白颖苔草热激转录因子基因的克隆及其序列分析

白颖苔草(Carex rigescens(Franch.)V.Krecz.)的热激转录因子基因是重要的耐热候选基因。通过序列多重比对设计简并引物,扩增出白颖苔草的热击转录因子基因cDNA的中间片断,并在此基础上利用RACE技术得到3′端cDNA片段和5′端cDNA片段。结果表明:通过序列拼接获得该基因的全长cDNA(1226bp),命名为CrHSF。序列分析表明其含有一个完整的开放阅读框(103～1023bp),编码蛋白质含有306个氨基酸,分子量为38.75kDa,等电点为5.85。CrHSF的氨基酸序列与OsHSF的同源性为59%,与已知的其他热激转录因子也具有较高的同源性。在CrHSF的氨基酸序列中没有预测到信号肽以及跨膜区域,但是具有多种翻译后修饰的加工位点。     

MADS-box基因家族在蒺藜苜蓿的全基因组分析

MADS-box基因家族是植物体内的重要转录因子,它们广泛地调控着植物生长、发育和生殖等过程。本研究以蒺藜苜蓿基因组数据为材料,采用结构域搜索方法,鉴定了138个MADS-box基因。通过序列比对系统进化分析,将它们分成两大类:Ⅰ型(92个)和Ⅱ型(46个)。同时,通过染色体定位分析发现,134个MADS-box基因定位在染色体上,还有4个MADS-box基因定位在尚未完成最终拼接的超长片段上。蒺藜苜蓿的MADS-box基因家族成员之间存在大量的基因重复,特别是Ⅰ型MADS-box基因,通过基因复制,MADS-box基因家族在染色体上形成多个密集的MADS-box基因簇。对蒺藜苜蓿的RNA-seq表达谱数据分析,发现MADS-box基因在心皮组织、花器官等组织中表达量较高,这表明蒺藜苜蓿的MADS-box基因家族广泛地参与苜蓿组织分化、发育以及生殖等过程的调控,这将为进一步揭示MADS-box类转录因子在蒺藜苜蓿中作用机制提供了重要的参考。     

羊草LcMADS12基因的克隆及原核表达分析

显花植物中,E类MADS-box基因在调控花分化及花器官发育过程中发挥重要作用。为初步了解羊草花发育的分子机制,依据实验室前期雌蕊转录组数据,以羊草花序cDNA为模板,克隆获得了一个MADS-box基因, 命名为LcMADS12。LcMADS12基因的开放阅读框全长为741 bp,编码246个氨基酸。生物信息学显示,LcMADS12基因编码氨基酸序列中无信号肽,不存在跨膜区。多重序列比对及功能结构域分析表明,LcMADS12具有保守的MADS-box结构域和半保守的K区,属于E类功能基因SEP亚家族成员。系统进化分析表明LcMADS12与小麦TaAGL16同源性为99%,与水稻基因OsMADS7同源性为86%。组织表达模式分析表明,LcMADS12基因在羊草营养器官中不表达;而在成熟雄蕊、雌蕊、内稃中表达较高,在外稃中低表达,说明LcMADS12基因的表达具有组织特异性。推测LcMADS12基因可能在羊草生殖发育过程中发挥重要作用。酵母单杂交实验及原核表达结果表明LcMADS12蛋白具有转录激活活性,且获得融合蛋白高效表达体系。LcMADS12 基因的克隆和融合蛋白的获得为深入开展该基因功能研究奠定了基础。     

垂穗披碱草MADS-box基因WM8克隆及分析

通过同源克隆从垂穗披碱草中获得了MADS-box基因家族WM8基因的全长cDNA序列,命名为 EnWM8(Genbank登录号为 JF683846)。序列分析表明,该cDNA全长1 196 bp,开放阅读框共编码275个氨基酸,具有典型的MADS-box结构域以及半保守的K区,是MIKC型MADS-box基因,分析认为其与花发育和果实成熟等有关。EnWM8与小麦的WM8、AGL29和fruitful-like基因氨基酸的推导序列的相似性分别高达95.62%,96.72%和96.28%。采用DNAMAN 软件进行系统进化树分析显示,EnWM8基因与小麦的TaWM8进化关系最近,与拟南芥的AtWM8、AtAGL29进化关系较远。垂穗披碱草WM8蛋白分子量为13 726.7 Da,理论等电点为9.14,为亲水性的碱性蛋白,无跨膜结构域,定位于细胞核中,其空间结构主要由α-螺旋、无规则卷曲和延伸链构成。研究结果可为进一步从分子水平探明垂穗披碱草花发育、种子成熟等机制提供参考。     

不同源性大肠杆菌多药耐药基因AcrA、AcrB部分基因的同源性分析

通过聚合聚链式反应从不同源性大肠杆菌的染色体DNA上扩增出大肠杆菌多药耐药基因AcrA,AcrB的部分片段，将该片段分别连接到克隆载体pMD-18T的BamHI,XhoI酶切位点中，测定插入片段的核苷酸序列，并分别推导出其氨基酸序列。序列分析表明，不同源性大肠杆菌的AcrA的部分基因的核苷酸序列及所推导的氨基酸序列与GeneBank中该基因序列的同源性较高；不同源性大肠杆菌的AcrB的部分基因的核苷酸序列的同源性较低。所推导的氨基酸序列与GeneBank中该基因序列的同源性较高。     

吕氏泰勒虫主要表面蛋白P32基因的克隆与序列分析

从吕氏泰勒虫宁县株中提取RNA,用RT-PCR方法扩增主要表面蛋白P32基因的cDNA片段,克隆后测定其核苷酸序列,并推导了相应的氨基酸序列。结果表明,扩增的P32基因长度为875个核苷酸,共编码284个氨基酸。核苷酸序列与已发表的牛的4种泰勒虫的主要表面蛋白基因相比较,其与瑟氏泰勒虫俄罗斯株、日本株、中国辽阳株的核苷酸和氨基酸序列相似性均在98.9%以上。其推导的氨基酸序列中有3个糖基化位点。     

半胱亚磺酸脱羧酶(CSD)基因在大鼠睾丸组织中的表达及其序列分析

试验根据大鼠肝脏牛磺酸生物合成关键酶——半胱亚磺酸脱羧酶(CSD)基因已知核苷酸序列,设计了1对特异的寡核苷酸引物,对提取的睾丸组织总RNA进行RT-PCR扩增,扩增出468 bp的DNA片段,在国际上首次证明CSD基因在大鼠睾丸组织中存在表达,即牛磺酸可在大鼠睾丸组织中生物合成。测定了扩增的睾丸组织CSD基因核苷酸序列,并与已知肝脏CSD基因核苷酸序列及其对应的氨基酸序列作了同源性分析。结果表明:睾丸组织CSD基因核苷酸序列同已知肝脏CSD基因核苷酸序列的同源性为99.8%,其对应氨基酸序列的同源性为100%。     

油茶SOD基因片段克隆及序列分析

摘要：根据已报道的多种植物Cu/Zn SOD和Mn/Fe SOD基因的氨基酸序列的保守区域分别设计简并引物,以油茶（Camellia oleifera）叶片总RNA为模板,通过RT PCR分别扩增得到一个375 bp的Cu/Zn SOD基因片段和一个429 bp的Mn/Fe SOD基因片段。将片段序列在NCBI网站上进行同源性比对,表明本研究克隆的结果均与多种植物的Cu/Zn SOD和Mn/Fe SOD基因存在亲缘关系,因而认为所克隆的基因片段就是油茶SOD基因;并运用DNAStar5.0软件分别进行序列分析,推导的氨基酸序列分别为125个残基和143个残基;具有所有植物SOD基因共有的保守区域;与多种植物Cu/Zn SOD基因的核苷酸和氨基酸序列的同源性均分别在80%和84%以上,与其他植物的Mn/Fe SOD基因的核苷酸和氨基酸序列的同源性都在84%和86%以上。     

SOC1调控植物开花时间的分子机制

SUPPRESSOR OF OVEREXPRESSION OF CO 1?(SOC1)编码MADS-box转录因子,具有诱导植物成花、防止花分生组织过早成熟和调控花器官发育的重要功能,是调控植物开花的整合因子.SOC1转录因子受蛋白或核酸调控,或与其他转录因子形成复合物进入细胞核,靶向特异开花基因从而调控植物开花,其调...     

猪轮状病毒GD株VP6基因的克隆及序列分析

参考GenBank中发表的PRV OSU毒株VP6基因核苷酸序列ORF两端保守区序列,设计1对特异引物,以PRV GD株反转录cDNA为模板,通过PCR方法扩增出长约1.4 kb的基因片段,并克隆到pMD18-T载体中进行序列测定。测序结果表明:VP6基因全长1320 bp,含有一个1194bp的开放阅读框,编码397个氨基酸。与国内外已知的11个毒株VP6基因的核苷酸及其推导的氨基酸序列比较,同源性分别为76.5%-95.6%和88.7%-99.2%;核苷酸系统发育进化树结果表明,GD毒株与轮状病毒JL94,CN86,OSU毒株亲缘关系较近,为一个进化群。     

山羊MMP-9基因cDNA的克隆及生物信息学分析

为了克隆山羊基质金属蛋白酶-9(MMP-9)基因的cDNA片段,分析其基因序列,试验于无菌条件下采集泌乳期奶山羊乳腺组织并提取总RNA。根据已知其他物种的MMP-9基因保守性区域设计特异性引物,采用RT-PCR方法扩增MMP-9基因的CDS区,测序后对核苷酸和推导的氨基酸序列进行分析,并对8个物种进行聚类分析。结果表明:得到长度为2 245 bp的MMP-9基因cD-NA片段(GenBank登录号为JQ670877),其中包含2 130 bp的CDS全长;核酸序列分析结果显示,该基因编码709个氨基酸,与人、小鼠和牛的核苷酸序列进行比对,相似性分别为84%、80%、96%,氨基酸相似性分别为79%、73%、94%。     

猪轮状病毒GD1株VP7基因的克隆及序列分析

参考GenBank中发表的PRV OSU毒株VP7基因核苷酸序列ORF两端保守区序列,设计1对特异引物,以PRV GD1株反转录cDNA为模板,通过PCR方法扩增出长约1 kb的基因片段,并克隆到pMD18-T载体中进行序列测定。测序结果表明:VP7基因全长1 062 bp,含有一个981 bp的开放阅读框,编码326个氨基酸。与国内外已知的13个毒株VP7全长基因的核苷酸及推导的氨基酸序列比较,相似性分别为77.4%～100%和78.6%～99.7%;核苷酸系统发育进化树结果表明,GD1毒株与轮状病毒A2,JP3-6毒株亲缘关系较近,为一个进化群。     

家蚕转录因子AP-4基因cDNA的分子克隆与生物信息学分析

AP-4(activator protein 4)是一种转录因子,在生物的生长发育中有重要作用。根据家蚕表达序列标签(EST)并利用cDNA末端快速扩增(RACE)方法克隆了家蚕AP-4(Bombyx mori activator protein4)基因,结合生物信息学方法对所获的序列进行开放阅读框、序列同源性分析,预测了AP-4蛋白的理化性质。获得的家蚕AP-4基因cDNA的全长为1621bp,其开放阅读框为996bp,编码331个氨基酸,基因由3个外显子和2个内含子组成。同源性比对表明该基因推导的氨基酸序列与棉铃虫AP-4和谷蛀虫AP-4推测的蛋白同源性分别为76%和54%,第45-99位氨基酸序列是一个典型的保守结构域。实时定量RT-PCR显示该基因在所检测家蚕的各发育时期中,除幼虫1龄和蛹期第4天无表达外,其它时期均有表达,其中幼虫3龄和4龄期的表达量较高。     

猪链球菌9型钦州分离株cps9H基因序列分析

根据已发表的猪链球菌9型(SS9)荷兰5218分离株的基因核苷酸序列保守区域,设计一对特异性引物,以SS9钦州分离株抽提的DNA为模板,通过PCR方法扩增cps9H基因片段,并对其进行克隆、测序和分析。结果表明,4株SS9钦州分离株的cps9H目的基因长为389 bp,与已知的7个国内外SS9毒株cps9H基因片段的核苷酸及推导的氨基酸序列比较,同源性分别为96.7%~100%和91.5%~100%。     

鹅p21基因克隆、启动子分析及转录调控研究

【目的】 分析鹅p21基因的结构和启动子活性，探讨p21基因的转录调控机制。【方法】 以泰州鹅为试验对象，通过同源克隆、RACE和生物信息学分析等方法获得鹅p21基因全长序列和5′-侧翼区序列特征；构建6个不同缺失片段的启动子区双荧光素酶报告载体并分析其荧光素酶活性，进而确定p21基因核心启动子区；对核心启动子区转录因子结合位点生肌决定因子(MyoD)(+25~+36 bp)进行定点突变，并构建突变报告基因载体，在C2C12细胞系内初步鉴定鹅p21基因核心转录调控因子。【结果】 鹅p21基因cDNA全长1 943 bp，CDS区大小为453 bp，编码151个氨基酸，蛋白序列包含高度保守的CDI家族结合位点。系统进化树分析表明，鹅p21基因与鸭亲缘关系最近，与鸡和火鸡有较强的进化关系。鹅p21基因5′-侧翼区包含启动子元件，—35~+37 bp是核心启动子区，发挥正向调控作用，结合定点突变技术初步鉴定MyoD是鹅p21基因核心转录调控元件。【结论】 本研究获得了鹅p21基因完整的cDNA序列和启动子区域，MyoD是p21基因核心转录调控因子，为探究p21基因在鹅胚胎期肌肉发育过程中的调控机制提供理论依据。     

Ⅰ群禽腺病毒4型陕西分离株33K、Fiber-1、Fiber-2、pⅢa基因的克隆及序列分析

为明确Ⅰ群禽腺病毒陕西分离株相关基因的特征,通过聚合酶链反应(PCR)技术分别扩增了禽腺病毒陕西分离株SX17株的4个基因片段,即33K、Fiber-1、Fiber-2、pⅢa,将其分别克隆到pCold-SUMO载体后进行序列测定,并将克隆得到的4个基因片段与发表的相应序列进行序列比对及遗传进化分析。结果表明,克隆得到的4个片段与Ⅰ群禽腺病毒4型同源性最高,33K基因核苷酸及推导的氨基酸同源性在99.3%~100%与91.5%~100%之间,Fiber-1基因核苷酸及推导的氨基酸同源性在98.5%~100%与65.9%~100%之间,Fiber-2基因核苷酸及推导的氨基酸同源性在98.1%~100%与99.3%~100%之间,pⅢa基因核苷酸及推导的氨基酸同源性在98.6%~100%与98.5%~100%之间。由遗传进化树可知,这些基因在遗传关系上与血清4型位于同一分支,亲缘关系最近,分析显示陕西分离株为Ⅰ群禽腺病毒血清4型。     

版纳微型猪近交系VEGF基因克隆及其组织中转录水平的检测

为克隆版纳微型猪近交系血管内皮生长因子(VEGF)基因并检测该基因在各组织中的转录水平,本研究提取版纳微型猪近交系18种组织RNA,利用RT-PCR方法扩增VEGF基因编码区全长序列,进行克隆测序。利用VEGF基因序列的推导氨基酸序列与牛等8个物种的VEGF氨基酸序列构建物种系统进化树,同时采用半定量RT-PCR方法分析VEGF基因在版纳微型猪近交系18种组织中的转录水平。结果显示,版纳微型猪近交系VEGF基因编码区全长573 bp,编码190个氨基酸。氨基酸序列同源性分析表明,与牛等8个物种具有90%以上的相似性,分子系统进化表明其序列与人的关系最近,其次为牛、羊和兔。多组织半定量RT-PCR研究表明VEGF mRNA在版纳微型猪近交系的18个组织中均有转录水平的表达,其中在卵巢、脾脏、心脏、肺脏及皮肤中表达量较高,其他组织中表达量略低。     

狮头鹅α-干扰素基因的克隆与遗传分析

从狮头鹅外周血细胞中提取基因组DNA,采用巢式PCR方法扩增α-干扰素基因片段（d-Go-IFN-α）;同时从新城疫病毒（NDV）刺激培养外周血淋巴细胞提取总RNA,用RT-PCR方法扩增α-干扰素基因片段（m-Go-IFN-α）,将上述扩增片段分别克隆到pGEM-T载体并进行序列测定。结果表明,α-干扰素基因全长均为576 bp,编码192个氨基酸,比较d-Go-IFN-α和m-Go-IFN-α的核苷酸序列,可见155位核苷酸由A突变为G,相应地52位氨基酸由M突变为R,提示狮头鹅α-干扰素基因存在单链核苷酸多态性;狮头鹅与其它家禽品种α-干扰素基因的核苷酸序列同源性介于41.2%~98.3%之间,其推导的氨基酸序列同源性为13.0％～96.4％,不同鹅品种的α-干扰素具有极为相似的二级结构。     

家蚕卵巢肿瘤基因Bmotu及其可变剪接

已知卵巢肿瘤基因(ovarian tumor gene,otu)在果蝇(Drosophila melanogaster)卵巢发育过程中发挥极其重要的作用,该基因突变会扰乱卵子形成的正常过程。为探究家蚕(Bombyx mori)是否具有类似果蝇生殖发育相关基因otu的同源基因,以及基因存在的可变剪接形式,在电子克隆的基础上,应用RT-PCR从家蚕精巢组织中获得了4条不同长度的Bmotu cDNA片段(GenBank登录号:HQ831341,HQ831342,HQ999998,HQ831343),其中3条由于无义突变导致翻译提前终止;而从卵巢组织中仅获得了1条Bmotu cDNA片段,该片段序列与精巢中扩增的登录号为HQ831343片段序列的5'端相同。结果表明Bmotu基因存在可变剪接,且雌、雄之间的剪接方式可能存在差异。生物信息学分析发现Bmotu基因编码蛋白与果蝇Otu的结构类似,含有半胱氨酸蛋白酶结构域(Otu结构域)、Tudor结构域、脯氨酸基序。研究结果有助于进一步探讨家蚕生殖发育机制。     

罗曼鸡胚脾细胞白介素-18基因的克隆与序列分析

根据国外已发表的鸡白细胞介素 18(IL- 18) c DNA基因序列设计了 1对特异性引物 ,应用 RT- PCR技术 ,从鸡新城疫 系病毒接种 4 8h左右的罗曼鸡胚脾细胞中扩增出鸡 IL - 18全基因 ,并进行了序列测定。结果表明 ,扩增片段全长 5 94 bp,共编码 198个氨基酸的前体蛋白 ,其中含有表达完整功能蛋白所必需的起始密码子和终止密码子。该序列与国外报道的鸡 IL - 18全基因核苷酸序列及推导的氨基酸序列的同源性分别为 99.8%和 10 0 % ;序列中编码成熟蛋白的这段基因与国内报道的源自白来航鸡编码 IL- 18成熟蛋白的基因核苷酸序列及推导的氨基酸序列的同源性分别为 99.8%和 99.4 %。本研究为鸡 IL - 18的扩增及其他细胞因子的扩增提供了一种简便易行的新方法 ,为进一步研究IL- 18基因的结构、功能、表达及表达产物的应用奠定了良好基础