鸡Muslin cDNA克隆与序列分析

基于电子延伸序列,本试验克隆并分析了鸡Muslin基因。肌肉组织提取总RNA,利用设计的引物进行RT-PCR,PCR产物与pMD19-T连接后转化E.coliDH5α,检测阳性克隆并测序;克隆的Musclin基因与人、大鼠、小鼠同源性分别为74%,73%,70%,推测的氨基酸序列同源性分别为58%,54%,50%,氨基酸序列含有"KKKR"结构和与小鼠ANP,BNP,CNP蛋白的同源性区域。试验成功克隆了鸡Musclin基因并注册GenBank(EF551041)。     

CD147基因在家兔肠道的克隆与结构预测

基于电子延伸序列,克隆并分析兔CD147基因.采用兔十二指肠黏膜组织提取总RNA,进行RT-PCR反应,测序并进行结构预测.克隆的兔CD147基因包含一个完整的开放阅读框架,全长为810 bp,编码由270个氨基酸残基组成的CD147前体蛋白,推导的氨基酸序列信号肽为1～16个氨基酸.氨基酸序列与牛、人、褐鼠、野猪的同源性分别为62.5%,65.9%,59.5%和66.3%,三级结构预测表明CD147具有2个免疫球蛋白类似区.试验成功克隆了兔CD147基因,注册到GenBank(Accession.EU650668),并预测其三级结构,为进一步研究其生物学功能奠定基础.     

绵羊Gastorkine-1基因的克隆与序列分析

基于电子延伸序列,克隆并分析了绵羊Gastorkine-1基因。提取皱胃黏膜组织总RNA,利用设计的引物进行RT-PCR,PCR产物与pMD19-T载体连接后转化E.coliJM109感受态细胞,检测阳性克隆并测序。克隆的绵羊Gas-torkine-1基因长619 bp,编码185个氨基酸,与人、小鼠、猪、牛的同源性分别为82.0%,48.8%,85.4%,96.9%,推测的氨基酸序列信号肽为1~20 aa,BRICHOS结构域为54~150 aa,结构特征与人、小鼠、猪、牛的Gastorkine-1相一致。     

花生Clp蛋白酶基因(AhClpP)的克隆与序列分析

Clp蛋白酶通过蛋白质水解作用来清除细胞内由逆境引起的异常和具有潜在毒性的蛋白或多肽,从而保证细胞正常的生理功能。从优质大花生鲁花14种子不同发育时期混合cDNA文库中发现一条序列,全长为1 212 bp,3′端含有polyA尾,通过blastx搜索得知其为Clp蛋白酶基因。该序列与GenBank中EZ736390.1的序列相似性达到99%。以该花生cDNA序列为模板设计引物,以花生幼嫩种子cDNA为模板克隆得到花生Clp蛋白酶基因。序列分析表明,AhClpP基因的开放阅读框长度为843 bp,编码280个氨基酸,预测其分子量为30.9 kDa,等电点为9.07,编码的蛋白包含S14-ClpP-2保守结构域,无信号肽,定位于线粒体。通过与其他植物Clp蛋白酶的氨基酸序列比对,发现与拟南芥、蓖麻的Clp蛋白酶同源性较高。花生AhClpP基因的克隆为进一步研究其生物学功能和应用奠定了基础。     

牦牛MSTN基因分子克隆及序列分析

设计特定引物对牦牛MSTN基因PCR分段扩增并克隆和测序,利用分子生物学软件进行序列拼接,获得牦牛MSTN基因序列(GenBank登录号EU926670).该基因由3个外显子和2个内含子组成,CDS序列全长为1 128 bp(GenBank登录号EU926671),由375个氨基酸组成.外显子大小分别为373,374,381 bp,内含子大小分别为1 843,2 028 bp.牦牛与普通牛的MSTN基因编码区中,在417位发生一次碱基转换(C→T),但未造成氨基酸改变.不同物种间在该基因编码区核苷酸序列和氨基酸序列上有较高的相似性,牦牛与普通牛、绵羊、猪、人、狗、小鼠、马、兔子、鸡、猩猩各物种间核苷酸相似性大小分别为99.9％,96.5％,94.3％,89.1％,91.9％,91.3％,93.6％,91.7％,82.0％,92.0％.牦牛与普通牛MSTN氨基酸序列相似性最高,为100％;而与绵羊、猪、小鼠、人、狗、马、兔子、鸡、猩猩各物种间相似性大小分别为93.3％,95.5％,92.5％,94.1％,93.3％,94.9％,94.4％,88.0％,94.4％.生物信息学软件分析发现:牦牛MSTN基因编码蛋白的理论分子量约为42.6 kDa,PI值为6.14,Leu的含量最高(9.9％),其次是Lys(7.2％).牦牛MSTN基因编码蛋白二级结构以β折叠为主,属于跨膜蛋白,跨膜区位于AA6-AA23之间;具有一个分泌信号肽结构,其氨基酸序列MQKLQICVYIYLFMLIVA具有TGF-β家族的特征.     

鸡IL-2基因的克隆、序列分析及蛋白结构预测

根据GenBank中已发表的鸡白细胞介素2 (IL-2)mRNA基因序列,利用Premier 5.0软件设计一对特异性引物,采用RT-PCR技术,以ConA刺激的鸡外周血淋巴细胞为材料,从总RNA中扩增出鸡IL-2基因。经琼脂糖凝胶电泳显示扩增片段约为432 bp,分离纯化片段,克隆入pMD-18T载体,转化DH5α感受态细胞,获得阳性重组质粒,经酶切鉴定,测序结果显示,我们得到了长432bp的基因,含有一个 432bp的开放阅读框,编码143个氨基酸。生物软件分析结果表明该序列与GenBank中发表的鸡的IL-2的核苷酸序列同源性为98.8%,与黄牛、马、鸡、绵羊、牛、犬、人、山羊、鼠、水牛的核苷酸同源性分别为31.2%、28.2%、27.3%、30.6%、26.2%、31.7%、30.1%、30.8%、26.6%、30.6%。与GenBank中发表的鸡IL-2编码的氨基酸序列同源性为95.8%,与上述动物的氨基酸序列同源性分别为7.6%、7.6%、9.7%、7.6%、6.9%、10.4%、11.8%、7.6%、9.0%、7.6%、10.4% 。这表明鸡的IL-2基因被成功克隆,它存在着种属特异性。这为进一步研究该基因的生物学作用特别是利用IL-2增强DNA疫苗的免疫效果奠定了基础。     

鸡粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)基因的克隆及生物信息学分析

为了解GM-CSF的基因及蛋白质特性,本研究以pUC-GM-CSF为模板,根据GenBank中登录的GM-CSF序列设计引物扩增GM-CSF基因,随后将其克隆至 pMD18-T载体,并对鉴定正确的重组质粒 pT-GM-CSF进行测序分析,然后对GM-CSF基因进行同源性分析、ORF分析、氨基酸序列分析、疏水性分析、磷酸化位点预测、亚细胞定位分析及二级结构预测。结果表明：该基因ORF的全部长度为453 bp,能够编码150个氨基酸,并且在GM-CSF基因所编码的蛋白质中有4个丝氨酸和3个苏氨酸可能成为蛋白激酶磷酸化的位点。同时,GM-CSF蛋白的最大疏水性为2.267,且有8.91%的可能位于细胞外,有0.8%的可能位于细胞壁,有0.24%的可能位于细胞质。同时,该蛋白质的二级结构主要由无规卷曲、α螺旋和延伸链构成。本研究通过对GM-CSF基因进行生物信息学分析,为探究其免疫增强机制奠定基础。     

莲多酚氧化酶基因的克隆及序列分析

多酚氧化酶是一类普遍存在于植物、真菌、昆虫的质体中,由核基因编码能与铜相结合的金属蛋白酶。它是许多果蔬等农产品酶促褐变的主因,也在植物的光合作用、抗病虫害、生长发育以及花色的形成中起一定作用。用RT—PCR方法,从中国莲（Nelumbo nucifera）幼叶RNA中成功扩增出ppo的部分序列,经克隆测序,得到长度在978-1057bp的序列共7个,编码326～352个氨基酸。与其他物种PPO进行比较,其核苷酸序列相似性为83％-85％,氨基酸序列相似性为84％99％。莲ppo的成功克隆为抑制莲藕的酶促褐变,提高莲的抗虫抗病性等的研究打下了良好的基础。     

青花菜BoMYB基因的克隆与序列分析

通过培养青花菜幼苗并提取DNA,以所得DNA为模板克隆青花菜MYB基因,并对该基因进行测序。测序后,利用生物信息学手段进行序列分析,包括寻找同源序列、同源序列蛋白质翻译比对、分析翻译所得蛋白质的理化性质和二级结构,预测结构域和构建系统发育树。从青花菜中克隆得到的BoMYB基因,其编码263个氨基酸,蛋白序列中具有2个SANT结构域。对比在拟南芥中的研究推测,该基因可能在渗透胁迫响应中起作用。系统发育分析结果表明,BoMYB与欧洲油菜的MYB聚为一组,它们与拟南芥的MYB处于不同分支。对BoMYB基因的克隆与序列进行分析,为探究青花菜MYB基因的表达、功能及抗逆机理研究奠定了基础。     

单核细胞增生李斯特菌新疆野毒株XS5 SigmaB操纵子的克隆、序列分析及其编码蛋白结构预测

为了解单核细胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes LM.)新疆野毒株XS5 SigmaB操纵子的分子生物学特征。对LM-XS5的SigmaB操纵子部分基因序列进行了克隆与序列分析,预测该操纵子各基因编码蛋白质的二三级结构及功能活性位点,分析其同源性。结果表明：成功扩增出3000 bp的SigmaB操纵子片段,序列分析显示该片段中包含RsbV、RsbW、RsbX和SigmaB 4个基因,它们编码的蛋白质含有不同的功能活性位点,其中RsbV的5~102位AA为“STAS-抗-抗-SigamB因子”,RsbW的43~157位AA间为HATPase_c功能域,RsbX的32~198位AA间为PP2Cc超家族区域,SigmaB的8~264位AA为RNA聚合酶全酶中的SigmaB因子的区域。LM-XS5与其他3种革兰氏阳性菌的SigmaB基因的同源率在50%左右,与LM参考株的同源率在92.18%~100%之间。     

猪嵴病毒CH441株VP1基因的克隆与序列分析

为了深入研究嵴病毒(sw Ko V)主要结构蛋白基因VP1,根据Gen Bank中已发表的猪嵴病基因序列设计特异性引物,采用RT-PCR方法扩增猪嵴病毒CH441株VP1基因,并对其进行克隆与测序分析。结果表明,sw Ko V CH441株的VP1基因为762 bp,与Gen Bank已发表的嵴病毒属的15株嵴病毒序列的VP1基因相比较,sw Ko V CH441株的VP1基因与其他各毒株VP1基因的核苷酸同源性为81.5%~90.2%,氨基酸同源性为86.6%~96.9%,进化分析显示,sw Ko V CH441株与GS-1株之间的亲缘关系较近。生物信息学分析显示,VP1蛋白理论等电点(p I)为4.40,理论分子质量为26.978 2 k Da;其序列上共发现18个磷酸化位点,分别为Ser(7)、Thr(6)和Tyr(5),而蛋白的磷酸化与信号转导有关,预测该蛋白为一重要的信号转导分子;无信号肽和跨膜区。为进一步开展sw Ko V CH441株VP1基因在遗传变异等方面的研究奠定了理论基础。     

鸡白细胞介素2的克隆及其序列分析

旨在从分子生物学角度进一步研究鸡免疫刺激因子白细胞介素2(IL-2),探究IL-2蛋白结构。根据GenBank发表的IL-2序列设计引物扩增IL-2基因,将其克隆到p GM-T载体后进行鉴定,鉴定正确的pT-IL-2重组质粒,然后对其进行序列分析。应用生物信息学软件对IL-2序列进行跨膜区、磷酸化位点、氨基酸序列、开放阅读框进行分析和IL-2蛋白的三级结构进行预测。核苷酸序列测定结果表明:IL-2基因片段为430 bp,编码143个氨基酸。生物信息学分析结果表明:本实验获得的IL-2基因编码的蛋白质中含有1个丝氨酸和3个苏氨酸,这可能成为蛋白激酶磷酸化的位点。IL-2蛋白可能在5~28位含有跨膜区。其蛋白二级、三级结构预测结果显示其属于亲水性蛋白,多为α-螺旋、β-转角和N端无规卷曲结构。该结果为IL-2的分子生物学探究奠定了基础。     

西藏青稞LEA3蛋白新抗旱基因的克隆与序列分析

以强抗旱青稞冬青8号和弱抗旱青稞品比14为材料,将幼苗经干旱诱导处理12 h提取总RNA,RT-PCR同源克隆到2个有差异的LEA3蛋白抗旱基因的全编码框序列。冬青8号、品比14的LEA3蛋白基因序列全长分别为661 bp和694 bp,其中,来源于品比14的LEA3蛋白基因编码框全长639 bp,编码含213个氨基酸残基的蛋白质,该多肽含有9个重复的、由11个氨基酸残基组成的保守基元序列。而来源冬青8号的LEA3蛋白基因与之相比较除缺少33 bp核苷酸外,另有6个碱基的差异,所编码的蛋白质也相应地缺少第4个保守基元序列,由8个重复的保守基元序列组成。二者在DNA与氨基酸序列上的同源性分别为94.38%和92.02%。结果证实抗旱性不同的青稞品种之间LEA3抗旱蛋白保守基元拷贝数有差异,推测抗旱蛋白结构的差异可能对植物的抗旱性有影响。     

玫瑰黄链霉菌Men-myco-93-63负调控基因nsdAmgh的克隆及序列分析

nsdA (Negative regulator of Streptomyces differentiation)基因是天蓝色链霉菌中发现的与抗生素合成相关的负调控基因.根据天蓝色链霉菌 A3(2)的序列设计引物扩增玫瑰黄链霉菌 Men-myco-93-63 菌株中的该基因,经测序和序列分析表明,由保守序列引物nsdA-2R和nsdA-2L克隆到的Men-myco-93-63 菌株中的该基因 800 bp片段与已知nsdA基因核苷酸保守区域序列同源性达到99%,由全长序列扩增引物nsdA WZ-R和nsdA WZ-L克隆到的该基因包含一个完整的开放阅读框,共编码 369 个氨基酸,与变铅青链霉菌和天蓝色链霉菌A3(2)中的nsdA 基因的核苷酸序列同源性达到100%,氨基酸序列同源性达到99%.该全长基因命名为nsdA_(mgh),其在玫瑰黄链霉菌 Men-myco-93-63 中的发现为阻断该负调控基因以期获得抗生素高产工程菌株提供了重要依据.     

传染性喉气管炎病毒河南株ILTV-CG GX基因的克隆与序列分析

根据GenBank中收录的鸡传染性喉气管炎病毒(ILTV)GX基因核苷酸序列,设计并合成了1对引物,应用PCR技术扩增ILTV河南株(ILTV-CG)GX基因。将ILTV-CG接种10日龄鸡胚,提取ILTV基因组DNA进行PCR扩增。将回收的PCR产物与pGEM-T Easy载体进行连接,转化JM109感受态细胞,经蓝白斑筛选,对菌液PCR和酶切鉴定为阳性的菌株进行测序。测序结果表明,所克隆的GX基因全长为950 bp,含有一个开放阅读框,编码299个氨基酸的多肽。推导的氨基酸有4个潜在的N-糖基化位点,有11个与二硫键形成有关的半胱氨酸。序列分析表明,克隆的ILTV-CGGX基因与GenBank中发表的ILTV-SA2株GX基因核苷酸同源性为97.2%,变异点为第124位插入1个碱基G,第136位又插入2个碱基C,从而引起该毒株GX基因推导的氨基酸序列在第33位插入1个亮氨酸,还存在多处氨基酸发生变化,氨基酸同源性为95.3%。GX基因的成功克隆为构建ILTVGX基因缺失的病毒活载体奠定基础。     

茄子SmWRKY1转录因子基因克隆及序列分析

克隆茄子转录因子SmWRKY1基因,对其序列进行分析,为SmWRKY1基因在茄子抗逆分子育种的应用中提供理论依据。以茄子幼苗为试材,依据GenBank上已提交的番茄、甜椒、烟草的WRKY基因序列设计引物,提取总RNA利用RT-PCR方法扩增得到基因片段,克隆、测序并通过NCBI在线和DNAMAN等软件对其核酸及氨基酸序列进行分析。同源克隆得到SmWRKY1,核酸序列930 bp,翻译为310个氨基酸组成的蛋白序列,其中Ser和Thr量最多,分别占总氨基酸数的12.0%和11.0%。NCBI检索SmWRKY1属于WRKY基因超家族,第114至120个氨基酸含有WRKY保守结构域“WRKYGQK”,其锌指结构为C2H2型,初步证实SmWRKY1属于第二大类WRKY转录因子。DNAMAN构建茄子SmWRKY1与不同植物WRKY蛋白的系统发育树,表明茄子WRKY1与番茄中的WRKY1蛋白亲缘关系最近,同源性达96%。WRKY基因在植物耐逆性的研究中有着重要的作用,通过克隆出SmWRKY1基因片段,为进一步克隆其全长、研究其功能做前期准备,为分子育种、培育茄子耐逆性新品种奠定了一定的基础。     

莲膨胀素基因的克隆及其序列分析

膨胀素是一类存在于植物细胞壁上,并能快速缓冲张力,使植物细胞壁松驰的蛋白质。以中国莲幼叶总RNA反转录所得的cDNA为模板,设计简并引物,用PCR方法成功扩增出expansin部分序列,经克隆测序,得到长度在531-532bp的序列共3个,编码177个氨基酸,而且均存在expansin的保守区域。与其它物种,如杂交杨树、烟草、杂交葡萄、野马铃薯、樱桃等物种的expansin相比,核苷酸相似性为84％-85％,氨基酸序列相似性为86%-99％。莲expansin的成功克隆为研究莲的生长发育以及莲品种的改良等打下了良好的基础。