NDV La Sota株三个病毒克隆株间生物学特性的比较研究

为比较新城疫病毒(NDV)La Sota株不同克隆株之间的生物学特性,本研究通过挑取细胞病变区对LaSota株病毒进行纯化,并获得了3个病毒克隆株。通过血凝素热稳定性试验、病毒复制动力学试验和免疫原性试验,对3个病毒克隆株进行分析比较。结果显示,不同的病毒克隆株间在这些生物学特性上存在着不同程度的差异,表明为了获得性质均一、稳定的病毒,有必要进行病毒的纯化,并根据实验目的进行比较取舍。     

两株新城疫病毒山东分离株的克隆及遗传变异分析

本试验根据已发表的新城疫病毒（NDV）的F基因序列设计特异性引物，对山东地区两株NDV流行株的F基因进行了克隆与序列分析，分别扩增到了A株和B株F蛋白编码区全基因，ORF全长均为1662bp。应用分子生物学软件对A株和B株的核苷酸序列和推导的氨基酸序列进行了分析。两毒株核苷酸序列同源率为87％，都编码553个氨基酸，氨基酸同源率为91％。与部分已发表的毒株相比：A株与－株同源率最高，为98％，B株与JS鹅株同源率最高，为98％。分离株都具有3个强疏水区。A株、B株裂解区氨基酸序列符合强毒株特点，二者均为强毒株。从基因分型情况看，A株属于基因Ⅸ，B株属于基因Ⅶ。A株与F48E9株遗传距离最近，B株与JS鹅株遗传距离最近。     

狂犬病病毒Flury-LEP株全基因组的克隆与序列分析

用RT-PCR法获得了涵盖狂犬病病毒Flury LEP株全基因组的3个重叠的cDNA片段,将获得的cDNA片段分别克隆至pMD18-T Simple载体上并进行序列测定,对测序结果进行拼接,得到全长cDNA序列,结果表明,Flury LEP株全长为11 924 bp,3-′UTR长58 bp,编码区核苷酸为11 723 bp,5-′UTR为131 bp。     

鸡马立克火鸡疱疹病毒（Fc—126株）的标准化研究：Ⅵ.HVT克隆株的稳定？…

对ＨＶＴ克隆株进行了稳定性测定，结果表明克隆株稀释后室温存放１小时，病毒滴度损失不超过３０％，符合有关规定。在－７０℃和－２０℃下保存，克隆株保存期分别至少可达３年和２．５年。用克隆株试制的３批产品在野外使用效果良好，无任何不良反应。     

鸡马立克火鸡疱疹病毒（Fc—126株）的标准化研究：Ⅳ.HVT克隆株（330801…

ＨＶＴ克隆株（大斑３３０８０１）大剂量（１０头剂）免疫１日龄有母源抗体的雏鸡，在１０周的观察期内未见任何不良反应和肉眼可见病变，半数保护量（ＰＤ５０）为６０ＰＦＵ。病毒的免疫剂量（ＰＦＵ数）与抗攻毒保护力及与雏鸡的增重呈正相关。     

猪圆环病毒2型BF株感染性分子克隆系列突变株的构建

仔猪断奶后多系统衰弱综合征(postweaningmultisystemic wasting syndrome,PMWS)最早发生于1991年,1997年首次证实[1],是近年来新发生的仔猪的一种新病,给养猪业造成了重大的经济损失。PMWS主要发生在5至12周龄的仔猪,最常见的临床症状包括生长衰竭或停滞、呼吸困难、淋巴结肿大、腹泻、皮肤苍白及黄疸、渐进性消瘦和腹泻。研究表明PMWS在中国普遍存在[2-3]。猪圆环病毒2型(porcine circovirus type 2,PCV2)目前被认为是PMWS的主要病原,该病毒属于圆环病毒科,是单股环状DNA病毒,直径17nm,呈二十面体对称,无囊膜。基因组全长1 767bp…     

猪传染性胃肠炎病毒国内分离株S基因克隆及与国外分离株的同源性比较

用猪睾丸细胞增殖并扩增猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）国内分离株TH－98，根据基因库中已发表的TGEV S基因cDNA序列，利用Oligo软件设计并合成2对引物，进行逆转录聚合酶合酶链反应（RT－PCR），扩增出2.3kb和2.1kb2个片段，即Sa与Sb。将Sa与Sb先后插入到pUC18质粒载体上的EcoRⅠ和PstⅠ多克隆位点上，构建了重组质粒pUC-S，根据TGEV S基因位点和pUC18的物理图谱，用相应的限制性内切酶进行酶进行酶切及套式PCR方法鉴定，分析，证明克隆的pUC-S为TGEV S基因，同时对pUC-S进行序列测定分析，并与来自美国，英国和日本的5个毒株进行核苷酸及编码氨基酸同源性比较，证明了S基因的高度保守性。     

中国株猪瘟兔化弱毒克隆毒的研究

采用终点稀释单细胞微量培养法对中国株猪瘟哆化弱毒（Ｃ株）进行克隆，获１０个克隆株；保持原Ｃ株的免疫原性和其他优良特性；在某些方面并有所提高。随机取６号克隆毒（Ｃ６）进行系列试验，结果表明：（１）对牛睾丸细胞敏感，共收毒批次和合格批次为１５／１９（７９．９％）（２）用兔增殖毒共归兔６４只，发率为９０．６％，用睾丸细胞增殖毒对３８只兔热反应率为８９．４７％，（３）按“规程”安检和增大一倍量对猪均无不良     

口蹄疫OX株全基因组cDNA的分子克隆、序列测定及分析

采用RT-PCR法对FMDV OX株基因组全序列进行了分子克隆与测序。结果表明不含poly(C)序列和poly(A)尾巴的OX株基因组全序列长8104nt,开放读码框(ORF)长6969nt、编码2322aa,5’UTR长1040nt,3’UTR长95nt。应用分子生物学软件将OX株与FMDV其它参考毒株进行序列比较,并对其基因特征进行分析。结果显示,OX株与OTwyl／97的核苷酸同源性最高,在基因组功能未知区和3A编码区具有两处明显的缺失现象,其一是在3A编码区有30nt的连续缺失,这与OTwyl／97株相同,其二是在功能未知区域有44nt的缺失,这与OTwyl／97株相同,与OAkesu58相似(43nt缺失)。     

新城疫弱毒耐热B株蚀斑克隆纯化与免疫原性研究

通过鸡胚终点稀释法与细胞蚀斑法纯化获得新城疫病毒克隆株（NDVB-Clone4株）,结果显示,NDVB-Clone4株的免疫原性最好。原毒和鸡胚终点稀释法纯化毒滴鼻/点眼免疫1000EID50剂量组鸡10/10攻毒保护,而蚀斑纯化毒滴鼻/点眼免疫300EID50剂量组鸡10/10攻毒保护。     

伪狂犬病病毒Fa株gD基因的克隆及序列分析

本研究从含有伪狂犬病病毒(Pseudorabies virus，PRV)Ea株gD基因BamHI 6.6Kb片段的重组质粒pUCB7中分别亚克隆gD基因的上、下游片段，并对上游片段进一步改造，去掉gD基因上游的非编码序列，构建了含完整gD基因编码区的重组质粒pBRgDI，并利用基因内部的限制性内切酶位点，用内切酶KpnI和SalI酶切分析，证实了gD基因的可靠性和完整性。同时构建了测序质粒pSKgDSB和pSKgDS，并用双脱氧终止法进行测序。将测序结果与国外的Rice毒株进行比较，发现Ea株gD基因核苷酸序列有多处点突变和一处插入突变，在编码氨基酸残基水平上也有差异。     

伪狂犬病病毒Ea株Us9基因的克隆与序列分析

对含伪狂犬病病毒Ea株BamH17片段的质粒pUC6.6进行亚克隆，构建了仅含Us9基因约0.6kb片段的重组质粒pSKMN0.6。双脱氧末端终止法进行双链测序，结果表明：Us9存在2种可能的同C-末端的编码形式，分别编码106或98个氨基酸残基，Us9基因与其下游的Us2(28K)基因之间存在约200bp的非转录区，将Ea株Us9基因序列同国外Rice株进行没源比较，发现二者在组成和结构上存在多处保守序列，尤其是潜在的酪氨酸磷酸化位点，C-端疏水性氨基酸以及由连续6个带正电荷的精氨酸残基组成的核定位信号序列，但在N-糖基化位点以及丝氨酸含量上存在较大差异。     

鸡马立克火鸡疱疹病毒（FC—126株）的标准化研究：I.Fc—126株的纯化…

用于预防鸡马立克氏病（ＭＤ）的火鸡疱疹病毒（ＨＶＴ）Ｆｃ－１２６株细胞培养低代毒经过一日龄ＳＰ雏鸡体连续回传五代，于最后一代回收病毒后，超声波裂解释病毒，接种在鸡胚成纤维细胞（ＣＥＦ）上，挑选蚀斑纯化的克隆株。经过三代克隆纯化后，最后挑选出２３个蚀斑克隆株，３个中蚀斑克隆株和５个小蚀斑克隆株。对部分克隆株和其原始ＨＶＴＦｃ－１２６株在细胞中增殖速度和免疫原性进行了比较，初步筛选出大斑克隆株（３３０     

山羊痘病毒贵州分离株P32基因的克隆及序列分析

山羊痘(goat pox)是由羊痘病毒属(capripox-virus)山羊痘病毒(goat poxvirus,GPV)引起的一种主要危害山羊的高度接触性传染病[1]。本试验应用PCR技术,从山羊痘病毒DNA中扩增P32基因,通过pMD18-T克隆载体转化到DH5α工程菌中,并进行重组质粒的鉴定,旨在探索山羊痘病毒贵州株与国     

传染性支气管炎病毒疫苗株H52的全基因组克隆与分析

采用RT-PCR方法克隆测定传染性支气管炎病毒（Infections Bronchitis Virus,IBV）疫苗株H52全基因组序列,并与其它已知全基因组序列的我国分离株进行比较分析,以分析我国IBV地方分离株与疫苗株的分子遗传关系。结果表明,H52基因组全长为27630bp（不包括polyA）,A＋T含量为61．8％,它与我国IBV分离株全基因组同源性在83．9％～95．2％之间,其中与KQ6的同源性最高（95．2％）,与其余株均在88％以下。在基因组内基因的同源性中,以S1、S2与E变异最大,除KQ6外,其余各株（含台湾株）与H52在S1蛋白上的同源性只有72．4％～80．7％,在S2蛋白上的同源性为85．5％～88．1％,E蛋白为82．9％～93．3％。系统进化分析表明,国内分离株,除KQ6外,在进化分支中已独立于H52和其它Massachusetts型衍生毒株。H52与我国地方分离株存在较大的分子遗传差异,这些差异可能导致单纯Massachusetts型疫苗（如H120,H52）不能有效地免疫保护我国的鸡群。     

狂犬病病毒CTN株糖蛋白基因的克隆与序列分析

克隆分离自我国狂犬病病毒固定毒CTN株糖蛋白基因,分析它的主要功能位点表明它具有319位的糖基化位点和完整的抗原位点,说明其具有用作疫苗株的潜力。并与国内外疫苗株、我国的3株街毒株、CVS株和Mokola毒株进行了同源性分析,表明我国疫苗株和CVS株与我国的街毒株相距最远,而CTN株与我国的3株街毒株相距最近,同属一个分支。     

柔嫩艾美耳球虫(E.tenella)杂交株F2 SO7基因ORF的克隆与表达

用反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)技术,从柔嫩艾美耳球虫(E.tenella)杂交株F2[F1(JL×HB)×SD]的总RNA中扩增了651 bp的SO7基因ORF。通过T-A克隆技术,将PCR产物克隆至pMD18-T中,转化至受体菌DH5α中,经PCR及酶切鉴定确定阳性克隆pMD18-T-SO7,然后进行序列测定及分析确定成功克隆SO7基因ORF。经DNAStar软件分析核苷酸和氨基酸序列,结果显示扩增出了完整的SO7开放阅读框架,含651个核苷酸,富含AGC重复序列,编码216个氨基酸。与国外株SO7比较,核苷酸序列的同源性为97.7%,有15个核苷酸发生突变,其中9个为有义突变,氨基酸序列的同源性为94.9%。将获得的重组阳性克隆质粒pMD18-T-SO7与融合型表达载体pGEX-6p-1均以BamH I和EcoR I双酶切后。进行连接转化与克隆鉴定。将阳性克隆pGEX-6p-SO7转化至感受态E.coli BL21(DE3)中,经IPTG诱导和SDS-PAGE分析,可见约43.8 Ku融合蛋白带。Western blot分析发现,该蛋白具有E-tenella抗原性,从而为进一步研制E.tenella杂交株F2基因工程疫苗奠定了基础。     

新城疫病Ｅ4株Ｆ基因的克隆与术核苷酸序列分析

本试验采有ＲＴ－ＰＣＲ方法对ＮＤＶ Ｖ４克隆株Ｖ４（Ｈr）的Ｆ基因进行了扩增与克 隆,并以Ｓanger　’s双脱氧末端终止法测定出其核苷酸序列,推出氨基酸序列。Ｆ基因全长为１６６２bp,单一的开放阅读编码５５３个氨基酸的长肽。Ｆ蛋白的疏水构型有３个强疏水区;Ｆ蛋白上共有１２个Ｃys残基位点和５个潜在糖基化位点。同其亲本毒株Ｑueensland相比,核苷酸同源率为９９．３％,氨基酸同源率９８．７％。上述主要功能区的序列