3蛋白质体外可溶性表达实验,构建了原核表达载体,并在大肠埃希菌Escherichia coli细胞中进行重组蛋白的诱导表达。从蛋白不同的结构域、诱导时间和诱导温度等方面对蛋白的可溶性表达进行了分析。最后以pET-15b为表达载体,大肠埃希菌表达菌株E.coli‘Rosetta’为宿主菌株,22℃诱导表达15 h,获得不同片段的AtSEP3可溶性蛋白。通过镍柱及分子层析色谱柱分离纯化,表明AtSEP3蛋白以四聚体形式存在。图4参13     

牛mettl3基因的原核表达与蛋白纯化

m~6A甲基转移酶(methyltransferase-like protein 3,METTL3)可调控m RNA的m6A甲基化水平,调节细胞蛋白质合成,实验室前期发现METTL3为乳腺上皮细胞乳合成重要调节分子,发挥泌乳调节作用。目前尚不清楚METTL3分子结构基础及其参与的调节机制。为揭示METTL3结构与功能关系,对METTL3蛋白作原核表达及纯化。研究采用PCR方法扩增牛mettl3基因完整CDS区,将CDS区插入原核表达载体p GEX-4T-1,异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导METTL3蛋白大量表达,用8 mol·L-1尿素裂解包涵体,利用GST蛋白纯化试剂盒纯化诱导获得METTL3蛋白。SDS-PAGE证实GST-METTL3融合蛋白存在于包涵体内,试验获得高纯度GST-METTL3融合蛋白,为进一步研究METTL3蛋白在奶牛泌乳中作用提供重要依据。     

毛竹KDO8PS的原核表达纯化及晶体生长

3-deoxy-D-manno-octulosonate(KDO)8-phosphate synthase(KDO8PS)[EC 4.1.2.16]是KDO生物合成途径中的关键酶。采用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)方法,以毛竹Phyllostachys edulis新鲜实生苗为材料,分离得到竹子KDO8PS基因。通过对不同物种来源的KDO8PS进行氨基酸序列比对分析和半定量RT-PCR技术对该基因进行组织特异性表达分析。将PeKDO8PS基因构建入原核表达载体pET-28a,并在大肠埃希菌Escherichia coli原核表达系统中获得了KDO8PS的可溶性高表达。经nickel亲和层析和分子筛纯化2种方法对表达蛋白进行纯化。结果分析表明:该基因编码区全长876 bp,可编码291个氨基酸。PeKDO8PS与拟南芥Arabidopsis thaliana等植物来源的KDSA2的基因有很高序列一致性,而与微生物来源的KDO8PS序列一致性较低。分析毛竹各组织中KDO8PS基因的表达结果表明,该基因在根、茎和叶片中均有表达,但在根中相对表达量较高,此表达模式亦同拟南芥AtKDSA2类似。另外,发现KDO8PS在溶液(30 mmol·L-1Tris-HCl pH 8.0,200 mmol·L-1氯化钠)中以二聚体的形式存在,并且初步筛选出该酶晶体生长条件。此结果为PeKDO8PS蛋白的最终结构分析奠定了基础。     

辣椒疫霉菌葡聚糖酶抑制蛋白的原核表达、纯化及结晶

葡聚糖酶抑制蛋白(GIP)是辣椒疫霉菌在病理环境下诱导产生的一类蛋白,是病原菌抗性蛋白的一种。本研究根据辣椒疫霉菌全基因组序列,通过生物信息学分析、序列比对获得葡聚糖酶抑制蛋白全长基因序列。以辣椒疫霉高致病菌株SD33全基因组为模板扩增GIP基因cDNA,并对其进行相关生物信息学分析。基因经测序验证后与载体pET28a(+)连接,构建好的重组质粒转化大肠杆菌(Escherichia coli Rosetta),用IPTG诱导表达重组蛋白6×His-GIP。重组蛋白在5 mol/L尿素变性环境下进行亲和层析纯化,对纯蛋白进行透析、复性、浓缩后进行分子排阻层析纯化,并对获得的纯蛋白进行蛋白结晶试验,为进一步阐明GIP作用机理奠定基础。     

川西高原黑唇鼠兔乳酸脱氢酶C基因的原核表达

[目的]研究黑唇鼠兔乳酸脱氢酶C（LDH-C）基因的原核表达及重组蛋白的纯化。[方法]采用RT-PCR方法克隆鼠兔LDH-C基因,并将其连接到表达载体pET-32a上,构建鼠兔LDH-C基因的大肠杆菌BL21（DE3）工程菌,通过IPTG诱导表达,表达产物用SDS-PAGE进行分析,使用亲和层析方法进行蛋白纯化。[结果]RT-PCR扩增出1条约1.0 kbp的条带,与预期结果相符;重组表达载体经PCR和双酶切鉴定,产生1个约1.0 kbp的目的片段,表明表达载体构建成功;表达产物经SDS-PAGE分析,得到了分子量略大于45.0kDa以包涵体形式存在的融合蛋白;通过镍亲和层析柱进行纯化,得到了较纯的融合蛋白。[结论]黑唇鼠兔LDH-C基因被成功克隆和表达。 更多还原     

戊型肝炎病毒ORF3蛋白的原核表达和纯化

戊型肝炎病毒(HEV)是一种无包膜、单股正链RNA病毒,其基因组长约7.2kb,包含3个开放阅读框(ORF)。ORF3位于ORF1和ORF2之间,编码含有123个氨基酸的磷酸化蛋白。本文通过PCR扩增HEV ORF3基因,将扩增产物双酶切后,插入具有相同多克隆位点的pET28a(+)、pGEX-4T-1和pET-43.1a(+)载体中,构建pET28a-ORF3、pGEX-4T-1-ORF3和pET43a-ORF3原核表达载体。将重组质粒转入E.coli DH5α,菌液PCR筛选阳性结果。序列测定正确后,将其转化E.coli BL21(DE3),加入IPTG诱导表达。SDS-PAGE分析目的蛋白表达后,进一步利用亲和层析法纯化目的蛋白。结果表明,成功构建了原核表达载体pET28a-ORF3、pGEX-4T-1-ORF3和pET43a-ORF3,所构建的载体均可在宿主菌E.coli BL21(DE3)中表达ORF3蛋白。通过Ni-TNA和GSH-Sepharose层析纯化分别分析3种融合蛋白,发现pET43a-ORF3最适合获得纯化蛋白的ORF3蛋白,这为进一步研究该蛋白的生物学功能奠定了基础。     

抗自溶烟草蚀纹病毒蛋白酶的原核表达和纯化及活性分析

利用QuikChange Site Directed Mutagenesis Kit将自溶性烟草蚀纹病毒蛋白酶（tobacco etch virus Protease,TEVP）219位的Ser（S）突变为Val（V）,经测序验证的S219V突变质粒pMAL TEVPS219V电转化大肠杆菌BL21 Star（DE3）,并优化异丙基硫代β D半乳糖苷（IPTG）诱导浓度、温度、时间对TEVP表达的影响。结果表明,突变的TEVP 表达最适条件为24 ℃,0.75 mmol/L IPTG诱导11 h。经金属离子螯合层析纯化得到高纯度,高活性的突变TEVP蛋白酶,比活力为1 048 U/mg。每升菌液可纯化17.2 mg目标蛋白。     

稻瘟病菌3-磷酸甘油醛脱氢酶基因(gpd)的快速克隆(英文)

本文描述了一种简便而有效的克隆基因未知５＇和３＇末端序列的方法,并用此方法克隆了稻瘟病菌的３－磷酸甘油醛脱氢酶基因（ｇｐｄ）．即通过比较１２种真菌的已知ｇｐｄ基因序列,寻找内部的保守区段,设计并合成一对特异性引物．引物Ｐ１为靠近基因５＇端的一个特异性序列,引物Ｐ２则与３＇端的一段特异性序列互补．以双链ｃＤＮＡ－ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔⅡＳＫ载体连接物为模板,利用基因的特异性引物Ｐ１和载体上的标准测序引物Ｔ７,ＰＣＲ扩增出包含ｃＤＮＡ３＇末端的序列;利用特异性引物Ｐ２和标准测序引物Ｔ３,扩增出包含ｃＤＮＡ５＇末端的序列．将两片段分别克隆、测序和合并后,得到全长１０１１ｂｐ的稻瘟病菌３－磷酸甘油醛脱氢酶基因（ｇｐｄ）的编码区序列．该序列及其相应的氨基酸序列与已知真菌的ｇｐｄ基因序列有着６１．４％－８６．６％和６４．６％－８６．３％的同源性．特别在酶的活性功能区不同真菌间有着近乎相同的氨基酸序列．     

家蚕丙酮酸脱氢酶激酶基因的克隆与原核表达

丙酮酸脱氢酶激酶(PDK)在糖代谢的调控中具有重要的作用,为了研究家蚕PDK(BmPDK)的功能,以蚁蚕总RNA为模板,应用RT-PCR技术扩增了BmPDK的cDNA,构建原核表达载体pET-28a-BmPDK进行表达和纯化。结果显示,克隆的BmPDK全长cDNA与NCBI公布的序列一致;Western bloting检测表明BmPDK蛋白得到了表达,且主要以包涵体形式存在;IPTG最佳诱导浓度为0.8 mmol/L、最佳诱导时间为8 h;2,6-二氯吲哚酚法间接测定结果表明,纯化的BmPDK蛋白具有酶活性。     

猪链球菌2型epf基因的原核表达及其蛋白纯化

为了克隆、表达SS2菌株轲基因片段,分析蛋白活性,根据GenBank SS2 epf基因序列设计引物,克隆epf基因片段并进行序列分析,构建原核表达质粒pGEX4T-2-epf,在大肠杆菌中诱导带有GST标签的融合蛋白rEF-GST的表达;亲和层析法纯化融合蛋白rEF-GST,用凝血酶切除重组蛋白中的GST,获得纯化的EF抗原。经Westernblot鉴定,EF可与SS2多克隆抗血清发生特异性反应。     

纳豆芽孢杆菌谷氨酸脱氢酶基因的克隆、表达及酶活性测定

纳豆芽孢杆菌谷氨酸脱氢酶(GDH)是纳豆发酵产氨的关键酶.本文以纳豆芽孢杆菌基因组DNA为模板,根据枯草芽孢杆菌的GDH编码基因(RocG)序列设计引物,进行PCR扩增,再经pMD19-T质粒TA克隆,获得了全长为1275 bp、与RocG基因同源性为98%的纳豆芽孢杆菌GDH的编码基因.构建原核表达载体pET28a-GDH,转化至E.coli BL21(DE3)进行体外诱导表达.表达的包涵体在超声破菌、变性、纯化和复性后,经SDS-PAGE分析得到了47 kDa的特异条带.纳豆芽孢杆菌GDH同时具有NAD+和NADP+依赖活性,酶活分别为6.7723 U·mg-1蛋白和9.4205 U·mg-1蛋白.     

水稻VDAC3蛋白的可溶性外源表达及纯化

[目的]获得外源表达的可溶性水稻VDAC3蛋白.[方法]将osvdac3基因克隆到含有GST标签的pGEX-4T-1原核表达载体中,转化入BL21表达菌株,经IPTG诱导,并使用SDS-PAGE和Western Blot检测分析表达产物,通过Glutathione Resin亲和层析系统纯化获得较纯的目的蛋白.[结果]试验成功构建了pGEX-4T-1-osvdac3原核表达载体并转化大肠杆菌.通过SDS-PAGE和Western Blot试验证实56 kD处的蛋白条带是具有可溶性表达的VDAC3蛋白.[结论]经Glutathione Resin亲和层析系统纯化得到可溶性带GST标签的VDAC3蛋白.该研究结果为水稻VDAC蛋白的功能研究进一步奠定了基础.     

O型口蹄疫病毒VP1基因原核表达及蛋白纯化

以O型FMDV重组质粒pMD18T-O-VP1为模板,利用PCR技术扩增得到O型FMDV-VP1基因片段,将此基因片段与原核表达载体pET32a连接构建重组表达载体pEq32a-O-VP1,经PCR和测序鉴定后,用WIG诱导归1基因的表达,收集不同诱导时间的菌液,进行SDS-PAGE电泳,摸索掌握最佳诱导时间,切取最佳诱导时间电泳胶片做Westem-blotting,分析检验表达产物与其抗血清的反应性。结果显示,分子量约为45ku的蛋白条带反应显著,能被口蹄疫阳性血清识别,表明FMDV-VP1基因在大肠杆菌中得到高效表达,纯化复性的表达蛋白有望开发为诊断抗原和多肽疫苗。     

小鼠激活素受体相互作用蛋白2的原核表达及抗血清制备

[目的]克隆小鼠激活素受体相互作用蛋白2（ARIP2）cDNA序列,利用大肠杆菌表达ARIP2,制备兔抗小鼠ARIP2的多克隆抗血清。[方法]采用RT-PER方法,将小鼠ARIP2基因克隆到pET-32a（＋）质粒,构建ARIP2原核表达载体并转化到大肠杆菌,IgrG诱导融合蛋白的表达,经亲和层析纯化获得可溶性重组蛋白,免疫家兔后制备ARIP2抗血清,分别采用ELISA,Western blot检测抗体效价和特异性。[结果]测序结果表明重组质粒pET32a（＋）-ARIP2构建成功;SDS-PAGE分析表明获得的重组蛋白为可溶蛋白;经过亲和层析后得到有效分离;Elisa法测定的抗血清效价为1：50000;Westernblot鉴定结果表明抗血清能与目的蛋白特异性结合。[结论]成功将ARIP2进行了原核表达并制备了高效价、高特异性的兔抗小鼠ARIP2抗血清,为进一步研究ARIP2功能提供了有力工具。     

飞蝗几丁质脱乙酰基酶的真核表达、亲和纯化及酶活性

【目的】体外真核表达飞蝗(Locusta migratoria)几丁质脱乙酰基酶1和2(chitin deacetylase 1and 2,LmCDA1和LmCDA2)并测定其酶活性,为进一步明确飞蝗LmCDA1和LmCDA2在几丁质降解途径中的生理功能及研发新型绿色环保杀虫剂提供依据。【方法】使用BLASTP和SMART软件在线预测LmCDA1、LmCDA2a和LmCDA2b的结构域;PCR克隆获得目的基因LmCDA1、LmCDA2a和LmCDA2b的全长序列,并分别构建p Fast Bac-LmCDAs重组质粒,转化获得Bacmid重组质粒后,转染至昆虫Sf9细胞进行目的蛋白的体外表达。采用Western blot技术对目的蛋白表达情况进行检测,并通过Ni-NTA亲和层析柱和阴离子(Q-Sepharose)交换层析柱对蛋白产物进行纯化。12%SDS-PAGE检测蛋白纯度后,采用分光光度法以对硝基乙酰苯胺为底物检测目的蛋白的酶活性,T检验法对LmCDA2a和LmCDA2b酶活力进行差异显著性分析。【结果】BLASTP和SMART软件预测结果显示LmCDA1、LmCDA2a和LmCDA2b均含有4个结构域:N-端信号肽(signal peptide)、几丁质结合域(chitin binding peritrophin-A,Ch BD)、A型低密度脂蛋白受体结构域(low-density lipoprotein receptor class A,LDLa)和脱乙酰基酶催化结构域(catalytic domain,CDA)。3个基因的几丁质结合域中均包含6个保守的半胱氨酸。LmCDA2a和LmCDA2b两个剪切子除在其第3个半胱氨酸和第4个半胱氨酸之间(67—84 aa)的氨基酸数目和组成及在第4和第6个半胱氨酸(84—106 aa)之间的序列存在差异外,其余部分完全一致。Western blot结果显示LmCDA1、LmCDA2a和LmCDA2b的蛋白分子量约为61 k D左右,与预测的蛋白分子量大小一致,表明Bacmid重组质粒在昆虫Sf9细胞中成功表达。采用12%SDS-PAGE胶电泳对各蛋白纯化组分进行检测,结果显示Ni-NTA亲和层析柱可将大部分杂蛋白洗脱,而Q-Sepharose交换层析柱可对蛋白进行更彻底地纯化。酶活检测结果显示LmCDA1、LmCDA2a和LmCDA2b的酶活力分别为0.268、0.354、0.228 U·μL~(-1),并且LmCDA2a和LmCDA2b的酶活力存在显著差异。【结论】体外真核表达LmCDA1、LmCDA2a和LmCDA2b蛋白并进行酶活测定后发现三者均具有几丁质脱乙酰基酶活力,且LmCDA2a和LmCDA2b的酶活力具有显著性差异,推测前期研究中沉默LmCDA2a和LmCDA2b后分别出现不同飞蝗表型的原因可能是由于它们酶活力存在显著性差异。